Đang tải... (xem toàn văn)
Từ phần cặn nƣớc của mẫu hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall., bằng các phƣơng pháp sắc ký kết hợp với hệ dung môi thích hợp đã chiết tách, phân lập đƣợc 4 hợp chất [r]
(1)
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
Phạm Thị Châm
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ HOA TAM THẤT
Panax pseudoginseng Wall
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
(2)VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
Phạm Thị Châm
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ HOA TAM THẤT
Panax pseudoginseng Wall
Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 8440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS Trần Thị Hồng Hạnh Hƣớng dẫn 2: TS Trần Hồng Quang
(3)LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn cơng trình nghiên cứu riêng tôi, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn TS Trần Thị Hồng Hạnh TS Trần Hồng Quang Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cá nhân nhóm tác giả cơng bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu
HỌC VIÊN CAO HỌC
(4)LỜI CẢM ƠN
Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy cô giáo khoa Hóa học, Học viện Khoa học Cơng nghệ tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tơi kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Hồng Hạnh TS Trần Hồng Quang tận tình hướng dẫn, hết lịng bảo, tạo điều kiện giúp đỡ trong suốt thời gian làm luận văn
Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán phịng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ, trực tiếp bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận văn thạc sĩ Trong thời gian làm việc, không ngừng tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên môn bổ ích mà cịn học tập tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả, điều cần thiết cho tơi q trình học tập cơng tác sau
Sau xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, đóng góp ý kiến, giúp đỡ tơi q trình học tâp, nghiên cứu hồn thành luận văn tốt nghiệp
Luận văn giúp đỡ mặt kinh phí thực khuôn khổ đề tài Trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN: “Nghiên cứu sử dụng chất/nhóm chất chìa khóa có nguồn gốc từ dược liệu phục vụ xác định dược liệu chất lượng” Mã số: TĐNDTP.05/19-21
Tôi xin chân thành cảm ơn !
HỌC VIÊN CAO HỌC
(5)MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
CHƢƠNG TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU TAM THẤT
1.1.1.Vị trí phân loại lồi Panax pseudoginseng
1.1.2.Đặc điểm thực vật phân bố loài Panax pseudoginseng Wall.
1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHI Panax
1.2.1 Tình hình nghiên cứu hóa học
1.2.2.Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học 17
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 22
2.2 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22
2.2.1 Mục tiêu luận văn 22
2.2.2 Các nội dung nghiên cứu 22
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu hóa học 22
2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập hợp chất 23
2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất sử dụng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 25
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 26
3.1 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ HOA Panax pseudoginseng Wall 26
3.1.1 Phân lập hợp chất 26
3.1.2 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập đƣợc 28
CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 31
4.1.1 Hợp chất 1: Ginsenoside F1 31
4.1.2 Hợp chất 2: Ginsenoside Rg1 35
(6)4.1.4.Hợp chất số 4: chất mới 44
KẾT LUẬN 53
KIẾN NGHỊ 54
(7)DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
1
H-NMR Proton Magnetic Resonance
Spectroscopy
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13
1
H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy
Phổ tƣơng tác proton-proton
CC Column Chromatography Sắc ký cột
DEPT Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Phổ DEPT
DMSO Dimethyl sulfoxide
ESI-MS Electron Spray Ionization Mass
Spectra
Phổ khối ion hóa phun điện tử
Hela Cervical adenocarcinoma cancer Ung thƣ cổ tử cung
HMBC Heteronuclear Multiple Bond
Connectivity
Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
HPLC High-performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu cao
HR-ESI-MS Hight Resolution Electron Spray
Ionization Mass Spectra
Phổ khối ion hóa phun điện tử phân giải cao
HSQC Heteronuclear Single Quantum
Coherence
Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua liên kết
IC50 Inhibitory concentration of 50% Nồng độ ức chế 50%
MPLC Medium pressure liquid
chromatography
Sắc ký lỏng trung áp
NOESY Rotating-frame nuclear
Overhauser effect correlation spectroscopy
(8)DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất 1 chất so sánh 34
Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất 2 chất so sánh 39
Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất 3 chất so sánh 43
(9)DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Sơ đồ chiết tách hợp chất từ Panax pseudoginseng Wall 26
Hình 2.Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn nƣớc mẫu Hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. 28
Hình Cấu trúc hóa học số tƣơng tác HMBC hợp chất 1……… 31
Hình Phổ 1H NMR hợp chất 1 31
Hình Phổ 13C NMR hợp chất 1 32
Hình 4 Phổ HSQC hợp chất 1 33
Hình Phổ HMBC hợp chất 1 34
Hình Cấu trúc hóa học số tƣơng tác HMBC hợp chất 36
Hình Phổ H NMR hợp chất 2 37
Hình Phổ 13C NMR hợp chất 2 37
Hình Phổ HSQC hợp chất 2 38
Hình 10 Phổ HMBC hợp chất 2 38
Hình 11 Cấu trúc hóa học số tƣơng tác HMBC hợp chất 40
Hình 12 Phổ 1H NMR hợp chất 3 41
Hình 13 Phổ 13 C NMR hợp chất 3 41
Hình 14 Phổ HSQC hợp chất 3 42
Hình 15 Phổ HMBC hợp chất 3 43
Hình 16 Cấu trúc hóa học số tƣơng tác HMBC hợp chất 4 45
Hình 17 Phổ khối lƣợng phân giải cao HRESI-MS hợp chất 4 45
Hình 18 Phổ 1H NMR hợp chất 4 46
Hình 19 Phổ 13 C NMR hợp chất 4 47
Hình 20 Phổ HSQC hợp chất 4 47
Hình 21 Phổ COSY hợp chất 4 48
Hình 22 Phổ HMBC hợp chất 4 49
(10)MỞ ĐẦU
Lịch sử hình thành lồi ngƣời gắn liền với lịch sử dùng thuốc Từ xa xƣa ngƣời biết sử dụng loại cỏ để làm thuốc để phòng chữa bệnh Nhằm bảo vệ ngƣời trƣớc nguy bệnh tật, nhà khoa học khơng ngừng nghiên cứu để tìm loại thuốc mới, phƣơng thức điều trị vừa hiệu vừa an toàn với thể Một xu hƣớng quan trọng trình tìm kiếm hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên chúng thƣờng phù hợp với thể sống, độc, thân thiện với mơi trƣờng, đa dạng cấu trúc, sử dụng trực tiếp để làm thuốc, làm mơ hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc
Với điều kiện thiên nhiên nhiều ƣu đãi, Việt Nam có hệ sinh thái phong phú đa dạng, có tiềm to lớn tài nguyên phát triển thuốc làm dƣợc liệu Từ xa xƣa, tam thất đƣợc coi vị thuốc y học cổ truyền quý Tam thất thƣờng dùng cho phụ nữ sau sinh, ngƣời ốm dậy, suy nhƣợc thể, ngƣời già yếu, có tác dụng bổ dƣỡng, cầm máu, giảm đau, chống sƣng viêm, hỗ trợ hệ miễn dịch điều trị số bệnh tim mạch [1, 2] Tuy nhiên, sau thu hoạch chúng chủ yếu đƣợc dùng dƣới dạng thô theo số thuốc cổ truyền Hơn nữa, chƣa có nghiên cứu hệ thống chi tiết thành phần hoạt chất nhƣ tác dụng dƣợc lý tam thất trồng nƣớc ta Đặc biệt nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học hoa tam thất cịn Do đó, thực tế yêu cầu đặt cần có nghiên cứu tập trung hệ thống thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tác dụng dƣợc lý dƣợc liệu quý trồng Việt Nam Với lý trên, học viên xin đề xuất thực đề tài luận án với tiêu đề: “Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc số hợp chất Saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall ”
Mục đích nghiên cứu
(11) Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu hoa tam thất Panax pseudoginseng
Wall đƣợc TS Nguyễn Thế Cƣờng (Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) thu thập giám định tên khoa học
Phạm vi nghiên cứu:
- Phân lập đƣợc - hợp chất từ dịch chiết hoa tam thất
- Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phƣơng pháp hóa lý
Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu
Ý nghĩ khoa học
Cung cấp thông tin khoa học quy trình chiết tách xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc từ dich chiết hoa tam thất
Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp thêm thông tin, làm tài liệu tham khảo cho nghiên cứu tam thất
(12)CHƢƠNG TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU TAM THẤT
1.1.1 Vị trí phân loại loài Panax pseudoginseng
Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [2], lồi Panax pseudoginseng Wall có vị trí phân loại nhƣ sau:
Giới: Plantae (Thực vật) Bộ: Apiales (Hoa tán)
Họ: Araliaceae (Họ Cuồng) Chi: Panax
Trên giới, chi Panax có khoảng 18 lồi, lồi phân bố Bắc Mĩ, 17 lồi phân bố Đơng Á Việt Nam có lồi thứ
1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố loài Panax pseudoginseng
Wall.
Cây thân thảo sống nhiều năm, thân cao từ 30-50cm Lá kép chân vịt, mọc vòng 3-4 một, cuống chung dài 3-6cm, mang 3-7 chét hình mác dài, mép khía răng, có lơng cứng gân hai mặt, cuống chét dài từ 0,6-1,2 cm Cụm hoa tán đơn thân, hoa màu lục vàng nhạt với đài, cánh hoa, nhị bầu hạ ô Quả mọng hình cầu dẹt, chín có màu đỏ, hạt hình cầu màu trắng Ra hoa vào tháng 5-7, có vào tháng 9-10 [1]
(13)nụ hoa ba năm có thành phần saponin cao gấp nhiều lần so với năm [1]
Bộ phận dùng: củ, nụ, hoa Sau thu hái đƣợc làm sạch, phơi khơ [1] 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA CHI Panax
1.2.1 Tình hình nghiên cứu hóa học
Trong năm gần đây, chi Panax đƣợc nghiên cứu nhiều giới thành phần hóa học hoạt tính sinh học Cho đến nay, có khoảng 760 hợp chất đƣợc phân lập từ chi Panax, bao gồm saponin, flavonoid, polysaccharid, steroid phenol Trong đó, saponin triterpenoid hợp chất chi Panax đƣợc nghiên cứu nhiều Các nghiên cứu dƣợc lý đại cho thấy hợp chất thể hoạt tính sinh học, bao gồm hoạt tính chống ung thƣ, kháng viêm, bảo vệ tế bào gan, bảo vệ thần kinh, điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch chống đái tháo đƣờng
1.2.1.1. Các hợp chất Saponin
Saponin gọi saponosid nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi thực vật Chúng chủ yếu phân bố thực vật bậc cao cạn, nhƣ P ginseng, P quinquefolius và P.notoginseng,…và có nhiều tác dụng dƣợc lý
Trong y học dân gian, chúng đƣợc sử dụng làm chất tan máu, chất kháng khuẩn chất chống viêm [3] Tuy nhiên, saponin thể hoạt tính cao aglycone thủy phân glycoside thứ cấp Trong số 18 loài thuộc chi
Panax, P ginseng, P quinquefolius và P.notoginseng có thành phần dammarane saponin có hoạt tính sinh học tốt Ngồi ra, hàm lƣợng saponin bị ảnh hƣởng loài, phận, thời kỳ sinh trƣởng khu vực sản xuất, có nghĩa dƣợc lý chúng hoạt động không giống Từ nhiều nghiên cứu hầu hết saponin phận thân, lá, hoa loài thuộc chi Panax saponin loại dammarane saponin loại ocotillol [4]
(14)Trong số tất saponin triterpene tetracyclic dammarane đƣợc phát thuộc chi Panax, có 94 saponin loại protopanaxadiol 93 saponin đƣợc
phân loại protopanaxatriol Trong saponin loại protopanaxadiol, nguyên tố đƣờng đƣợc gắn vào C3 / C20 vòng dammarane triterpene (nhƣ ginsenoside Rb1, Rb2, Rc Rd)
Từ phần củ P ginseng, Zhu cộng phân lập đƣợc sáu
ginsenoside loại PPD acyl hóa (Ginsenoside Ra4-Ra9) [5]
Từ nụ hoa P.ginseng, Tung cộng phân lập đƣợc sáu hợp
(15)b.Saponin loại protopanaxatriol (PPT)
Là loại saponin có hoạt tính sinh học quan trọng, 93 loại PPT saponin đƣợc báo cáo Trong saponin loại PPT, phần tử đƣờng gắn vào vịng vị trí C6 (nhƣ ginsenoside Re) C20
(16)c. Các saponin loại oleanolic axit (OA)
Các saponin loại oleanolic đƣợc đặc trƣng chuỗi 3- / C-28-glycosyl có axit glucuronic (GlcA) gắn với C-3 Ginsenoside Ro, thuộc loại oleanane pentacyclic triterpene, hợp chất đƣợc tìm thấy P ginseng với hàm lƣợng thấp
Từ dịch chiết methanol củ P bipinnatifidus Nguyen cộng
phân lập đƣợc ba hợp chất bifinoside A-C [9]
(17)Saponin loại ocotillol loại saponin triterpene bốn vịng có chứa vịng furan chuỗi bên, đƣợc tìm thấy số lồi, nhƣ P pseudoginseng, P quinquefolius, P vietnamensis P japonicus Trong tự nhiên, saponin loại ocotillol chủ yếu bao gồm pseudoginsenoside F11 (PF11), pseudo-ginsenoside RT5, RT2, RT4, vina-ginsenoside R1 (VR1), VR2, VR5, VR6, VR13, MR1, mR2 yesanchinoside A-C
e. Các saponin khác
Ngoài loại saponin nêu trên, có khoảng 25 loại saponin chứa sapogenin đồng phân chi Panax đƣợc tìm thấy Những thay đổi cấu trúc saponin xảy chủ yếu q trình cacbonyl hóa C-3 C-18, khử nƣớc C-1 C-2, C-5 C-6, C-12 C-13, hydroxyl hóa thêm C-7, C-15, C-16 C-19-dehydroxyl hóa Các saponin PPT có xu hƣớng nƣớc C-6, tạo thành liên kết đôi C-5 C-6
1.2.1.2. Phytosterol
(18)chất chống oxy hóa dinh dƣỡng chất phụ gia để ức chế hấp thụ cholesterol thúc đẩy phân hủy chuyển hóa cholesterol Hiện tại, có khoảng mƣời sterol thực vật đƣợc tìm thấy Panax Từ phần củ P notoginseng, Wei cộng thu đƣợc β-sitosterol β -sitosterol-D-glucoside [10]
β-sitosterol-D-glucoside
Từ hạt P ginseng, Kim cộng phân lập đƣợc hợp chất
glucoside sterol 3-O-β-D-glucopyranosyl-5, 22, 24-stigmastatrienol, sterol biết 5,22-stigmastadienol đánh giá khả ức chế
chúng yếu tố gây hoại tử khối u [11]
3-O-β-D-glucopyranosyl-5,22,24-stigmastatrienol
1.2.1.3. Flavonoid
(19)nhau Cho đến nay, có khoảng 22 flavonoid đƣợc phân lập từ chi Panax hầu hết tồn dạng flavonol
Sáu flavonoid từ thân P notoginseng đƣợc phân tách nhóm nghiên cứu Zheng Nhóm nghiên cứu đƣợc xác định kaempferol, quercetin kaempferol-7-O-α-L-rhaamnosioside, kaempferol-3-O
-β-D-galactoside, kaempferol 3-O-(2″-β-D-glucopyranosyl) -β -D-galactopyranoside quercetin 3-O-(2″- β-D-glucopyranosyl)-β -D-galactopyranoside Ngoài ra, số flavonoid đƣợc phân lập từ nụ hoa P notoginseng [12]
1.2.1.4. Polysaccharide
Đến nay, có 30 hợp chất polysaccharide đƣợc phân lập từ thân củ P japonicus, rễ P quinquefolius, P notoginseng hoa P ginseng
1.2.1.5. Axit béo
Lipid thành phần quan trọng P ginseng Các hợp chất axit
béo khơng có nhiều tác dụng sinh học mà tiền chất tổng hợp nhiều hợp chất sinh học quan trọng Thành phần axit béo rễ P ginseng
(20)Hiện tại, 24 axit béo (bao gồm axit pentadecylic, axit palmitic, axit stearic, axit margaric, axit oleic axit linolenic,… đƣợc tìm thấy rễ P ginseng P notoginseng
1.2.1.6. Các hợp chất khác
Ngoài hợp chất nêu trên, skimmin, apiosylskimmin daphnin metyl ete đƣợc phân lập từ P notoginseng Mƣời tám axit amin 72
(21)1.2.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học
Trong phƣơng thuốc dân gian, tam thất thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc bổ, chất kích thích có tác dụng chống mệt mỏi; đƣợc coi phƣơng thuốc để ngăn ngừa chảy máu phục hồi sau chấn thƣơng Từ lâu, hoa loại thảo dƣợc đƣợc sử dụng rộng rãi dƣới dạng thuốc thực phẩm Mặt khác, hoa tam thất đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc bổ đƣợc dùng nhƣ loại trà tốt cho sức khỏe Trung Quốc
Các nghiên cứu dƣợc lý đại cho thấy chi Panax có vai trò quan trọng chống ung thƣ, chống viêm, bảo vệ tế bào gan, bảo vệ thần kinh, hoạt động điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch, chống đái tháo đƣờng chống hạ huyết áp, cầm máu, kích hoạt huyết ứ,…
1.2.2.2. Tác dụng chống ung thư
Căn theo y học cổ truyền Trung Quốc Việt Nam, tam thất đƣợc sử dụng từ lâu đời để chữa khối u tân sinh Ngày nay, y học đại chi Panax nguồn nghiên cứu có giá trị, thu hút nhà khoa học nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thƣ Theo báo cáo Yun, dịch chiết củ P ginseng ức chế tăng sinh khối u axit dimethylolbutanoic gây kéo dài thời gian sống sót chuột [13] Sau nhiều năm nghiên cứu, nghiên cứu chống ung thƣ hợp chất ginsenoside trở thành điểm nóng với nhiều nghiên cứu chuyên sâu từ chuyển hóa ginsenoside, chế chống ung thƣ khía cạnh khác.Một số lƣợng lớn thí nghiệm
(22)thƣ đƣợc tóm tắt nhƣ sau: (1) bắt giữ chu kỳ tế bào, cảm ứng apoptosis ức chế tăng sinh khối u; (2) tác dụng ức chế di tế bào ung thƣ; (3) kích hoạt hệ thống miễn dịch Một nghiên cứu cho thấy phát triển tế bào ung thƣ cổ tử cung ngƣời (HeLa) bị ức chế ginsenoside Rd theo cách phụ thuộc vào thời gian liều lƣợng, với giá trị IC50 150,5 ± 0,8 µg/ml sau 48 ủ [14] Các nghiên cứu sâu chứng minh ginsenoside Rb1 tác động đối kháng canxi để đảo ngƣợc trình sản sinh tế bào ung thƣ [15] Notoginsenoside Ft1 hạn chế tăng sinh tế bào thông qua p38 kinase protein kích hoạt mitogen protein kinase điều hịa ngoại bào Nó đƣợc chứng minh có hiệu điều trị tiềm u nguyên bào thần kinh ngƣời [16] Ngoài ra, nghiên cứu Li cộng sự, polysaccharide P
notoginseng đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào u gan H22
trong ống nghiệm tiếp tục đƣợc sử dụng để thử nghiệm chuột mang tế bào ung thƣ Kết cho thấy polysaccharide P notoginseng ức chế phát triển tế bào H22 kéo dài thời gian sống chuột mang tế bào ung thƣ Việc phát polysaccharide chống ung thƣ mở rộng việc lựa chọn loại thuốc điều trị miễn dịch cho u gan [17] Theo nghiên cứu Lee cộng cho thấy polysaccharide P ginseng chất chống ung thƣ không độc hại, kích hoạt miễn dịch, kích hoạt đại thực bào để sản xuất nitơ hoạt động chất trung gian, làm trung gian cho tác dụng tiêu diệt khối u [18]
1.2.2.3. Tác dụng chống viêm
P ginseng loại dƣợc liệu đƣợc sử dụng rộng rãi để
(23)(G-CK) tế bào T chuột bị viêm khớp collagen cho thấy G-CK loại thuốc đầy hứa hẹn để điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp [23] Theo báo cáo Dong, đƣờng trao đổi chất hợp chất ginsenoside (ginsenoside Ra1, Rb1, Rb2, Rc) in vivo chủ yếu đƣợc chuyển thành ginsenoside đƣợc khử oxy hóa (ginsenoside Rd) thông qua hệ vi sinh đƣờng ruột [24] Sau đó, đƣợc hấp thụ vào tuần hồn máu để phát huy tác dụng chống viêm [25]
1.2.2.4. Tác dụng bảo vệ gan
Theo nghiên cứu gần đây, chi Panax có tác dụng bảo vệ gan chế bao gồm ngăn chặn xơ hóa, ức chế tạo khối u, loại bỏ vi rút ức chế q trình oxy hóa gây hại [26, 27] Nghiên cứu Qi cho thấy anthocyanin P ginseng ngăn chặn tổn thƣơng thận cisplatin gây [28] Các oligopeptit P ginseng làm giảm đáng kể mức độ yếu tố hoại tử khối u-α, interleukin 1β interleukin huyết Các nghiên cứu oligopeptides P ginseng bảo vệ gan tế bào cách cải thiện phản ứng viêm huyết rƣợu
1.2.2.5. Tác dụng bảo vệ thần kinh
Với gia tăng già hóa dân số áp lực sống xã hội, ngƣời ngày tiếp xúc nhiều với nguy mắc bệnh hệ thần kinh Thần kinh rối loạn bao gồm bệnh Alzheimer (AD), bệnh Parkinson, động kinh phiền muộn Các hợp chất ginsenoside ngày đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh hệ thần kinh, đặc biệt hệ thần kinh trung ƣơng Một số chế đƣợc xác định để biểu hoạt động bảo vệ thần kinh bao gồm loại bỏ gốc tự để kích hoạt chức não, ức chế stress oxy hóa viêm thần kinh Các nghiên cứu cho thấy ginsenoside Rb2 có tiềm trở thành loại thuốc chống co giật [29] Pseudoginsenoside F11 lựa chọn để làm chậm q trình thối hóa thần kinh Zhang cộng phát pseudoginsenoside F11 có tác dụng có lợi thay đổi bệnh lý AD chuột [30]
1.2.2.6. Tác dụng điều hòa miễn dịch
Các nghiên cứu dƣợc lý đại cho thấy số hợp chất từ chi Panax
(24)miễn dịch (tuyến ức, lách), tế bào miễn dịch (đại thực bào, tế bào đuôi gai,…) cytokine [31] Các hợp chất ginsenoside polysaccharide thành phần hoạt động P ginseng với loạt hoạt động điều hòa miễn dịch Các saponin từ P notoginseng sở hữu hoạt động bổ trợ miễn dịch tăng cƣờng miễn dịch dịch thể tế bào đáp ứng với ovalbumin chuột dùng ovalbumin [32]
1.2.2.7. Tác dụng bảo vệ tim mạch
Khi bệnh tim mạch trở thành nguyên nhân gây tử vong hạn chế loại thuốc sử dụng trị liệu, nghiên cứu phát triển hoạt chất từ thuốc cần thiết lâm sàng thực nghiệm Các nghiên cứu bệnh tim mạch chủ yếu tập trung vào ginsenoside monome từ P ginseng thay tồn dịch chiết Các ginsenoside đƣợc nghiên cứu nhiều Rg1, Rb1, Rh1, Re Rd Ginsenoside Re có tác dụng điều trị rối loạn nhịp Tuy nhiên, gây ngộ độc tác dụng phụ lạm dụng nhiều [33] P notoginseng loại thuốc chống đau thắt ngực hiệu Nó đƣợc xác nhận nghiên cứu Lei dịch chiết nƣớc P notoginseng cải thiện chức tim mạch [34] Nghiên cứu cho thấy P notoginseng làm tăng lƣu lƣợng máu mạch vành co bóp tim mà không làm thay đổi nhịp tim
1.2.2.8. Cầm máu hoạt huyết hóa ứ P notoginseng
Củ P notoginseng đƣợc biết đến nhƣ loại thảo dƣợc để tăng cƣờng lƣu thông hoạt huyết cầm máu Dencichine axit amin đặc biệt đƣợc phân lập từ rễ P notoginseng Nó rút ngắn thời gian chảy
máu chuột giảm kích hoạt phần thời gian thromboplastin thời gian thrombin, nồng độ fibrinogen huyết tƣơng tăng phụ thuộc vào liều lƣợng Ngoài ra, hoạt chất cầm máu chứa ion canxi quercetin [35]
1.2.2.9. Các tác dụng sinh học khác
(25)(26)CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu thực vật: Đối tƣợng nghiên cứu hoa tam thất
Panax pseudoginseng Wall thu hái vào tháng 7/2019, Phó Bảng, Hà Giang đƣợc TS Nguyễn Thế Cƣờng (Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) giám định tên khoa học Mẫu tiêu đƣợc lƣu Viện Hóa sinh biển Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
2.2 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Mục tiêu luận văn
Nghiên cứu số thành phần saponin hoa tam thất Panax
pseudoginseng Wall
2.2.2 Các nội dung nghiên cứu
Phân lập số hợp chất saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng
Wall
Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phƣơng pháp hóa lý 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu hóa học
2.3.1.1 Hóa chất, thuốc thử
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:
- Các dung mơi: Methanol, n-hexan, dichloroform, ethyl acetat, nƣớc cất,…
- Thuốc thử: Acid sufuric 10% nƣớc cất
2.3.1.2 Máy móc, thiết bị dụng cụ
(27)- Chất nhồi cột: Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), silicagel pha thuận 0,040-0,063 mm (240-430 mesh, Merck), silicagel pha đảo YMC (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.)
- Bản mỏng tráng sẵn pha thuận DC-Alufolien 60 F254 (Merck) kính pha đảo RP-18 F254S (Merck)
- Hệ thống máy cất quay, làm lạnh EYELA (Nhật Bản) - Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 365 nm
- Cân phân tích Ohaus, độ xác 0,1 mg
- Cân kỹ thuật Precisa (Thụy Sĩ), độ xác 0,01 g
- Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE AM500 FT-NMR Viện Hóa học – Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
- Dụng cụ thủy tinh: Pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu 100ml, 250 ml, 500 ml, ống đong, phễu thủy tinh
2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập hợp chất
2.3.2.1 Phương pháp xử lý mẫu
Các mẫu nghiên cứu đƣợc xử lý sơ để ổn định hoạt chất sau tiến hành chiết mẫu với MeOH, tạo dịch chiết thơ Quy trình xử lý gồm bƣớc sau:
Bước 1: Mẫu đƣợc rửa để loại tạp bẩn sau đƣợc sấy khơ
phơi khô
Bước 2: Cân lƣợng mẫu khô thu đƣợc xay mẫu
Bước 3: Mẫu nghiên cứu đƣợc tiến hành chiết thiết bị chiết siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) nhiệt độ 40-50oC, thời gian chiết lần tối thiểu 60 phút, sử dụng dung môi MeOH
Bước 4: Dịch chiết lần chiết đƣợc lọc qua giấy lọc đƣợc gộp lại
và tiến hành cất loại dung môi dƣới áp suất giảm nhiệt độ dƣới 50o
C thu đƣợc dịch cô MeOH
Bước 5: Cân dịch chiết bảo quản mẫu lọ đựng cặn chiết để
(28)2.3.2.2 Phương pháp tạo dịch chiết phân đoạn
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu hoa tam thất đƣợc lấy lƣợng g mẫu
khơ, cho vào bình định mức 10 ml
Bước 2: Đánh số thứ tự ký hiệu bình chiết mẫu Thêm dung mơi
theo thứ tự tăng dần độ phân cực, dung môi đƣợc thêm đến vạch định mức
Bước 3: Tồn bình chiết đƣợc cho lên máy lắc ngang, lắc
cho dung môi thấm mẫu Để lắng khoảng 1-2
Bước 4: Lọc mẫu, phần dịch lọc đƣợc cất loại dung môi thiết bị cất quay, dịch thô thu đƣợc cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lƣợng vết chất khả hòa tan mẫu nghiên cứu
Bước 5: Sử dụng sắc ký mỏng TLC hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với tỷ lệ thích hợp để đánh giá mẫu thô thu đƣợc
2.3.2.3 Phương pháp phân lập chất
- Sắc kí lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất đƣợc
tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần đƣợc trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với tốc độ khác Kết quả, ta thu đƣợc sắc ký đồ lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát chất đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm 365 nm dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng bếp điện từ đến màu
- Sắc kí cột: Nguyên lí tách sắc kí cột nhƣ loại sắc kí
(29)dung mơi (pha động) di chuyển dọc theo cột làm di chuyển cấu tử mẫu thử, cấu tử có độ phân cực khác nên lực chúng với pha tĩnh khác Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ Silica gel pha thƣờng pha đảo Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo ODS YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd.)
- Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector
UV-vis bƣớc sóng từ 200-900 nm, lấy mẫu tự động (fraction collector) kèm theo với dãy ống nghiệm kích thƣớc thay đổi tùy theo lƣợng mẫu, hệ thống bơm với khả điều chỉnh áp từ đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1ml/phút đến 200 ml/phút Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lƣợng từ 100g đến 450g mẫu đầu vào
Các thiết bị sử dụng nêu thuộc Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất sử dụng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance) phƣơng pháp vật lý đại nghiên cứu cấu tạo hợp chất hữu cơ, có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo phân tử phức tạp nhƣ hợp chất thiên nhiên
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, chiều hai chiều đƣợc đo máy Bruker Advance AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
Chất nội chuẩn đƣợc sử dụng TMS (tetramethyl silane) Các kỹ thuật phổ cộng hƣởng từ hạt nhân sử dụng:
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều: 1H-NMR, 13C-NMR
(30)CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ HOA Panax pseudoginseng Wall 3.1.1 Phân lập hợp chất
Mẫu Hoa tam thất (Panax pseudoginseng Wall.) sau thu hái
đƣợc rửa sạch, sấy khô dƣới nhiệt độ 50oC sau xay nhỏ thành bột mịn Bột khơ mẫu Hoa tam thất(Panax pseudoginseng Wall.)đƣợc đem chiết lần với metanol có dùng siêu âm, dịch chiết sau đƣợc cô quay dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn chiết metanol (500 g) Cặn chiết metanol đƣợc hòa vào nƣớc, sau chiết phân lớp lần lƣợt với dung môi n-hexan, diclometan thu đƣợc cặn chiết n-hexan (80g), cặn chiết diclometan (10g), dịch nƣớc phần cặn khơng tan
Hình Sơ đồ chiết mẫu hoa Panax pseudoginseng Wall
Qua tổng quan tài liệu nghiên cứu đánh giá sơ sắc ký lớp mỏng cho thấy hợp chất saponin nằm tập trung phân đoạn nƣớc (W) Do đó, luận văn tập trung phân lập, xác định cấu trúc hợp chất từ phân đoạn W
(31)dung môi diclometan:metanol (20:1), tăng dần độ phân phân cực hệ dung môi thu đƣợc phân đoạn từ W1→W5
Phân đoạn W2 (750mg) tiếp tục đƣợc phân tách cột sắc ký silicagel pha đảo YMC RP-18 với hệ dung môi axeton:nƣớc (1:2) thu đƣợc phân đoạn W2B, tinh chế phân đoạn cột sắc ký silicagel pha thƣờng hệ dung môi diclometan:axeton:nƣớc (1:2:0,05) thu đƣợc hợp chất 1 (40mg)
Phân đoạn W3 (13g) đƣợc phân tách hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động axeton:H2O (1:2) thu đƣợc phân đoạn ký hiệu W3A-W3E (hình 3.2) Phân đoạn W3C (2.5g) đƣợc phân tách tiếp sắc ký cột silica gel pha đảo YMC RP-18 rửa giải hệ dung môi axeton:H2O (1:3) thu đƣợc phân đoạn W3C2 Tiếp tục sử dụng cột sắc ký silicagel pha thƣờng hệ dung môi diclometan:metanol:nƣớc (6:1:0,1) thu đƣợc phân đoạn C2B C2C Tinh chế C2C (200mg) cột sắc ký silicagel pha thƣờng hệ dung môi diclometan:metanol:nƣớc (4:1:0,1) thu đƣợc hợp chất 2 (20mg)
(32)Hình 2.Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn nƣớc mẫu hoa
tam thất Panax pseudoginseng Wall
3.1.2 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập đƣợc
Hợp chất 1
Hợp chất 1 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C36H62O9
1
H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 0.93 (1H, dd, J = 11.0 Hz, H-5), 4.06 (1H, dd, J = 4.0, 10.5 Hz, H-6), 1.11 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-19), 1.39 (3H, s, H-21), 1.70 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, s, H-27), 1.31 (3H, s, H-28), 0.98 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30), 4.62 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 3.65 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, Ha-6ʹ), 3.80 (1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz, Hb-6ʹ)
13
(33) Hợp chất
Hợp chất 2 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C42H72O14
1
H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.12 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-19), 1.37 (3H, s, H-21), 1.70 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, H-27), 1.35 (3H, s, H-28), 1.02 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30), 4.62 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 4.37 (1H, d,
J = 7.5 Hz, H-1ʹʹ) 13
C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 40.19 (C-1), 27.59 (C-2), 79.87 (C-3), 40.47 (C-4), 62.79 (C-5), 80.91 (C-6), 45.30 (C-7), 41.88 (C-8), 50.60 (C-9), 40.37 (C-10), 31.53 (C-11), 71.85 (C-12), 49.20 (C-13), 52.43 (C-14), 30.96 (C-15), 27.24 (C-16), 53.12 (C-17), 17.65 (C-18), 17.81 (C-19), 84.92 (C-20), 22.84 21), 36.63 22), 24.22 23), 125.85 24), 132.29 25), 25.85 (C-26), 17.95 (C-27), 31.40 (C-28), 16.11 (C-29), 17.15 (C-30), 98.29 (C-1ʹ), 75.49 2ʹ), 77.90 3ʹ), 71.22 4ʹ), 77.63 5ʹ), 62.55 6ʹ), 105.55 (C-1ʹʹ), 75.37 (C-2ʹʹ), 79.06 (C-3ʹʹ), 71.72 (C-4ʹʹ), 78.25 (C-5ʹʹ), 62.94 (C-6ʹʹ)
Hợp chất 3
Hợp chất 3 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C42H72O14
1
H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.09 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-19), 1.39 (3H, s, H-21), 1.71 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, H-27), 1.31 (3H, s, H-28), 0.98 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30), 4.60 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 3.22 (1H, dd,
J = 8.0, 9.0 Hz, H-3ʹ), 3.67 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, Ha-6ʹ), 3.88 (1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz, Hb-6ʹ), 4.37 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹʹ)
13
(34)75.14 2ʹ), 78.55 3ʹ), 71.56 4ʹ), 76.79 5ʹ), 70.26 6ʹ), 104.98 (C-1ʹʹ), 75.30 (C-2ʹʹ), 77.96 (C-3ʹʹ), 71.69 (C-4ʹʹ), 77.92 (C-5ʹʹ), 62.83 (C-6ʹʹ)
Hợp chất 4
Hợp chất 4 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C47H80O19
HR-ESI-MS: m/z: 971.5210 [M+Na]+, tính toán lý thuyết [C47H80O19Na] +
: 971.5186
1
H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.05 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-19), 1.35 (3H, s, 21), 1.32 (9H, 26, 27, 28), 0.88 (3H, s, 29), 0.94 (3H, s, H-30), 4.45 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 4.69 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1ʹʹ), 4.54 (1H, H-1ʹʹʹ)
13
(35)CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 4.1.1 Hợp chất 1: Ginsenoside F1
Hình 4.1 Cấu trúc hóa học tƣơng tác HMBC hợp chất 1 Hợp chất 1 thu đƣợc dƣới dạng dầu, phổ 1H NMR xuất tín hiệu nhóm metyl dạng singlet độ chuyển dịch δH 0.98, 1.11, 1.31, 1.37, 1.65, 1.70 ppm, tín hiệu proton anome δH 4.62 (1H, d, J = 9.0 Hz) tín hiệu proton olefin δH 5.13 (1H, t, J = 7.0 Hz)
(36)Phổ 13C NMR xuất tín hiệu 36 ngun tử cacbon tín hiệu δC 98.26 1ʹ), 75.34 2ʹ), 78.23 3ʹ), 71.19 4ʹ), 77.88 (C-5ʹ), 62.53 (C-6ʹ) đặc trƣng cho đƣờng glucose, số tƣơng tác proton anome lớn chứng tỏ cấu hình dạng β-glucose Phần aglycon với xuất tín hiệu 30 nguyên tử cacbon, có nhóm metyl δC 17.69 (C-18), 17.68 (C-19), 22.83 (C-21), 25.86 (C-26), 17.95 (C-27), 31.47 (C-28), 16.13 (C-29), 17.26 (C-30), nhóm oxymetin δC 79.52 (C-3), 68.86 (C-6), 71.77 (C-12), tín hiệu nối đơi vị trí δC 125.82 (CH, C-24)/132.28 (C, C-25) Kết hợp với phổ 1H NMR phổ HSQC cho phép nhận định triterpen khung dammaran, dạng khung phổ biến loài thuộc chi Panax
Hình Phổ 13
C NMR hợp chất 1
(37)Hình 4 Phổ HSQC hợp chất 1
(38)Hình Phổ HMBC hợp chất 1
So sánh số liệu phổ hợp chất 1 với hợp chất Notoginsenoside U [38] cho thấy hợp chất 1 đơn vị đƣờng glucose Tra cứu tài liệu DNP nhận thấy 1 hợp chất có tên gọi Ginsenoside F1, hợp chất đƣợc phân lập từ loài Panax notoginseng
Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất 1 chất so sánh
Position 1δC δCa,b DEPT δHa,c,d mult (J= Hz) HMBC(HC)
1 39.4 40.12 CH2 1.06/1.74
2 26.8 27.18 CH2 1.43/1.96
3 78.0 79.52 CH 3.15
4 40.2 40.47 C -
5 61.4 62.12 CH 0.93 d (11.0) 4, 6,
6 67.4 68.86 CH 4.06 dt (4.0, 10.5)
7 47.3 47.19 CH2 1.56/1.67
8 41.3 42.00 C -
9 49.8 50.54 CH 1.50
10 40.0 40.47 C -
11 31.1 31.60 CH2 1.10/1.63
12 70.0 71.77 CH 3.78
13 49.1 49.0 CH 1.76
14 51.6 52.33 C -
15 30.9 30.90 CH2 1.20/1.87
(39)17 51.6 53.09 CH 2.31 13, 16, 20
18 18.0 17.69 CH3 1.11 s 7, 8, 9, 14
19 18.2 17.68 CH3 0.98 s 1, 5, 9, 10
20 83.3 84.87 C -
21 22.7 22.83 CH3 1.37 s 17, 20, 22
22 36.4 36.59 CH2 1.63/1.82
23 23.3 24.19 CH2 2.10
24 126.2 125.82 CH 5.13 26, 27
25 131.3 132.28 C -
26 26.6 25.86 CH3 1.70 s 24, 25, 27
27 18.8 17.95 CH3 1.65 s 24, 25, 26
28 32.1 31.47 CH3 1.31 s 3, 4, 5, 29
29 16.8 16.13 CH3 0.98 s 3, 4, 5, 28
30 17.9 17.26 CH3 0.98 s 8, 13, 14, 15
20-Glc
1ʹ 97.5 98.26 CH 4.62 d (7.5) 20
2ʹ 74.6 75.34 CH 3.10
3ʹ 78.1 78.23 CH 3.38 t (9.0)
4ʹ 71.1 71.19 CH 3.32
5ʹ 76.2 77.88 CH 3.24
6ʹ 69.7 62.53 CH2 3.65 dd (5.0, 12.0)
3.80 dd (2.0, 12.0) 6ʹ-Glc
1ʹʹ 104.4 CH
2ʹʹ 74.8 CH
3ʹʹ 77.8 CH
4ʹʹ 71.1 CH
5ʹʹ 77.7 CH
6ʹʹ 62.1 CH2
1δ
C: số liệu phổ Notoginsenoside U đo pyridine-d5 [38] a đo CD
3OD, b125MHz, c 500MHz, ,d tín hiệu bị che khuất
dạng peak
(40)Hình Cấu trúc hóa học tƣơng tác HMBC hợp chất 2 Hợp chất 2 thu đƣợc dƣới bột màu trắng, phổ 1H NMR xuất tín hiệu nhóm metyl dạng singlet độ chuyển dịch δH 0.98, 1.02, 1.12, 1.35, 1.37, 1.65, 1.70 ppm, tín hiệu hai proton anome δH 4.37 (1H, d, J = 7.5 Hz), δH 4.62 (1H, d, J = 8.0 Hz), tín hiệu proton olefin δH 5.13 (1H, t, J = 1.5 Hz)
(41)Hình Phổ 1H NMR hợp chất 2
(42)Hình Phổ HSQC hợp chất 2
Hình 10 Phổ HMBC hợp chất 2
(43)Vị trí đơn vị đƣờng thứ đƣợc xác định C-20 dựa tƣơng tác HMBC giữa H-1ʹ với C-20, H3-21 với C-17, C-20, C-22 H-17 với C-13, C-16, C-20 Đơn vị đƣờng lại đƣợc xác định C-6 dựa tƣơng tác H3-23, H3-24 với C-3, C-4, C-5, H-6 với C-5 H-1ʹʹ với C-6 Ngồi vị trí nối đôi C-24/C-25 đƣợc xác định dựa tƣơng tác H3-26, H3-27 với C-24, C-25, H2-22 với 20, 23, C-24
So sánh số liệu phổ hợp chất 2 với hợp chất Ginsenoside Rg1 [39] cho thấy phù hợp hoàn toàn số liệu phổ vị trí tƣơng ứng đồng Nhƣ hợp chất 2 đƣợc xác định Ginsenoside Rg1, hợp chất đƣợc phân lập từ loài Panax ginseng
Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất 2 và chất so sánh Position 1δC δCa,b DEPT δHa,c,d mult (J= Hz) HMBC (HC)
1 39.6 40.19 CH2 1.08/1.78
2 28.0 27.59 CH2 1.60/1.68
3 78.8 79.87 CH 3.37
4 40.4 40.47 C -
5 61.5 61.79 CH 1.15
6 80.2 80.91 CH 4.13 m
7 45.3 45.30 CH2 1.65/2.05
8 41.3 41.83 C -
9 50.1 50.60 CH 1.50
10 39.8 40.37 C -
11 30.8 31.53 CH2 1.15/1.60
12 70.4 71.85 CH 3.67
13 49.2 49.20 CH 1.76
14 51.5 52.43 C -
15 31.0 30.96 CH2 1.20/1.88
16 26.7 27.24 CH2 1.40/1.85
17 51.8 53.12 CH 2.30 13, 16, 20
18 17.7 17.65 CH3 1.12 s 7, 8, 9, 14
19 17.9 17.81 CH3 1.02 s 1, 5, 9, 10
20 83.5 84.92 C -
21 22.5 22.84 CH3 1.37 s 17, 20, 22
22 36.2 36.63 CH2 1.65/1.82
23 23.4 24.22 CH2 2.10
(44)25 131.1 132.29 C -
26 25.9 25.85 CH3 1.70 s 24, 25, 27
27 17.7 17.95 CH3 1.65 s 24, 25, 26
28 31.8 31.40 CH3 1.35 s 3, 4, 5, 29
29 16.5 16.11 CH3 1.02 s 3, 4, 5, 28
30 17.3 17.15 CH3 0.98 s 8, 13, 14, 15
20-Glc
1ʹ 98.3 98.29 CH 4.62 d (8.0) 20
2ʹ 75.2 75.49 CH 3.23
3ʹ 78.8 77.90 CH 3.23
4ʹ 71.7 71.22 CH 3.35
5ʹ 78.2 77.63 CH 3.25
6ʹ 63.2 62.55 CH2 3.67/3.81
Glc
1ʹʹ 106.0 105.55 CH 4.37 d (7.5) 6ʹ
2ʹʹ 75.5 75.37 CH 3.10
3ʹʹ 79.6 79.06 CH 3.37
4ʹʹ 72.0 71.72 CH 3.30
5ʹʹ 79.2 78.25 CH 3.37
6ʹʹ 63.0 62.94 CH2 3.67/3.84
1δ
C: số liệu phổ Ginsenoside Rg1 đo pyridine-d5 [39], a đo CD
3OD, b125MHz, c 500MHz, d tín hiệu bị che khuất
dạng peak
4.1.3 Hợp chất 3: Notoginsenoside U
(45)Hình 12 Phổ 1H NMR hợp chất 3
Hình 13 Phổ 13C NMR hợp chất 3
(46)với xuất 30 nguyên tử cacbon, có nhóm metyl δC 17.75 (C-18), 17.62 (C-19), 22.49 (C-21), 25.93 (C-26), 18.02 (C-27), 31.47 (C-28), 16.12 (C-29), 17.40 (C-30), nhóm oxymetin δC 79.58 (C-3), 68.92 (C-6), 71.59 (C-12), tín hiệu nối đơi vị trí δC 126.02 (CH, C-24)/132.25 (C, C-25)
Hình 14 Phổ HSQC hợp chất 3
Nhƣ hợp chất 3 đƣợc xác định hợp chất saponin khung dammaran Tƣơng tác phổ HMBC H3-28, H3-29 với C-3 (δC 79.58), C-4 (δC 40.17), C-5 (δC 62.15) H-5 (δH 0.92) với C-6 (δC 68.92), C-7 (δC 47.23) chứng tỏ có xuất nhóm hydroxy C-3, C-6 Cấu hình nhóm đƣợc xác định 3β-OH 6α-OH dựa vào độ chuyển dịch hóa học C-3 (δC 79.58) số tƣơng tác Hax-6 (dd, J = 4.0, 10.5 Hz)
(47)với C-20 H-17 với C-13, C-16, C-20 Nhƣ hợp chất 3 đƣợc xác định Notoginsenoside U [38]
Hình 15 Phổ HMBC hợp chất 3
Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất 3 chất so sánh
Position 1δC δCa,b DEPT δHa,c mult (J= Hz) HMBC
1 39.4 40.10 CH2 1.07/1.75
2 26.8 27.77 CH2 1.65/1.67
3 78.0 79.58 CH 3.12
4 40.2 40.17 C -
5 61.4 62.15 CH 0.92 d (10.5)
6 67.4 68.92 CH 4.03 dd (4.0, 10.5)
7 47.3 47.23 CH2 1.57/1.63
8 41.3 42.01 C -
9 49.8 50.51 CH 1.47
10 40.0 40.49 C -
11 31.1 31.47 CH2 1.09/1.63
12 70.0 71.59 CH 3.76
13 49.1 49.85 CH 1.75
14 51.6 52.28 C -
15 30.9 30.73 CH2 1.23/1.84
(48)17 51.6 52.90 CH 2.32 13, 16, 20
18 18.0 17.75 CH3 1.09 s 7, 8, 9, 14
19 18.2 17.62 CH3 0.98 s 1, 5, 9, 10
20 83.3 84.92 C -
21 22.7 22.49 CH3 1.39 s 17, 20, 22
22 36.4 36.74 CH2 1.57/1.84
23 23.3 23.88 CH2 2.07/2.18
24 126.2 126.02 CH 5.16 t (2.0) 26, 27
25 131.3 132.25 C -
26 26.6 25.93 CH3 1.71 s 24, 25, 27
27 18.8 18.02 CH3 1.65 s 24, 25, 26
28 32.1 31.47 CH3 1.31 s 3, 4, 5, 29
29 16.8 16.12 CH3 0.98 s 3, 4, 5, 28
30 17.9 17.40 CH3 0.98 s 8, 13, 14, 15
20-Glc
1ʹ 97.5 98.11 CH 4.60 d (7.5) 20
2ʹ 74.6 75.14 CH 3.22 dd (8.0, 9.0)
3ʹ 78.1 78.55 CH 3.38
4ʹ 71.1 71.56 CH 3.38
5ʹ 76.2 76.79 CH 3.46
6ʹ 69.7 70.26 CH2 3.67 dd (5.0, 12.0)
3.88 dd (1.5, 12.0)
1ʹʹ Glc
1ʹʹ 104.4 104.98 CH 4.37 d (7.5) 6ʹ
2ʹʹ 74.8 75.30 CH 3.15
3ʹʹ 77.8 77.96 CH 3.28
4ʹʹ 71.1 71.69 CH 3.29
5ʹʹ 77.7 77.92 CH 3.28
6ʹʹ 62.1 62.83 CH2 3.67/3.88
1δ
C: số liệu phổ Notoginsenoside U đo pyridine-d5 [38], a đo CD
3OD, b125MHz, c 500MHz, d tín hiệu bị che khuất khơng thể
dạng peak
4.1.4 Hợp chất số 4: chất
Hợp chất 4 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, phổ khối lƣợng phân giải cao HRESI-MS xuất pic ion giả phân tử m/z 971.5210 [M+Na]+ Tính tốn lý thuyết cho hợp chất có CTPT [C47H80O19Na]
+
(49)Hình 16 Cấu trúc hóa học tƣơng tác HMBC hợp chất 4
(50)Hình 18 Phổ 1H NMR hợp chất 4
Phổ 13C NMR xuất tín hiệu 47 nguyên tử cacbon có đơn vị đƣờng (hai đơn vị đƣờng glucose δC 105.39 (C-1ʹ), 81.22 (C-2ʹ), 78.31 3ʹ), 71.05 4ʹ), 78.53 5ʹ), 63.12 6ʹ); 98.86 1ʹʹʹ), 75.20 (C-2ʹʹʹ), 77.91 (C-3ʹʹʹ), 71.95 (C-4ʹʹʹ), 77.69 (C-5ʹʹʹ), 62.87 (C-6ʹʹʹ) đơn vị đƣờng xylose δC 104.57 (C-1ʹʹ), 76.34 (C-2ʹʹ), 78.53 (C-3ʹʹ), 72.80 (C-4ʹʹ), 67.20 (C-5ʹʹ)) Phần aglycon với xuất 30 nguyên tử cacbon, có nhóm metyl δC 16.37 (C-18), 16.69 (C-19), 23.27 (C-21), 25.18 (C-26), 25.23 (C-27), 28.40 (C-28), 16.74 (C-29), 17.24 (C-30), nhóm oxymetin δC 71.63 (C-12), 91.30 (C-3) tín hiệu nối đơi dạng
(51)Hình 19 Phổ 13C NMR hợp chất 4
(52)Phân tích phổ COSY cho phép xác định mảnh 1/2/3, H-5/H-6/H-7, H-9/H-11/H-12/H-13, H-15/H-16/H-17, H-22/H-23/H-24 nhƣ xác định xác liên kết đơn vị đƣờng
Hình 21 Phổ COSY hợp chất 4
Phần aglycon 4 đƣợc so sánh với hợp chất floralginsenoside F [40] cho thấy có phù hợp hồn tồn vị trí tƣơng ứng
(53)Hình 22 Phổ HMBC hợp chất 4
Hình 23 Phổ NOESY hợp chất 4
(54)-xylopyranosyl-(12)-β-glucopyranosyl)-20-O-β-glucopyranosyl-3β,12β ,20-trihydroxy-25-hydroperoxy-dammar-23-ene
Bảng 4 Số liệu phổ NMR hợp chất 4 chất so sánh
Position 1δC 2δC δCa,b DEPT δHa,c mult (J= Hz) HMBC
1 39.3 40.25 CH2 1.03/1.75
2 26.8 27.02 CH2 1.76/2.00
3 88.9 91.30 CH 3.20 1ʹ
4 39.8 40.58 C -
5 56.5 57.57 CH 0.80 d (11.0) 4, 6,
6 18.5 19.25 CH2 1.50/1.58
7 35.2 35.87 CH2 1.30/1.58
8 40.2 41.04 C -
9 50.2 51.05 CH 1.47
10 37.1 37.92 C -
11 31.1 31.00 CH2 1.30/1.82
12 70.5 71.63 CH 3.70
13 49.7 49.85 CH 1.80
14 51.6 52.52 C -
15 30.7 31.41 CH2 1.03/1.60
16 26.5 27.25 CH2 1.42/1.88
17 52.3 53.00 CH 2.30 13, 16, 20
18 16.0 16.37 CH3 1.05 s 7, 8, 9, 14
19 16.3 16.69 CH3 0.95 s 1, 5, 9, 10
20 83.2 84.38 C -
21 23.3 23.27 CH3 1.35 s 17, 20, 22
22 39.7 40.25 CH2 2.47/2.58
23 126.6 127.36 CH 5.77 m
24 138.1 138.24 CH 5.69 d (17.0) 26, 27
25 81.3 82.40 C -
26 25.2 25.18 CH3 1.32 s 24, 25, 27
27 25.4 25.23 CH3 1.32 s 24, 25, 26
28 28.2 28.40 CH3 1.32 s 3, 4, 5, 29
29 16.8 16.74 CH3 0.88 s 3, 4, 5, 28
30 17.2 17.24 CH3 0.94 s 8, 13, 14,
15 3-glc
1ʹ 103.5 105.39 CH 4.45 d (7.5)
2ʹ 80.4 81.22 CH 3.58 1
3ʹ 78.8 78.31 CH 3.30
4ʹ 71.3 71.05 CH 3.30
(55)6ʹ 62.9 63.12 CH2 3.67/3.85 4, 5
Xyl
1ʹʹ 104.54 104.57 CH 4.69 d (8.0) 2ʹ
2ʹʹ 76.34 76.34 CH 3.23
3ʹʹ 78.8 78.53 CH 3.58
4ʹʹ 71.7 72.80 CH 3.45
5ʹʹ 67.3 67.20 CH2 3.58/3.83 3ʹʹ, 4ʹʹ
20-Glc
1ʹʹʹ 98.86 CH 4.54 20
2ʹʹʹ 75.20 CH 3.10
3ʹʹʹ 77.91 CH 3.30
4ʹʹʹ 71.95 CH 3.24
5ʹʹʹ 77.69 CH 3.30
6ʹʹʹ 62.87 CH2 3.67/3.85 4ʹʹʹ, 5ʹʹʹ
1δ
C: số liệu phổ phần aglycon Floralginsenoside F đo pyridine-d5 [40] 2δ
C: số liệu phổ phần đường majonoside-R2, đo pyridine-d5 [41] a đo CD
3OD, b125MHz, c 500MHz, d tín hiệu bị che khuất khơng thể
(56)Cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc từ hoa tam thất Panax
pseudoginseng Wall
Ginsenoside F1 (1)
Ginsenoside Rg1 (2)
(57)
KẾT LUẬN
1 Đã tiến hành thu thập xác định tên khoa học mẫu hoa tam thất
Panax pseudoginseng Wall phục vụ nghiên cứu thành phần hóa học
2 Từ phần cặn nƣớc mẫu hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall., phƣơng pháp sắc ký kết hợp với hệ dung mơi thích hợp chiết tách, phân lập đƣợc hợp chất saponin khung dammarane có hợp chất Cấu trúc hóa học hợp chất đƣợc xác định cách kết hợp số liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều, hai chiều Cụ thể nhƣ sau:
+ Hợp chất 1: Ginsenoside F1 + Hợp chất 2: Ginsenoside Rg1
(58)KIẾN NGHỊ
(59)TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Chi V.V., 2012, Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 768
2 Armen T., 2009, Flowering plants, Springer Science & Business Media, pp 1-572
3 Escobar-Sánchez M.L., Sánchez-Sánchez L and Sandoval-Ramírez J., 2015, Steroidal saponins and cell death in cancer, Cell Death—
Autophagy, Apoptosis and Necrosis, pp 331-352
4 Bai M., Mao Q., Xu J.-D., Zhu L.-Y., Zhu H., Wang Q and Li S.-L., 2014, Advance in saponins of aerial parts of Panax species, China journal of
Chinese materia medica, 39(3), pp 412-422
5 Zhu G.Y., Li Y.W., Kwok‐Po Hau D., Jiang Z.H., Yu Z.L and Fong W.F., 2011, Acylated protopanaxadiol‐type ginsenosides from the root of Panax ginseng, Chemistry & biodiversity, 8(10), pp 1853-1863
6 Tung N.H., Song G.Y., Kim J.-A., Hyun J.-H., Kang H.-K and Kim Y.H., 2010, Dammarane-type saponins from the flower buds of Panax ginseng
and their effects on human leukemia cells, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20(1), pp 309-314
7 Li K., Li S., Xu F., Cao G and Gong X., 2020, A novel acylated quercetin glycoside and compounds of inhibitory effects on α-glucosidase from
Panax ginseng flower buds, Natural Product Research, 34(18), pp
2559-2565
8 Qiu S., Yang W.Z., Yao C.L., Shi X.J., Li J.Y., Lou Y., Duan Y.N and Wu W.Y., 2017, Malonylginsenosides with Potential Antidiabetic Activities from the Flower Buds of Panax ginseng, Journal Natural Products, 80(4), pp 899-908
(60)roots of Panax bipinnatifidus, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420
10 Wei J.X., Wang J.F., Chang L.Y and Du Y.C., 1980, Chemical studies of san-chi Panax notoginseng (Burk.) F H Chen I Studies on the constituents of San-Chi root hairs, Yao Xue Xue Bao, 15(6), pp 359-364 11 Kim J.A., Son J.H., Song S.B., Yang S.Y and Kim Y.H., 2013, Sterols
isolated from seeds of Panax ginseng and their antiinflammatory activities, Pharmacognosy Magazine, 9(34), pp 182-185
12 Zheng Y., 2004, Studies on flavonoids from stems and leaves of Panax notoginseng, Jilin University
13 Yun T.K., Lee Y.S., Lee Y.H., Kim S.I and Yun H.Y., 2001, Anticarcinogenic effect of Panax ginseng C.A Meyer and identification of active compounds, Journal of Korean Medical Science, 16, pp S6-18 14 Yang Z.G., Sun H.X and Ye Y.P., 2006, Ginsenoside Rd from Panax
notoginseng is cytotoxic towards HeLa cancer cells and induces
apoptosis, Chemistry & Biodiversity, 3(2), pp 187-197
15 Lin Z.Y., Chen L.M., Zhang J., Pan X.D., Zhu Y.G., Ye Q.Y., Huang H.P and Chen X.C., 2012, Ginsenoside Rb1 selectively inhibits the activity of L-type voltage-gated calcium channels in cultured rat hippocampal neurons, Acta Pharmacologica Sinica, 33(4), pp 438-444
16 Gao B., Shi H.L., Li X., Qiu S.P., Wu H., Zhang B.B., Wu X.J and Wang Z.T., 2014, p38 MAPK and ERK1/2 pathways are involved in the pro-apoptotic effect of notoginsenoside Ft1 on human neuroblastoma SH-SY5Y cells, Life Sciences, 108(2), pp 63-70
17 Li H., Gu L., Zhong Y., Chen Y., Zhang L., Zhang A.R., Sobol R.W., Chen T and Li J., 2016, Administration of polysaccharide from Panax
notoginseng prolonged the survival of H22 tumor-bearing mice, Onco
(61)18 Lee Y.S., Chung I.S., Lee I.R., Kim K.H., Hong W.S and Yun Y.S., 1997, Activation of multiple effector pathways of immune system by the antineoplastic immunostimulator acidic polysaccharide ginsan isolated from Panax ginseng, Anticancer Research, 17(1a), pp 323-331
19 Ye H., Wu Q., Zhu Y., Guo C and Zheng X., 2014, Ginsenoside Rh2 alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis via augmenting TGFβ signaling, Molecular Biology Reports, 41(8), pp 5485-5490
20 Park S.H., Seo W., Eun H.S., Kim S.Y., Jo E., Kim M.H., Choi W.M., Lee J.H., Shim Y.R., Cui C.H., Kim S.C., Hwang C.Y and Jeong W.I., 2016, Protective effects of ginsenoside F2 on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced skin inflammation in mice,
Biochemical and Biophysical Research Communications, 478(4), pp
1713-1719
21 Xu D., Wang C., Zhao W., Gao S and Cui Z., 2017, Antidepressant-like effects of ginsenoside Rg5 in mice: Involving of hippocampus BDNF signaling pathway, Neuroscience Letters, 645, pp 97-105
22 Tam D.N.H., Truong D.H., Nguyen T.T.H., Quynh L.N., Tran L., Nguyen H.D., Shamandy B.E., Le T.M.H., Tran D.K., Sayed D., Vu V.V., Mizukami S., Hirayama K and Huy N.T., 2018, Ginsenoside Rh1: A Systematic Review of Its Pharmacological Properties, Planta Medica, 84(3), pp 139-152
23 Chen L., Zhou L., Huang J., Wang Y., Yang G., Tan Z., Wang Y., Zhou G., Liao J and Ouyang D., 2017, Single- and Multiple-Dose Trials to Determine the Pharmacokinetics, Safety, Tolerability, and Sex Effect of Oral Ginsenoside Compound K in Healthy Chinese Volunteers, Frontiers in Pharmacology, 8, pp 965
(62)Animals with Different Ginsenosides Metabolizing Activity, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 65(2), pp 327-337
25 Kim K.A., Yoo H.H., Gu W., Yu D.H., Jin M.J., Choi H.L., Yuan K., Guerin-Deremaux L and Kim D.H., 2014, Effect of a soluble prebiotic fiber, NUTRIOSE, on the absorption of ginsenoside Rd in rats orally administered ginseng, Journal Ginseng Research, 38(3), pp 203-207 26 Del Prete A., Scalera A., Iadevaia M.D., Miranda A., Zulli C., Gaeta L.,
Tuccillo C., Federico A and Loguercio C., 2012, Herbal products: benefits, limits, and applications in chronic liver disease, Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine, 2012, pp 837939
27 Dhiman A., Nanda A and Ahmad S., 2012, A recent update in research on the antihepatotoxic potential of medicinal plants, Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao, 10(2), pp 117-127
28 Qi Z., Wang Z., Zhou B., Fu S., Hong T., Li P and Liu J., 2020, A new ocotillol-type ginsenoside from stems and leaves of Panax quinquefolium
L and its anti-oxidative effect on hydrogen peroxide exposed A549 cells,
Natural Product Research, 34(17), pp 2474-2481
29 Lian X.Y., Zhang Z and Stringer J.L., 2006, Anticonvulsant and neuroprotective effects of ginsenosides in rats, Epilepsy Research, 70(2-3), pp 244-256
30 Zhang Z., Yang J., Liu C., Xie J., Qiu S., Yang X and Wu C., 2019, Pseudoginsenoside-F11 alleviates cognitive deficits and Alzheimer's disease-type pathologies in SAMP8 mice, Pharmacological Research, 139, pp 512-523
(63)32 Sun H.X., Pan H.J and Pan Y.J., 2003, Haemolytic activities and immunologic adjuvant effect of Panax notoginseng saponins, Acta
Pharmacologica Sinica, 24(11), pp 1150-1154
33 Yang M., 2009, Ginseng can also cause arrhythmia, Jian Kang Ren Sheng, (01), pp 34
34 Lei X.L and Chiou G.C., 1986, Cardiovascular pharmacology of Panax
notoginseng (Burk) F.H Chen and Salvia miltiorrhiza,
The American Journal of Chinese Medicine, 14(3-4), pp 145-152
35 Dong T.T., Cui X.M., Song Z.H., Zhao K.J., Ji Z.N., Lo C.K and Tsim K.W., 2003, Chemical assessment of roots of Panax notoginseng in China: regional and seasonal variations in its active constituents, Journal of Agricultural and Food ChemistryJournal, 51(16), pp 4617-4623
36 Mogil J.S., Shin Y.H., McCleskey E.W., Kim S.C and Nah S.Y., 1998, Ginsenoside Rf, a trace component of ginseng root, produces antinociception in mice, Brain Research, 792(2), pp 218-228
37 Luo H., Zhu D., Wang Y., Chen Y., Jiang R and Yu P., 2018, Study on the Structure of Ginseng Glycopeptides with Anti-Inflammatory and Analgesic Activity, Chinese Journal of New Drugs, 23(6), pp
38 Sun H., Ye Y and Pan Y., 2005, Immunological-adjuvant saponins from the roots of Panax notoginseng, Chemistry and Biodiversity, 2(4), pp 510-515
39 Dong-Sa K., Yun-Jung C., Zedk U., Ping Z., Yu-Qing L and Chong-Ren Y., 1995, Dammarane saponins from Panax ginseng, Phytochemistry, 40(5), pp 1493-1497
(64)ginseng, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 55(4), pp 571-576