Nghiên cứu bệnh do virus gây ra trên cá tầm (acipenser spp ) nuôi tại lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - - TRẦN VĂN ĐÁP NGHIÊN CỨU BỆNH DO VIRUS GÂY RA Ở CÁ TẦM (Acipenser spp.) NUÔI TẠI LÂM ĐỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - NĂM 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - - TRẦN VĂN ĐÁP NGHIÊN CỨU BỆNH DO VIRUS GÂY RA Ở CÁ TẦM (Acipenser spp.) NUÔI TẠI LÂM ĐỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 60620301 Quyết định giao đề tài: 386/QĐ-ĐHNT ngày 20/04/2017 Quyết định thành lập HĐ: 139/QĐ-ĐHNT ngày 28/02/2018 Ngày bảo vệ: 16/03/2018 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS HỨA NGỌC PHÚC TS LƢƠNG CƠNG TRUNG Chủ tịch Hội đồng: Phịng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HÒA - NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu luận văn thân tơi thực dƣới bảo tận tình chu đáo TS Hứa Ngọc Phúc, ThS Võ Thị Dung – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III TS Lƣơng Công Trung – Trƣờng Đại học Nha Trang hỗ trợ anh, chị thuộc Phịng Cơng nghệ sinh học Vắc xin thủy sản – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Các số liệu, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2018 Tác giả Trần Văn Đáp iii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nha Trang, Viện Ni Trồng Thuỷ Sản, Phịng đào tạo sau Đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạoViện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản III, tạo điều kiện thuận lợi thời gian, trang thiết bị, sở thí nghiệm thời gian thực đề tài Tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến dẫn tận tình, chu đáo giáo viên, cán hƣớng dẫn TS Hứa Ngọc Phúc, TS Lƣơng Công Trung Ths Võ Thị Dung giúp đỡ suốt trình thực luận văn phƣơng pháp nghiên cứu báo cáo khoa học Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, đóng góp ý kiến q báu anh, chị Phịng Cơng nghệ Sinh học Vắc xin thủy sản - Viện Nghiên cứu Ni trồng thủy sản III q trình thực luận văn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu thầy, cô giảng viên tham gia giảng dạy khố học Cuối cùng, tơi đƣợc bày tỏ tình cảm, lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln động viên khích lệ tinh thần cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành đề tài tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2018 Tác giả Trần Văn Đáp iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá tầm (Acipenser) 1.1.1 Đặc điểm phân loại, hình thái phân bố cá tầm 1.1.2 Đặc điểm sinh học cá tầm 1.2 Tình hình ni cá tầm giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình ni cá tầm giới 1.2.2 Tình hình ni cá tầm Việt Nam 1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh cá tầm 1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá tầm Thế giới 1.3.1.1 Bệnh nấm 1.3.1.2 Bệnh ký sinh trùng 11 1.3.1.3 Bệnh vi khuẩn 12 1.3.1.4 Bệnh virus 14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh cá tầm Việt Nam 16 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 19 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 19 2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 19 2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2 Dụng cụ 19 v 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp thu mẫu cá 20 2.5 Quan sát mô tả dấu hiệu bệnh lý 20 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu mô bệnh học 21 2.7 Phƣơng pháp xác định virus gây bệnh cá tầm PCR 22 2.8 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 26 CHƢƠNG : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Dấu hiệu bệnh lý mẫu cá tầm bệnh 27 3.1.1 Bệnh xuất huyết 27 3.1.2 Bệnh cong thân 27 3.1.3 Bệnh cá bơi quay, không định hƣớng 28 3.2 Virus gây bệnh cá tầm xác định phƣơng pháp mô học 29 3.2.1 Sự xuất virus mô não cá tầm mẫu 29 3.2.2 Sự xuất virus mô thận cá tầm mẫu 31 3.2.3 Sự xuất virus mô gan cá tầm mẫu 32 3.3 Virus xuất hiên cá tầm xác định phƣơng pháp PCR 33 3.3.1 Kết thử nghiệm PCR White Sturgeon Iridovirus (WSIV) 34 3.3.2 Kết thử nghiệm PCR White Sturgeon Herpesvirus (WSHV) 36 3.3.3 Kết thử nghiệm PCR Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHNV) 37 3.3.4 Kết thử nghiệm PCR Viral nervous necrosis Virus (VNN) 39 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Đề xuất ý kiến 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA: Deoxyribonucleic acid ĐK: Đƣờng kính KHCN: Khoa học cơng nghệ KST: Ký sinh trùng NC: Negative control NĐP: Nhiệt độ phòng NTTS: Nuôi trồng thủy sản PC: Positive control PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid TB: Trung bình TSBG: Tần số bắt gặp VK: Vi khuẩn bp: Base pair vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cá tầm Nga Hình 1.2 Cá tầm Siberi Hình 2.1 Bộ điện di Ex-Mupid 19 Hình 2.2 Máy NanoDrop 2000 19 Hình 2.3 Máy PCR 19 Hình 2.4 Bàn soi LMS-26 (UVP, Mỹ) 19 Hình 2.5 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20 Hình 2.6 Sơ đồ qui trình tách chiết DNA 23 Hình 2.7 Sơ đồ quy trình tách chiết RNA 24 Hình 2.8 Sơ đồ quy trình phản ứng PCR tác nhân virus cá tầm 25 Hình 2.9 Sơ đồ quy trình thực phản ứng chuyển đổi từ RNA sang cDNA 25 Hình 3.1 Cá tầm bị bệnh xuất huyết 27 Hình 3.2 Cá tầm bị bệnh cong thân 28 Hình 3.3 Cá tầm bị bệnh bơi quay, không định hƣớng 28 Hình 3.4 Mơ não cá khỏe chụp dƣới kính hiển vi điện tử 30 Hình 3.5 A - Mơ não cá tầm Nga giống bình thƣờng; B – Mơ não cá tầm Nga giống bơi không định hƣớng 30 Hình 3.6 Mơ não cá tầm xuất huyết, cong thân, bơi khơng định hƣớng 30 Hình 3.7 Mơ thận cá khỏe chụp dƣới kính hiển vi điện tử 31 Hình 3.8 A- Mô thận cá tầm Nga giống khỏe; B- Mô thận cá tầm Nga giống bị xuất huyết 31 Hình 3.9 Dấu hiệu mô cá tầm bị nhiễm virus Nodavirus 32 Hình 3.10 Mơ gan cá khỏe chụp dƣới kính hiển vi điện tử 32 Hình 3.11 A - Mơ gan cá tầm giống có nhân phình to (→); B – Mơ gan cá tầm giống có tập trung tế bào viêm xung quanh xoang máu gan (→) 33 Hình 3.12 Mơ biểu bì cá tầm Nga nhiễm virus có tƣợng nhân phình to 33 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm nghiệm phát WSIV mẫu cá tầm 34 Hình 3.14 Phát nhanh iridovirus cá hồi trắng (WSIV) cách sử dụng phép thử phản ứng chuỗi PCR 35 viii Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm nghiệm phát WSHV mẫu cá tầm 36 Hình 3.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm nghiệm phát IHNV mẫu cá tầm 37 Hình 3.17 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm nghiệm phát VNN mẫu cá tầm 39 Hình 3.18 Sự khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) RNA virut hoại tử thần kinh 40 ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các lồi nấm đƣợc tìm thấy cá tầm 10 Bảng 2.1 Số lƣợng tiêu cá nghiên cứu mô học 22 Bảng 2.2 Các cặp mồi chƣơng trình luân nhiệt cho PCR 24 Bảng 3.1 Tần số bắt gặp tiêu mơ học có dấu hiệu virus gây bệnh 29 Bảng 3.2 Kết tách chiết DNA RNA 33 x 3.3.3 Kết thử nghiệm PCR Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHNV) M T1 T2 T3 T4 NC T1 T2 T3 T4 M 1400 bp 693 bp M T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 M 1400 bp 693 bp M T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24 PC NC M Hình 3.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm nghiệm phát IHNV mẫu cá tầm 37 Chú thích hình T1: Mẫu cá tầm số 1; T9: Mẫu cá tầm số 9; T17: Mẫu cá tầm số 17 T2: Mẫu cá tầm số 2; T10: Mẫu cá tầm số 10; T18: Mẫu cá tầm số 18 T3: Mẫu cá tầm số 3; T11: Mẫu cá tầm số 11; T19: Mẫu cá tầm số 19 T4: Mẫu cá tầm số 4; T12: Mẫu cá tầm số 12; T20: Mẫu cá tầm số 20 T5: Mẫu cá tầm số 5; T13: Mẫu cá tầm số 13; T21: Mẫu cá tầm số 21 T6: Mẫu cá tầm số 6; T14: Mẫu cá tầm số 14; T22: Mẫu cá tầm số 22 T7: Mẫu cá tầm số 7; T15: Mẫu cá tầm số 15; T23: Mẫu cá tầm số 23 T8: Mẫu cá tầm số 8; T16: Mẫu cá tầm số 16; T24: Mẫu cá tầm số 24 M: Thang kích thƣớc DNA chuẩn 100 bp PC: Đối chứng dƣơng IHNV NC: Đối chứng âm Kích thƣớc sản phẩm PCR đặc hiệu cho virus IHNV có độ dài 693 bp Thực PCR 24 mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý, kết thu đƣợc 12 mẫu âm tính, 12 mẫu xuất vạch dƣơng tính với virus IHNV Qua Hình 3.16 PCR đạt đƣợc kết rõ ràng Đối với mẫu cá tầm (mẫu số 2, 12, 14, 15, 17, 18, 23) cho kết dƣơng tính đặc hiệu, đoạn gen đạt kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc đặc hiệu Bên cạnh nhận thấy 12 mẫu cá tầm (mẫu số 2, 3, 4, 12, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 23, 24) xuất vạch dƣơng tính với độ dài tƣơng đƣơng 1400 bp vạch đặc hiệu biết 693 bp Đây kết PCR cho kết dƣơng tính virus IHNV đƣợc phát với độ dài đoạn gen đặc hiệu độ dài khác cột mẫu Đồng thời kết dƣơng tính xuất mẫu cá tầm Nga cá tầm Siberi với dấu hiệu bệnh lý xuất huyết, cong thân bơi không định hƣớng Đối chiếu với công bố LaPatra cộng (1995) nhận thấy mẫu virus phát đƣợc nghiên cứu chúng tơi có dấu hiệu bệnh lý gần giống với công bố tác giả Do kết luận mẫu cá tầm Nga giống Lâm 38 Đồng lây nhiễm virus IHNV dạng khác virus với phạm vi lây nhiễm lớn [37] 3.3.4 Kết thử nghiệm PCR Viral nervous necrosis Virus (VNN) M T6 T7 T8 T9 NC T6 T7 T8 T9 M 590 bp 341 bp Hình 3.17 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm nghiệm phát VNN mẫu cá tầm Chú thích hình T6: Mẫu cá tầm số 6; T8: Mẫu cá tầm số T7: Mẫu cá tầm số 7; T9: Mẫu cá tầm số M: Thang kích thƣớc DNA chuẩn 100 bp NC: Đối chứng âm Kích thƣớc sản phẩm PCR đặc hiệu cho virus VNN có độ dài 341 bp Thực PCR 24 mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý, kết thu đƣợc 21 mẫu âm tính, mẫu xuất vạch dƣơng tính với virus VNN Qua Hình 3.17 nhận thấy PCR đạt đƣợc kết rõ ràng Đối với mẫu cá tầm số 7, 8, cho kết dƣơng tính đặc hiệu, đạt kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc đặc hiệu với độ dài 341 bp Bên cạnh nhận thấy mẫu cá tầm số 7, 8, xuất vạch dƣơng tính với độ dài 590 bp khơng kích thƣớc đặc hiệu với độ dài 341 bp Đây kết PCR dƣơng tính virus VNN đƣợc phát Đồng thời kết dƣơng tính xuất mẫu cá tầm Nga với dấu hiệu bệnh lý bơi không định hƣớng 39 So sánh với kết nghiên cứu công bố cho thấy mẫu virus phát đƣợc nghiên cứu chúng tơi có dấu hiệu bệnh lý gần giống với cơng bố Do sơ kết luận mẫu cá tầm Nga giống Lâm Đồng lây nhiễm virus VNN dạng khác virus [18, 22, 43] 430 bp Hình 3.18 Sự khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) RNA virut hoại tử thần kinh [43] 40 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận Các dấu hiệu bệnh lý virus thời gian nghiên cứu: Bệnh xuất huyết, cong thân, bơi không định hƣớng Kết phân tích mơ học cho thấy quan đích cá tầm Nga cao mô não mô thận cá xuất huyết với tỉ lệ 42%, mô não mô thận cá cong thân, mô não cá bơi quay, không định hƣớng với tỉ lệ 33,3% Đối với quan đích mơ gan TSBG mơ học có dấu hiệu virus gây bệnh thấp hơn, cao cá cong thân, bơi không định hƣớng với tỉ lệ 25% thấp cá xuất huyết với tỉ lệ 14% Ở cá tầm Siberi TSBG mơ học có dấu hiệu virus gây bệnh quan đích cá tầm Siberi cao mô thận cá xuất huyết với tỉ lệ 100%, vị trí mơ gan TSBG mơ học có dấu hiệu virus gây bệnh thấp cá cong thân với tỉ lệ 25% Đối với quan đích mơ gan cá bơi khơng định hƣớng chƣa phát mơ học có dấu hiệu virus gây bệnh Phân tích PCR cho kết tỷ lệ mẫu dƣơng tính virus IHNV 12/24 (50%), mẫu dƣơng tính với virus VNN với tỉ lệ 3/24 (12,5%), mẫu dƣơng tính với virus WSIV với tỉ lệ 2/24 (8,33%), WSHV cho kết âm tính 4.2 Đề xuất ý kiến Cần tiếp tục nghiên cứu sâu tác nhân gây bệnh virus cá tầm Nghiên cứu tác nhân virus khác gây bệnh cá tầm Nghiên cứu bệnh virus gây cá tầm tác nhân hội hay tác nhân gây hại cho cá 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đỗ Thị Hòa Một số phƣơng pháp dùng nghiên cứu bệnh Thủy sản Giáo trình môn bệnh học thủy sản Trƣờng Đại học Nha Trang, 2005 Lê Phƣớc Thuần “Nghiên cứu bệnh vi khuẩn nấm gây cá tầm (Acipenser spp) nuôi Lâm Đồng” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III, Khánh Hòa, 2012 Nguyễn Quốc Ân “Báo cáo tình hình nghiên cứu , cơng nghệ ni cá tầm, cá Hồi, Bào ngƣ giới Phân tích lựa chọ cơng nghệ ni phù hợp với điều kiện Việt Nam” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III, Khánh Hòa, 2008 Võ Thế Dũng Quy hoạch chi tiết nuôi cá nƣớc lạnh tỉnh Lâm Đồng đến năm 2020 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III, Khánh Hòa, 2011 Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Lê Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Hồng Tuyên, Nguyễn Viết Thùy, Nguyễn Trọng Lực Nghiên cứu tìm hiểu tác nhân gây bệnh ký sinh trùng, nấm vi khuẩn cá hồi cá tầm nuôi Lâm Đồng Báo cáo tổng kết Khoa học Kỹ thuật Đề tài Sở Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, 121 trang, 2012 Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung Kết nghiên cứu bệnh xuất huyết, lở loét vi khuẩn gây cá tầm nuôi thƣơng phẩm Lâm Đồng Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, số 23/2014: 99-105, 2014 Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Lê Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Hồn, Kiều Tiến n Nghiên cứu tìm hiểu tác nhân gây bệnh ký sinh trùng, nấm vi khuẩn cá giống trứng cá hồi cá tầm Lâm Đồng Báo cáo tổng kết Khoa học Kỹ thuật Đề tài Sở Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, 115 trang, 2015 Tiếng Nƣớc Ngoài: Adkison M.A., Cambre M & Hedrick R.P Identification of an iridovirus in Russian sturgeon Acipenser guldenstadi from Northern 174 Europe Bull Eur Assoc Fish Pathol., 18: 29–32., 1998 Aoki, T Motile aeromonas (Aeromonas hydrophila) In: Fish diseases and disorders Woo PTK, Bruno D.W (ed.) CABI Publishing, Wallingford, UK, pp 427-453, 1999 42 10 Athanassopoulou, F., Billinis C., and Prapas Th Important disease conditions of newly cultured species in intensive freshwater farms in Greece: first incedence of nodavirus infections in Acipenser sp Diseases of Aquatic Organisms, 60:247-252, 2004 11 Baba Mokhayer, Aquatic Organisms Health & Diseases Department, Veterinary Faculty,Tehran University, BO Box 14155-6453 Tehran, I R of Iran 12 Bauer, O.N., Pugachev O.N and Voronin V.N., 2002 Study of parasites and diseases of sturgeons in Russia: a review Journal of Applied Ichthyology, 18: 420- 429 13 Bazari Moghaddam S et al Parasitic infection among larvae and fingerlings of the Persian sturgeon (Acipenser persicus) in Vniro tanks and earthen ponds Iranian Journal of Fisheries Sciences, 9(3) pp 342-351, , 2010 14 Bury, D and Graves J.S Status of knowledge of Atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus oxyrinchus), Gulf of Mexico sturgeon (A oxyrinchus desotoi), shortnose sturgeon (A brevirostrum), white sturgeon (A transmontanus) and Bester hybrid sturgeon (Huso huso x A ruthenus) as it relates to risks for their culture in the State of Florida In: Metcalf, K and P Zajicek (eds.) Proceedings of the Florida sturgeon culture risk assessment workshop Prepared for: Florida Department of Agriculture and Consumer Services, Tallahassee, Florida pp.181-240, , 2000 15 Cao Hai-peng, YANG Xian-le, GAO Peng, LI Yi, ZHANG Shu-jun, DENG Lu Preliminary Study of the Pathogens Isolated from Bacterial Septicaemia Syndrome of Sturgeons Aquatic Pathogen Collection Center of Ministry of Agriculture, Shanghai Fisheries University, Shanghai, , 2007 16 Chebanov, M and Galich E Sturgeon Hatchery Manual FAO Fisheries and Aquaculture Technical Paper 558 Food and Agriculture Organisation of the United Nations, Ankara, Turkey 325 p ISBN 978–92–5–106823–6 (English), ISBN 978– 92–5–406823–3 (Russian) and ISBN 978–92–5–106823–6 (Turkish), 2011 17 Czeczuga B., Muszynska E., Wossughi G., Kama LY A., Kiziewicz B Aquatic fungi growing on the eggs of several species of acipenserid fishes – Acta Ichthyol Piscat., 25 71, 1995 18 Dalla Valle, L et al Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on real-time PCR plus nested PCR J Fish Dis., 23, pp.321-27., 2000 43 19 Eftychia Xylouri1, Yannis P Kotzamanis2, Fotini Athanassopoulou3**, Li Dong1, Ioannis S Pappas4, Alexandros Argyrokastritis5 and Eirini Fragkiadaki1 Isolation, Characterization, and Sequencing of Nodavirus in Sturgeon (Acipenser gueldestaedi L.) Reared in Freshwater Facilities*, 2007 20 Francis-Floyd, R., Klinger, R., Reed, P and Blazer, V Mycotic enteritis in Gulf sturgeon (Acipenser oxyrinchus desotoi) Proceedings of the International Association for Aquatic Animal Medicine30:109-110 , 1999 21 Francis-Floyd, R., Reed, P., Bolon, B., Estes, J and McKinney, S An epizootic of Edwardsiella tarda in largemouth bass (Micropterus salmoides) Journal of Wildlife Disease 29:334-336, 1993 22 Gilda D Lio-Po Celia R Lavilla Erlinda R Cruz-Lacierda Health Management in Aquaculture.14-15, 2001 23 Goodwin, A Herpesviruses in fish SRAC Publication, 4710, pp.1-7., 2012 24 Grotmol, S et al Characterisation of the capsid protein gene from a nodavirus strain affecting the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus and design of an optimal reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection assay Diseases of Aquatic Org., 39, pp 79-88, 2000 25 Hedrick, R.P et al Isolation of an epitheliotropic herpesvirus from white sturgeon (acipenser transmontanus) Dis Aquat Org 1991;11:49–56, 1991 26 Hedrick, R.P., LaPattra S., McDowell T and MacConnell B Workshop on Sturgeon Diseases 4th Symposium on Sturgeon Oshkosh, Wisconsin, USA 21pp, 2001 27 Hedrick, Speas R.P., J., Kent M.L., and McDowell T Adenovirus-like particles associated with a disease of cultured white sturgeon, Acipenser transmontanus Can J Fish Aquat Sci 42:1321-1325, 1985 28 Hochleithner, M & Gessner, I The sturgeons and paddlefishes of the world: biology and aquaculture Kitzbuehel, Aquatech 165 pp, 1999 29 Hoffman, G.L Parasites of North American Freshwater Fishes University of California Press Berkeley and Los Angeles, California 486pp, 1967 30 Hyaff A.D et al Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses Arch Virol., 145, p301-31, 2000 31 Jerre W Mohler Culture Manual for the Atlantic sturgeon U.S Fish & Wildlife Service publication Pp 57-64, 2003 44 32 John D Drennan1, Scott E LaPatra2, Jack T Siple3, Sue Ireland3, Kenneth D Cain1,* Transmission of white sturgeon iridovirus in Kootenai River white sturgeon Acipenser transmontanus, 2006 33 Karen Metcalf and Paul Zajicek Proceedings of the Florida Sturgeon Culture Risk Assessment Workshop Florida Department of Agriculture and Consumer Services Sarasota, Florida Pp 43-47, 2001 34 Kurobe, T., Keller Revised Phylogenetic Relationships among Herpesviruses Isolated from Sturgeons J Aquat Anim Health., 20, pp 96-102 40, 2008 35 Kurobe1, K T Kwak1, E MacConnell2, T S McDowell1, F O Mardones3, R P Hedrick1 Development of PCR assays to detect iridovirus infections among captive and wild populations of Missouri River sturgeon, 2010 36 Kwak K.T., Gardner I.A., Farver T.B., and Hedric A.P Rapid detection of White Sturgeon Iridovirus (WSIV) using a Polymarase Chain Reaction (PCR) assay Aquaculture, 254(1-4): 92-101, 2006 37 LaPatra, S.E., Jones G.R., Lauda K.A., McDowell T.S., Schneider R., and Hedrick R.P White sturgeon as a potential vector of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus Journal of Aquatic Animal Health 7:225-230, 1995 38 LaPatra1, J M Groff2, I Keith3, W E Hogans and D Groman5 Concurrent herpesviral and presumptiveiridoviral infection associated with disease in cultured shortnose sturgeon, Acipenser brevirostrum (L.), from the Atlantic coast of Canada, 2014 39 LI Yuan-Yuan, CAO Hai-Peng, HE Shan, YANG Xian-Le Isolation and Identification of Aeromonas hydrophila Strain X1 from Acipenser baerii and Its Antibiotic Sensitivity Aquatic Pathogen Collection Center of Ministry of Agriculture, SHOU,Shanghai, 2008 40 Mohler J W 2003 – Culture manual for the Atlantic sturgeon Acipenser oxyrinchus oxyrinchus – U.S Fish & Wildlife Service, Hadley, Massachusetts: 1– 66 41 Mumford S., Heidel J., Smith C., Morrison J., Macconnell B and Blazer V Fish histology and histopathology manual US Fish & Wildlife Sevice, National Conservation Training Center (USFWS-NCTC), 2007 42 Myamoto and Hartwell Evaluation of project effects on fish disease Prepared for: Oroville FERC Relicensing (Project No 2100) Draft Report 39pp, 2001 43 Nishikawa t et al Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of 45 striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) Dis aquat Org., 18, pp 103-07, 1994 44 Orpetveit i et al Detection of infectious pancreatic necrosis virus in subclinically infected Atlantic salmon by virus isolation in cell culture or real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of sample preservation and storage J Vet Diagn Invest., 22, pp 886-95, 2010 45 P D Cakić, vesna dj Djikanović, z B Kulišić , m M Paunović, Dunja g Jakovčev-todorović1, and snežana m Milošević1 The fauna of endoparasites in acipenser ruthenus Linnaeus, 1758 from the serbian part of the danuberiver, 2008 46 Post G Revised and expanded textbook of fish health T.F.H Publications, Inc 288 pp, , 1987 47 Thiery, R et al Family Nodaviridae In: King AMQ, Lefkowitz E, Adams MJ, Carstens EB, editors Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on London, UK: Elsevier pp.1061-67, 2011 48 Yanong, P.E.R., Francis-Floyd, R Streptococcal infections of fish Univ Fla IFAS Ext.57,1–6, 2006 49 Zaror, L.; E–mail: lzaroruach.cl.; Collado, L.; Bohle, H.; Landskron, E.; Montana, J.; Avendano, F.: Saprolegnia parasitica in salmon and trout from southern Chile Saprolegnia parasitica en salmones y truchas del sur de Chile Archivos de Medicina Veterinaria (Valdivia): 361: 71–78, , 2004 46 PHỤ LỤC Phụ lục Kết thu mẫu cá tầm nghiên cứu mô bệnh học STT Ngày thu mẫu Nơi thu Loài cá Chiều dài (mm) Khối lƣợng (g) 195 231 Bình thƣờng 224 262 Bình thƣờng 245 275 325 350 214 234 213 263 185 203 201 232 192 220 201 234 204 246 325 355 278 295 245 270 216 246 213 245 196 226 214 230 226 332 174 204 326 365 279 330 248 270 199 235 Dấu hiệu bệnh * Acipenser gueldenstaedtii ** Acipenser baerii Acipenser gueldenstaedtii 10/04/2017 10/01/2017 10/04/2017 10/04/2017 KlongKlanh Acipenser baerii Acipenser gueldenstaedtii 10/04/2017 Acipenser baerii 10/04/2017 Acipenser gueldenstaedtii 10 11 Acipenser gueldenstaedtii 21/07/2017 12 13 14 15 21/07/2017 KlongKlanh 21/07/2017 Acipenser baerii 21/07/2017 Acipenser gueldenstaedtii 21/07/2017 Acipenser baerii 16 17 18 19 20 Acipenser gueldenstaedtii 28/09/2017 21 22 23 24 Acipenser gueldenstaedtii Acipenser gueldenstaedtii 28/09/2017 KlongKlanh 28/09/2017 28/09/2017 Acipenser gueldenstaedtii Acipenser baerii 197 230 218 246 Xuất huyết Cong thân Bơi quay, không định hƣớng Xuất huyết Cong thân Bơi quay, không định hƣớng Xuất huyết Cong thân Bơiquay, không định hƣớng Phụ lục Kết thu mẫu cá tầm nghiên cứu phƣơng pháp PCR STT Ngày thu mẫu Nơi thu Loài cá 10/4/2017 Acipenser gueldenstaedtii 10/4/2017 Acipenser baerii 10/4/2017 Acipenser gueldenstaedtii KlongKlanh 10/4/2017 11 323 289 325 345 405 259 301 Acipenser baerii 247 189 268 228 Acipenser gueldenstaedtii 241 289 234 274 231 270 292 330 247 271 258 290 205 245 195 232 195 220 214 250 198 220 207 248 267 301 257 280 169 200 246 320 10/4/2017 Acipenser gueldenstaedtii 21/07/2017 12 13 14 15 21/07/2017 Acipenser gueldenstaedtii 21/07/2017 KlongKlanh Acipenser baerii 16 17 Acipenser gueldenstaedtii 21/07/2017 18 19 23 24 Acipenser gueldenstaedtii 28/09/2017 KlongKlanh 21 22 Dấu hiệu bệnh Xuất huyết Cong thân Bơi quay, không định hƣớng Xuất huyết Cong thân Bơi quay, không định hƣớng Acipenser baerii 21/07/2017 20 Khối lƣợng (g) 276 10 Chiều dài (mm) 28/09/2017 28/09/2017 28/09/2017 Acipenser gueldenstaedtii Acipenser gueldenstaedtii 249 289 Acipenser baerii 214 248 Xuất huyết Cong thân Bơiquay, không định hƣớng Phụ lục Kết đo nồng độ DNA Mã Nồng độ (ng/µl) Tổng số (ng) A260/280 A260/230 TD1 581 290500 1,95 1,92 TD2 316,1 158050 1,98 1,95 TD3 932,2 466100 1,97 2,03 TD4 975,5 487750 1,93 1,82 TD5 153,7 76850 1,67 0,95 TD6 114,9 57450 1,77 1,14 TD7 370,3 185150 1,86 1,47 TD8 242,9 121450 1,98 1,99 TD9 235,4 117700 1,99 1,86 TD10 90,3 90300 1,66 1,52 TD11 60,1 60100 1,69 1,45 TD12 21,2 21200 1,66 1,48 TD13 32 32000 1,6 0,98 TD14 29,2 29200 1,86 1,59 TD15 68 68000 1,65 1,03 TD16 25,3 25300 1,84 1,53 TD17 57,8 57800 1,5 0,63 TD18 45,4 45400 1,72 1,26 TD19 662,5 662500 1,92 2,1 TD20 12,8 12800 2,23 2,41 TD21 493,6 493600 1,99 2,2 TD22 482,8 482800 1,97 2,25 TD23 653 653000 1,93 2,14 TD24 720,7 720700 1,93 2,03 số mẫu Phụ lục Kết đo nồng độ RNA Mã số Nồng độ mẫu (ng/µl) Tổng số (ng) TR1 578,3 TR2 A260/280 A260/230 173490 2,14 2,33 1404,8 421440 2,14 2,36 TR3 475,9 142770 1,98 1,59 TR4 1171,2 351360 2,11 2,39 TR5 531 159300 1,81 2,3 TR6 87,9 26370 2,05 6,46 TR7 56,1 16830 2,07 23,03 TR8 141,7 42510 2,2 3,62 TR9 84,9 25470 2,24 6,82 TR10 90,7 90700 2,21 5,76 TR11 106,2 106200 1,82 2,2 TR12 186,2 186200 1,79 1,35 TR13 382,5 382500 1,89 2,73 TR14 346,2 346200 1,93 2,78 TR15 88,4 88400 1,97 4,11 TR16 108,2 108200 1,91 2,68 TR17 136,7 136700 2,16 3,64 TR18 166,9 166900 2,18 3,56 TR19 128,4 128400 1,99 2,36 TR20 193,9 193900 2,08 2,3 TR21 199 199000 2,11 2,32 TR22 179,2 179200 1,95 2,14 TR23 453,1 453100 2,01 2,29 TR24 72,3 72300 2,02 2,09 Phụ lục Hình ảnh sản xuất giống cá bể composite Phụ lục Hình ảnh Ni cá ao nƣớc chảy Klong Klanh ... M? ?) 19 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Nghiên cứu bệnh virus gây cá tầm (Acipenser spp) nuôi Lâm Đồng Mô tả dấu Xác định virus Xác định hiệu bệnh lý gây bệnh cá virus gây liên quan đến tầm bệnh cá tầm bệnh. .. (Acipenser spp. ) nuôi Lâm Đồng? ?? đƣợc thực nhằm xác định tác nhân virus gây bệnh cá tầm nuôi Lâm Đồng Nội dung nghiên cứu Mô tả dấu hiệu bệnh lý liên quan đến bệnh virus gây cá tầm Xác định virus gây bệnh. .. virut bệnh gây cá tầm (Acipenser spp. ) nuôi Lâm Đồng? ?? Mục tiêu đề tài nhằm xác định tác nhân virus gây bệnh cá tầm nuôi Lâm Đồng Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Cung cấp liệu nghiên cứu bệnh virus