Xác định tác nhân cầu khuẩn gây bệnh mù mắt trên cá bớp (rachycentron canadum linnaeus, 1766) nuôi lồng tại khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ TƯỜNG HẠNH “XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN CẦU KHUẨN GÂY BỆNH MÙ MẮT TRÊN CÁ BỚP (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766) NI LỒNG TẠI KHÁNH HỊA” LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ TƯỜNG HẠNH XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN CẦU KHUẨN GÂY BỆNH MÙ MẮT TRÊN CÁ BỚP (Rachycentron canadum, Linne 1766) NUÔI LỒNG TẠI KHÁNH HỊA” LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành Ni trồng thủy sản Mã số 60620301 Quyết định giao đề tài: 386/QĐ-ĐHNT ngày 20/04/2017 Quyết định thành lập HĐ: 139/QĐ-ĐHNT ngày 28/02/2018 Ngày bảo vệ: 16/03/2018 Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN VĨ HÍCH Chủ tịch Hội đồng TS LỤC MINH DIỆP Phịng đào tạo sau đại học: KHÁNH HỊA – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, kết thu luận văn kết nghiên cứu đề tài “Đánh giá hiệu bảo hộ vaccine bất hoạt việc phòng bệnh mù mắt liên cầu khuẩn gây cá bớp (Rachycentron canadum) ni Khánh Hịa” Tơi Chủ nhiệm dự án cho phép sử dụng tất số liệu nghiên cứu cho luận văn Tơi xin cam đoạn số liệu hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày 22 tháng 01 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tường Hạnh iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, cố gắng thân, nhận nhiều giúp đỡ quan cá nhân Với tất lòng chân thành biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn tới: Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Khoa Sau Đại học tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Tiến sĩ Trần Vĩ Hích – Giám đốc Trung tâm Giống Dịch bệnh thủy sản, người định hướng nghiên cứu, động viên tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn tới Giám đốc Bùi Quang Minh – Trung tâm Giống thủy sản Quảng Nam tạo điều kiện thời gian, vật chất lẫn tinh thần cho suốt trình học tập làm việc Cám ơn anh, chị Trung tâm nghiên cứu Giống Dịch bệnh Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình làm đề tài trung tâm Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 22 tháng 01 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tường Hạnh iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x LỜI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học tình hình ni cá bớp .3 1.1.1 Một số đặc điểm sinh học 1.1.2 Tình hình ni cá bớp giới Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình ni cá bớp giới 1.1.2.2 Tình hình ni cá bớp Việt Nam 1.2 Các bệnh thường gặp cá bớp 1.2.1 Bệnh virus 1.2.2 Bệnh ký sinh trùng 1.2.3 Bệnh vi khuẩn 11 1.2.3.1 Tình hình bệnh cầu khuẩn Streptococcus ni trồng thủy sản 13 1.2.3.2 Đặc điểm bệnh Streptococcus inae cá nuôi 14 1.3 Tình hình bệnh mù mắt cá bớp 16 1.4 Phòng trị bệnh vi khuẩn Streptococcus iniae gây cá nuôi 17 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu .19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Mơi trường, hóa chất 20 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Tình hình bệnh mù mắt cá bớp ni Khánh Hịa 20 2.4.1.1 Phương pháp thu mẫu 20 v 2.4.1.2 Phương pháp xác định tỷ lệ mắc bệnh 21 2.4.2 Đặc điểm chủng cầu khuẩn thu từ cá bớp nuôi Khánh Hòa 21 2.4.2.1 Phân lập vi khuẩn từ cá bớp ni Khánh Hịa 21 2.4.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn 22 2.4.2.3 Xác định độc lực chủng phân lập 26 2.4.3 Xác định độ nhạy vi khuẩn với kháng sinh 28 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tình hình bệnh mù mắt cá bớp Khánh Hòa .29 3.2 Đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập 33 3.2.1 Đặc điểm hình thái 33 3.2.2 Đặc điểm sinh hóa 35 3.2.3 Đặc điểm protein kháng nguyên vi khuẩn 37 3.2.4 Tính tương đồng kháng nguyên chủng liên cầu khuẩn phân lập 38 3.3 Xác định độc lực vi khuẩn S iniae phân lập từ cá bệnh 41 3.4 Kết kiểm tra độ nhạy vi khuẩn với kháng sinh 46 4.1 Kết luận 48 4.2 Đề xuất ý kiến 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 58 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ Tiếng Việt (nếu có) APS Amoni persunfate BA Blood Agar Môi trường thạch máu CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc ĐC Đối chứng DTT Dithiothreitol FKC Formalin – Killed cell Tế bào vi khuẩn bất hoạt Formalin H Giờ IP Intraperitoneal Injection kDa Kilo Dalton KF KF-Streptococcus agar LD50 Lethal Dose 50% Tiêm vào xoang bụng Liều gây chết 50% N Tổng số mẫu NT Nghiệm thức PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối sinh lý đệm Phosphate ppm Part per million Một phần triệu ppt Part per thousand Một phần nghìn SDS- Sodium Dodecyl Sulfate- Điện di gel polyacrylamide có SDS PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED N,N,N,N’– Tetramethylethylenediamine TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth Xg Gravity vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết kiểm tra lâm sàng mẫu cá bị bệnh mù mắt thu Khánh Hòa 30 Bảng 3.2 Nguồn phân lập chủng S iniae từ cá bớp ni Khánh Hịa 31 Bảng 3.3 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập so với chủng tham chiếu ATCC 29178 Bergey (1:VN080317; 2: CR110317; 3: VN180317; 4: CR050417; 5: VN110417, 6: CR210417, 7: CR120517; 8: VN180517; 9: chủng ATCC 29178; 10: Bergey) 36 Bảng 3.4 Kết ngưng kết huyết cá bớp với chủng S iniae 39 Bảng 3.5 Khảo sát độ nhạy chủng S iniae phân lập từ cá bệnh số loại kháng sinh ba chủng CR050417, CR120517, VN180517 .46 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá bớp .3 Hình 1.2 Sản lượng ni cá bớp tồn cầu giai đoạn 1950 – 2015 (tấn) Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 19 Hình 2.2 Sơ đồ xác định độc lực chủng vi khuẩn phân lập 26 Hình 3.1 Tỷ lệ cá bị bệnh (n = 32) .29 Hình 3.2 Tỷ lệ mắc loại bệnh cá bớp ( n = 13) 30 Hình 3.3 Một số dấu hiệu bệnh lý bên cá bớp bị nhiễm S iniae (A: thân sẫm màu, xuất huyết đuôi; B: mắt lồi xuất huyết; C: mắt bị đục) 32 Hình 3.4 Dấu hiệu bệnh lý bên cá bớp nhiễm S iniae (A: gan xuất huyết; B: gan sưng, tích dịch xoang bụng; C: lách sẫm màu; D: thận sau sưng) 33 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái chủng Streptococcus sp phân lập từ mẫu bệnh phẩm (A): khuẩn lạc môi trường TSA+; (B): vi khuẩn nhuộm Gram; (C): vi khuẩn hình thành chuỗi dài môi trường TSB+; (D): khuẩn lạc mơi trường BA+ Độ phóng đại X40 34 Hình 3.6 Mẫu phết nhuộm Gram từ não (A) thận (B) cá bị mù mắt (Độ phóng đại X40) 34 Hình 3.7 Phân tích SDS-PAGE protein tế bào vi khuẩn S iniae phương pháp sóng siêu âm (A); phương pháp kết hợp sóng siêu âm hỗn hợp mutanolysine (B) (1: VN180517, 2: CR050417, 3: CR120517) 37 Hình 3.8 Hiệu giá kháng thể huyết cá bớp chủng S iniae khác 39 Hình 3.9 Dấu hiệu bệnh lý cá thí nghiệm sau tiêm S iniae vào xoang bụng (A: mắt đục, xơ vây đuôi, B: mắt lồi, xuất huyết; C: gan sưng, xuất huyết) 42 Hình 3.10 Tỷ lệ chết tích lũy nhóm cá thí nghiệm sau tiêm S iniae vào xoang bụng nồng độ khác 43 Hình 3.11 Tương quan nồng độ vi khuẩn S iniae tiêm vào cá tỷ lệ chết tích lũy nhóm cá thjí nghiệm Điểm có hệ số mũ nồng độ gây chết 50% cá thí nghiệm ( ) 44 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Cá bớp lồi có giá trị kinh tế, chất lượng cao, thị trường ưa chuộng Nhờ đặc điểm sinh trưởng nhanh, có khả chịu đựng sóng gió tốt, thích nghi với biến đổi mơi trường nên trở thành đối tượng nuôi phổ biến nước ta Tuy nhiên bùng phát dịch bệnh ảnh hưởng không nhỏ đến nghề nuôi cá bớp, năm gần tỷ lệ tử vong cao cá bớp bệnh mù mắt Nhiều nghiên cứu cho thấy diện chủng Streptococcosis cá bị mù mắt Chính vây, đề tài “ Xác định tác nhân cầu khuẩn gây bệnh mù mắt cá bớp (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766) nuôi lồng Khánh Hòa” thực với mục tiêu: Xác định tác nhân cầu khuẩn gây bệnh mù mắt cá bớp ni lồng Khánh Hịa Nội dung nghiên cứu đề tài: Tình hình bệnh mù mắt cá bớp ni Khánh Hịa Nghiên cứu đặc điểm chủng cầu khuẩn thu từ cá bớp nuôi Khánh Hòa Kiểm tra độ nhạy vi khuẩn với kháng sinh Nghiên cứu đạt kết quả: Kiểm tra phân tích 32 đàn cá thu Khánh Hòa, tần suất cá mắt bệnh mù mắt 6/32, tỷ lệ cá bệnh mù mắt chiếm 46,15% quần đàn cá bệnh Tỷ lệ cá bớp bị bệnh mù mắt bị nhiễm Streptococcus iniae 22,22% Trong thời gian nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Streptococcus iniae từ cá bớp nuôi Khánh Hịa Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập trình tự 16S rDNA cho kết tương đồng với chủng Streptococcus iniae công bố từ trước Trong thí nghiệm protein có khối lượng phân tử khoảng 22, 26, 32, 35, 46, 55, 65, 70, 80, 100 kDa Thành phần protein chủng Streptococcus iniae phân lập có mức độ tương đồng cao, có khác biệt chủng VN180517 so với chủng CR050417, CR120517 protein có khối lượng khoảng 46 50 kDa Các chủng Streptococcus iniae phân lập có độc tính cao cá bớp, liều gây chết 50% (LD50) 104, 104,7, 103,3 CFU/cá x kháng sinh khảo sát thí nghiệm Điều chứng tỏ có kháng kháng sinh chủng S iniae phân lập khu vực Theo Sun cộng (2007), S.iniae nhạy cảm với kháng sinh Penicillin, trung gian kháng clindamycin [59] Báo cáo Deng cộng (2015), S iniae kháng 6/20 loại kháng sinh khảo sát có streptomycin, norfloxacin, gentamicin, kanamycin khảo sát thí nghiệm [25] Các kháng sinh gentamicin, norfloxacine, penicillin, Suanyuk cộng (2010) thử nghiệm chủng S iniae phân lập cá chẽm rô phi đỏ (Thái Lan), kết nhạy cảm ngoại trừ kháng sinh nalidixic acid, oxolinic acid [58] Có thể nói rằng, tượng kháng kháng sinh chủng S iniae khu vực hạn chế, việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh có hiệu cao Trong nghiên cứu bệnh S iniae cá hồng mỹ, Mmanda cộng (2014) [43] thử nghiệm độ nhạy S iniae 20 loại kháng sinh, kết có độ nhạy cao tất loại kháng sinh Trong có tương đồng doxycylin, norfloxacin Streptomycin, kanamycin, gentamicin mẫn cảm với vi khuẩn bị kháng mẫn cảm thấp với vi khuẩn thí nghiệm Chủng ATCC 29178 báo cáo kháng với kanamycin, nalidixic acid streptomycin Khi so sánh với kết tác giả, kết thí nghiệm có tương đồng khả chống lại số loại kháng sinh Tuy nhiên, mức độ kháng kháng sinh chủng phân lập so với nghiên cứu trước có khác biệt (tăng khả kháng kháng sinh) Có thể tình hình sử dụng kháng sinh nuôi trồng thủy sản khác quốc gia Nhưng nhìn chung chủng S iniae phân lập Khánh Hòa nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh Ngoài kháng sinh thử nghiệm, có kháng sinh ampicillin, amoxycilin, ciprofloxacin, erythromycin, neomycin, oxytetracycline, trimethoprim , sulphamethoxazol nhạy cảm với chủng vi khuẩn S iniae Yanong Francis-Floyd sử dụng amoxxycilin erythromycin điều trị Streptococus cho thấy hiệu sử dụng [66] Các tác giả Pier Madin [48], Sun cộng [59], Suanyuk cộng [58], Trần Vĩ Hích [12] đề cập đến Tuy nhiên, loại kháng sinh nằm danh mục hóa chất hạn chế sử dụng (Thơng tư 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25/02/2014) Do vậy, việc sử dụng kháng sinh điều trị S.iniae cần kiểm soát chặt chẽ để tránh việc tạo nên chủng kháng kháng sinh 47 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận Khi thu mẫu ngẫu nhiên Khánh Hòa, xác định 40,63% cá bị bệnh mù mắt chiếm 46, 15% Trong thời gian nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn S iniae Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập trình tự 16S rDNA cho kết tương đồng với chủng S iniae công bố từ trước Thành phần protein chủng S iniae phân lập có mức độ tương đồng cao, có khác biệt chủng VN180517 so với chủng CR050417, CR120517 protein có khối lượng khoảng 46 50 kDa Huyết thu từ cá bớp sau kích thích miễn dịch chủng vi khuẩn CR050417, VN180517 cho khả ngưng kết với thân chủng vi khuẩn nguyên liệu cao Các chủng Streptococcus iniae phân lập có độc tính cao cá bớp, liều gây chết 50% (LD50) gây nhiễm chủng CR050417, CR120517, VN180517 104, 104,7, 103,3 CFU/cá Các chủng Streptococcus iniae phân lập từ cá bớp bệnh nhạy cảm với kháng sinh amoxycilin, ciprofloxacin, clindamycin, doxycyline, norfloxacin, penicilin, rifampin Kháng với cephalexin, nalidixic acid streptomycin 48 4.2 Đề xuất ý kiến Cần tiến hành kỹ thuật western blot để xác định protein kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng trị bệnh Streptococcus iniae gây cá bớp nuôi 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Thị Hịa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út Nguyễn Thị Nguyệt Huệ Các loại bệnh thường gặp cá biển ni Khánh Hịa Tạp chí Khoa Học – Cơng Nghệ Thủy Sản 2008; số 2:1623 Trường Đại học Nha Trang Bùi Quang Tề Giáo trình Bệnh học thủy sản Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I Hà Nội: Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp; 2008:255 trang Đỗ Văn Khương Nghiên cứu công nghệ sản xuất giống ni số lồi cá biển có giá trị kinh tế cao điều kiện Việt Nam Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước Viện Nghiên cứu Hải sản, Bộ Thủy sản; 2001:76 trang Đồng Thanh Hà, Nguyễn Viết Khuê, Nguyễn Thị Hạnh Một số đặc điểm Streptococcus agalactiae – Tác nhân gây bệnh Streptococcosis cá Rô phi miền Bắc Việt Nam Hội nghị sinh viên cán trẻ nghiên cứu khoa học tồn quốc ngành ni trồng thủy sản 2011 Lê Xân, Nguyễn Thị Xuân Thu, Huỳnh Quang Năng ctv Kỹ thuật nuôi trồng số đối tượng nuôi trồng thủy sản biển Hà Nội: Nhà xuất Nông nghiệp; 2003:95 trang Lê Thanh Cần, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2015 Một số đặc điểm bệnh học cá Bớp (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766) ni thâm canh Nha Trang Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ 2015; 38(1):53 – 60 Lý Văn Khánh, Lê Quốc Việt, Võ Nam Sơn, Trần Thanh Sơn, Nguyễn Văn Hiển Trần Ngọc Hải, 2015 Hiện trạng kỹ thuật nghề nuôi cá lồng quần đảo Nam Du, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ 2015;37(1):97 – 104 Phạm Hồng Quân Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Streptococcus gây bệnh xuất huyết cá Rô phi nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam [Luận văn thạc sĩ, Chuyên ngành ni trồng thủy sản] Khánh Hịa: Trường Đại học Nha Trang; 2013 Phan Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Hằng Bệnh ký sinh trùng cá song, cá giị ni Quảng Ninh Hải Phịng Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trường bệnh động vật thủy sản Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I; 2004 50 10 Trần Ngọc Hải, Nguyễn Thanh Phương Giáo trình Kỹ thuật sản xuất giống ni cá biển Cần Thơ: Trường Đại học Cần Thơ; 2006: 67 trang 11 Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên Bệnh hoại tử thần kinh cá biển ni Khánh Hịa Tạp chí khoa học – Cơng nghệ Thủy sản 2008;1:19 – 24 12 Trần Vĩ Hích Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch 1790) vi khuẩn Streptococcus iniae [Luận án Tiến sĩ Nơng nghiệp, Chun ngành ni trồng thủy sản] Khánh Hịa: Trường Đại học Nha Trang; 2014:170 trang 13 Từ Thanh Dung, Nguyễn Bảo Trung, Phan Văn Út 2017 Hiện trạng nhiễm ký sinh trùng cá bớp (Rachycentron canadum ) ni lồng tỉnh Kiên Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2017; 51(B):106 – 116 14 Vũ Đặng Hạ Quyên, Trần vỹ Hích, Nguyễn Hữu Dũng, Wergeland HI So sánh phương pháp phá hủy thành tế bào vi khuẩn Streptococcus iniae sử dụng trình phân tách protein SDS-PAGE Khánh Hịa: Tạp chí khoa học - Trường đại học Nha Trang; 2013 Tiếng Anh 15 Aamri FEl, Padilla D, Acosta F, Caballero MJ, Roo J, Bravo J, Vivas J, Real F First report of Streptococcus iniae in red porgy (Pagrus pagrus, L.) Journal of Fish Diseases 2010;33(11):901-905 16 Abdelsalam M, Chen SC, Yoshida T Dissemination of streptococcal pyrogenic exotoxin G (spegg) with an IS-like element in ¢sh isolates of Streptococcus dysgalactiae FEMS Microbiol Lett 2010;309(1):105–113 17 Abdelsalam M, Chen SC, Yoshida T Phenotypic and genetic characterizations of Streptococcus dysgalactiae strains isolated from fish collected in Japan and other Asian countries FEMS Microbiol Lett 2010;302(1):32–38 18 Bachrach G, Zlotkin A, Hurvitz A, Evans DL, Eldar A Recovery of Streptococcus iniae from Diseased Fish Previously Vaccinated with a Streptococcus Vaccine Applied and Enviromental Microbiology 2001;67(8):3756 – 3758 19 Brenner, D.J., Krieg, N.R., Garrity, G.M and Staley, J.T., eds (2005), Bergey's manual of systematic bacteriology, The proteobacteria, New York, Springer 51 20 Bromage ES, Owens L Infection of barramundi Lates calcarifer with Streptococcus iniae: effects of different routes of exposure Diseases of aquatic organisms 2002;52:199–205 21 Bromage ES, Thomas A, Owens L Streptococcus iniae, a bacterial infection in barramundi Late calcarifer Disease of Aquatic Organisms 1999;36:177 – 181 22 Bunkley-Williams L, Williams EH New records of parasites for culture Cobia, Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae) in Puerto Rico Revista de Biologia Tropical 2006;54(suppl 3):1–7 23 Chu KB, Abdulah A, Abdullah SZ, Bakar RA A Case Study on the Mortality of Cobia (Rachycentron canadum) Cultured in Traditional Cages Tropical Life Sciences Research 2013;24(2):77–84 24 Coriolano MC, Coelho LCBB Cobia (Rachycentron canadum): a marine fish native to Brazil with biological characteristics to captive environment Advances in Environmental Research 2015;26:119 – 132 25 Deng ML, Yu ZH, Geng Y, Wang KY, Chen DF, Huang XL, Ou Y, Chen ZL, Zhong ZJ, Lai WM Outbreaks of Streptococcosis associated with Streptococcus iniae in Siberian sturgeon (Acipenser baerii) in China Aquaculture Research 2015:1–11 26 Eldar A, Bejerano Y, Bercovier H Streptococcus shiloi and Streptococcus difficile: Two new streptococcal species causing a meningoencephalitis in fish Current Microbiology 1994; 28:139-143 27 Estradaa UR , Yasumarua FA, Tacona AGJ, Lemosa D Cobia (Rachycentron canadum): A Selected Annotated Bibliography on Aquaculture, General Biology and Fisheries 1967 – 2015 Reviews in fisheries science & aquaculture 2016;24(1):1 – 97 28 Garcia-Gomez R, Kinch J Pathogen and Ecological Risk Analysis for the introduction of Cobia (Rachycentron canadum) from the Philippines into Papua New Guinea National fisheries authority, Papua New Guinea 2011:52 page 29 Guo JJ, Kuo CM, Hong JW, Chou RL, Lee YH, Chen TI The effects of garlicsupplemented diets on antibacterial activities against Photobacterium damselae subsp piscicida and Streptococcus iniae and on growth in Cobia, Rachycentron canadum Aquaculture 2015;435:111–115 30 Hagiwara H, Takano R, Noguchi M, Narita M A study of the lesions induced in Seriola dumerili by intradermal or intraperitoneal injection of Streptococcus dysgalactiae J Comp Pathol 2009;140:35–40 52 31 Hawke JP Photobacteriosis Department of Pathobiological Sciences School of Veterinary Medicine Louisiana State University Baton Rouge, LA 70803 2012 32 Hoshina T, Sano T, Morimoto T A Streptococcus pathogenic to fish Journal of the Tokyo University of Fisheries 1958; 44:57–68 33 Huang HY, Chen YC, Wang PC, Tsai MA, Yeh SC, Liang HJ, Chen SC Efficacy of a formalin-inactivated vaccine against Streptococcus iniae infection in the farmed grouper Epinephelus coioides by intraperitoneal immunization Vaccine 2014;32(51):7014-7020 34 Jeong YU, Subramanian D, Jang YH, Kim DH, Park SH, Park KI, Lee YD, Heo MS Protective efficiency of an inactivated vaccine against Streptococcus iniae in olive flounder, Paralichthys olivaceus Arch Pol Fish 2016;24: 23-32 35 Kaiser JB, Holt JG Cultured Aquatic Species Information Programme In: FAO Fisheries and Aquaculture Department [online] Rome Updated 23 May 2007 [Cited 19 January 2018] Available from: URL:http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Rachycentron_canadum/en 36 Klesius, PH, Shoemaker CA, Evans JJ Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia (Oreochromis niloticus) Aquaculture 2000;188:237–246 37 Lee P, Dutney L, Elizur A, Poole S, Forrest A, Moloney J, Mitris M The Development of an Australian Cobia Aquaculture Industry Australian Government Fisheries Research and Development Corporation 2015;No 2011/724 38 Liao, IC, Huang, TS, Tsai WS, Hsuehd, CM, Chang SL, Leano EM Cobia culture in Taiwan: current status and problems Aquaculture 2004;237:155–165 39 Lopez C, Rajan PR, Lin JH, Kuo T, Yang H Disease outbreak in seafarmed cobia (Rachycentron canadum) associated with Vibrio spp., Photobacterium damselae ssp piscicida, mongenean and myxosporean parasites Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 2002; 22(3):206–211 40 Machen JW Vibrio spp disinfection and immunization of cobia (Rachycentron canadum) for the prevention of disease in aquaculture facilities [ Master in Science, Biomedical Veternary Science] Blacksburg, Virginia: The faculty of the Virgina Polytechnic Institute and State University;2008:98 pages 53 41 McLean E, Salze G, Craig SR Parasites, diseases and deformities of cobia Ribarstvo 2008;66(1):1 – 16 42 McLean E Cobia cultivation in aquaculture 2009:804 – 821 43 Mmanda FP, Zhou S, Zhang J, Zheng X, An A, Wang G Massive mortality associated with Streptococcus iniae infection in cage – cultured red drum (Sciaenops ocellatus) in Eastern China African Journal of Microbiology Research 2014;8(16):1722 – 1729 44 Moreira CB, Hashimoto GSDOH, Rombenso AN, Candiotto FB, Martins ML, Tsuzuki MY Outbreak of mortality among cage-reared cobia (Rachycentron canadum) associated with parasitism Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 2013;2(4):588-591 45 Nho SW, Shin GW, Park SB, Jang HB, Cha IS, Ha MA, Kim YR, Park YK, Dalvi RS, Kang BJ, Joh SJ, Jung TS Phenotypic characteristics of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus ) Federation of European Microbiological Societies 2009;293(1):20-27 46 Ogawa K, Miyamoto J, Wang HC, Lo CF, Kou GH Neobenedenia girellae (Monogenea ) Infection of cultured Cobia Rachycentron canadum in Taiwan Fish pathology 2006;41(2):51 – 56 47 Pier GB, Madin SH Streptococcus iniae sp nov., a beta-hemolytic streptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin, Inia geoffrensis International Journal of Systematic Bacteriology 1976; 26:545–553 48 Pier GB, Madin SH, Al-Nakeeb S Isolation and characterization of a second isolate of Streptococcus iniae International journal of systematic bacteriology 1978;28(2):311 – 314 49 Rajan PR, Lopez C, Lin JHY, Yang HL Vibrio alginolyticus infection in cobia (Rachycentron canadum) cultured in Taiwan Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 2001;21(6):228– 234 50 Rameshkumar P, Kalidas C, Tamilmani G, Sakthivel M, Nazar AKA, Maharshi VA, Rao SKS, Gopakumar G Microbiological and histopathological investigations of Vibrio alginolyticus infection in cobia Rachycentron canadum (Linnaeus, 1766) cultured in sea cage Indian Journal of Fish 2014;61(1):124-127 54 51 Shaffer RV, Nakamura EL Synopsis of biological date on the cobia NOAA Technical Report NMFS 82 1989 52 Shin GW, Palaksha KJ, Yang HH, Shin YS, Kim YR, Lee EY, Kim HY, Kim YJ, Oh MJ, Yoshida T, Jung TS Discrimination of streptococcosis agents in olive flounder (Paralichthys olivaceus) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 2006;26(2):68-79 53 Shin GW, Palaksha KJ, Yang HH, Shin YS, Kim YR, Lee EY, Oh MJ, Jung TS Partial two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) maps of Streptococcus iniae ATCC29178 and Lactococcus garvieae KG9408 Disease of aquatic organisms 2006;70:71 – 79 54 Shoemaker CA, LaFrentz BR, Klesius PH, Evans JJ Protection against heterologous Streptococcus iniae isolates using a modified bacterin vaccine in Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.) Journal of fish disease 2010; 33(7):537–544 55 Singh VV, Chellappan A, Purushottama GB, Ramkumar SKS, Mhatre VD Cage culture in Maharashtra: Present and Future prospects In: Training manual on “Cage Culture of Marine Fin fish and Shell fish in Open Sea Page 52 – 55 56 Su MS, Chien YH, Liao IC Potential of marine cage aquaculture in Taiwan: Cobia culture In Cage Aquaculture in Asia: Proceedings of the First International Symposium on Cage Aquaculture in Asia 2000 57 Suanyuk N, Itsaro A Efficacy of inactivated Streptococcus iniae vaccine protective effect of β-(1,3/1,6) - glucan on the effectiveness of Streptococcus iniae vaccine in red tilapia Oreochromis niloticus x O Mossambicus Songklanakarin Journal of Science Technology 2011;33:143-149 58 Suanyuk N, Sukkasame N, Tanmark N, Yoshida T, Itami T, Thune RL, Tantikitti C, Supamattaya K Streptococcus iniae infection in cultured Asian sea bass (Lates calcarifer) and red tilapia (Oreochromis sp.) in southern Thailand Songklanakarin Journal of Science and Technology 2010;32(3):341 – 348 59 Sun JR, Yan JC, Yeh CY, Lee SY and Lu JJ Invasive infection with Streptococcus iniae in Taiwan Journal of Medical Microbiology 2007;56:1246–1249 60 Svennevig N Farming of cobia or black kingfish (Rachycentron canadum) SINTEF Fisheries & Aquaculture, Norway 55 61 Thuy Thi Thu Nguyen, Hai Trong Nguyen, Wang PC, Shih-Chu Identification and expression analysis of two pro-inflammatory cytokines, TNF-a and IL-8, in cobia (Rachycentron canadum L.) in response to Streptococcus dysgalactiae infection Fish & Shellfish Immunology 2017;67:159 – 171 62 Toranzo AE, Magarinos B, Romalde JL A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems Aquaculture 2005;246:37-61 63 Toranzo AE Report about fish bacterial diseases In : Alvarez-Pellitero P (ed.), Barja JL (ed.), Basurco B (ed.), Berthe F (ed.), Toranzo AE (ed.) Mediterranean aquaculture diagnostic laboratories Zaragoza: CIHEAM, 2004:49-89 64 Van Can Nhu, Quang Huy Nguyen, Thanh Luu Le, Mai Thien Tran, Sorgeloos P, Dierckens K, Reinertsen , Kj∅rsvik E, Svennevig N Cobia Rachycentron canadum aquaculture in Vietnam: Recent developments and prospects Aquaculture 2011;315: 20–25 65 Williams EH, Bunkley-Williams L Parasites of offshore, big game sport fishes of Puerto Rico and the western North Atlantic Puerto Rico Department of Natural and Enviromental Resources, San Juan, Puerco Rico, and Deparment of Biology Mayaguez, Prueco Rico 1996:384p 66 Yanong RPE, Francis-Floyd R Streptococcal Infections of Fish Fisheries and Aquatic Sciences Department 2002;57:5 pages 67 Zou L, Wang J, Huang B, Xie M, Li A MtsB, a hydrophobic membrane protein of Streptococcus iniae, is an effective subunit vaccine candidate Vaccine 2011: 391–394 Nguồn internet 68 Cá mú, cá bớp chết chưa rõ nguyên nhân Cập nhật 14/02/2014 [online] Xem 19/01/2018 https://tuoitre.vn/ca-mu-ca-bop-chet-chua-ro-nguyen-nhan-593616.htm 69 Cá bớp đảo Hòn Chuối bị mù hàng loạt, người nuôi lao đao 22/02/2018 [online] 22/02/2018 https://baomoi.com/ca-bop-dao-hon-chuoi-bi-mu-hang-loat-nguoi-nuoilao-dao/c/25013892.epi 70 Cá lồng nuôi đầm Lăng Cô chết bất thường Cập nhật ngày 25/10/2017 [online] Xem 18/01/2018 https://baomoi.com/ca-long-nuoi-o-dam-lang-co-chet-batthuong/c/23700026.epi 56 71 Đã xác định nguyên nhân cá chết hàng loạt Cập nhật 19/08/2016 [online] Xem 20/01/2018 http://www.baokhanhhoa.vn/kinh-te/201608/da-xac-dinh-nguyen-nhan- ca-chet-hang-loat-2447871/ 72 Phú Yên: Cá bớp chết hàng loạt, người nuôi lỗ nặng Cập nhật 30/03/2016 [online] Xem 19/01/2018 http://tnnn.hoinongdan.org.vn/sitepages/news/1090/42553/phu-yen-ca-bop-chet-hangloat-nguoi-nuoi-lo-nang/ 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết giải trình tự gen 16s vi khuẩn VN180517 58 59 Phụ lục : Một số hóa chất dùng nghiên cứu Một số hóa chất dùng điện di SDS - PAGE Phosphate Buffered Saline (PBS) Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaCl Nước cất 0.72 g 0.27 g 8.5 g 1000 ml Đệm TES 0.01 M Tris – HCl (pH = 7.2) 0.002 M EDTA 0.15 M NaCl Mix mutanolysine Tes buffer Lysozyme 10% Mutanolysine Sample buffer (SDS reducing buffer) deionized water 0.5M Tris-HCl, pH6.8 Glycerol 10% (w/v) SDS 0.5%(w/v) Bromophenol blue (Giữ nhiệt độ phòng) Resolving gel buffer Water Acrylamide (40%) Gel buffer 10%(w/v) SDS 10% APS TEMED ml 100 µl 50 µl 3.55 ml 1.25 ml 2.5 ml 2.0 ml 0.2 ml 4.4 ml 3.0 ml 2.5 ml 0.1 ml 50µl 5µl Stacking gel buffer: 1.5M tris-HCl, PH6.8, percent gel 5% Water 6.2 ml Acrylamide (40%) 1.3 ml Gel buffer 2.5 ml 10%(w/v) SDS 0.1 ml 10% APS 50µl TEMED 5µl Staining solution (Dung dịch nhuộm gel) Coomassie Brilliant Blue G- 250 0,025 g Methanol 40 ml 60 Acid acetic Bổ sung nước cất vừa đủ 10 ml 100 ml Dung dịch rửa màu Methanol Acid acetic Bổ sung nước cất vừa đủ 40 ml 10 ml 100 ml 61 ... Streptococcosis cá bị mù mắt Chính vây, đề tài “ Xác định tác nhân cầu khuẩn gây bệnh mù mắt cá bớp (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766) ni lồng Khánh Hịa” thực với mục tiêu: Xác định tác nhân cầu khuẩn gây. .. đề tài: Xác định tác nhân cầu khuẩn gây bệnh mù mắt cá bớp ni Khánh Hịa Nội dung đề tài: Tình hình bệnh mù mắt cá bớp ni Khánh Hịa Nghiên cứu đặc điểm chủng cầu khuẩn thu từ cá bớp ni Khánh Hịa... dung nghiên cứu Xác định tác nhân cầu khuẩn gây bệnh mù mắt cá Bớp (Rachycentron canadum, Linnaues 1766) ni lồng Khánh Hịa Tình hình bệnh mù Nghiên cứu đặc điểm mắt cá bớp chủng cầu khuẩn thu Kiểm