Nhân dòng gene quy định protein capsid vỏ virus hpv (hepatopancreatic parvovirus) trong escherichia coli để tạo kháng thể trong chẩn đoán bệnh trên tôm sú

Trang 1  MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 3  1.1.  Tính cấp thiết đề tài 3  1.2.  Tên đề tài 3  1.3.  Mục tiêu đề tài 3  2  TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4  2.1.  Tổng quan bệnh học tôm sú 4  2.1.1  Bệnh virus [2,6,9,13,14,15,16,17,18,23,26,29,33,34,35] 4  2.1.1.1  Nhóm cấp tính 4  2.1.1.2  Nhóm mãn tính 7  2.1.2  Bệnh vi khuẩn [1,3,16,17,19] 8  2.1.2.1  Nhóm cấp tính 8  2.1.2.2  Nhóm mãn tính 9  2.1.3  Bệnh Parasites [16,17] 10  2.1.4  Bệnh nấm [16,17] 10  2.1.5  Bệnh viêm gan tụy hepatopancreatic parvovirus [16,17,18,19,23,25,] 11  2.2.  Tổng quan kỹ thuật tạo dòng 14  2.2.1  Phương pháp thiết kế mồi [21] 14  2.2.2  Phương pháp PCR [21] 15  2.2.3  Phương pháp nối ghép đoạn gen[8,31] 16  2.2.4  Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli DH5α [9,10,11] 17  2.2.4.1  Hóa biến nạp 17  2.2.4.2  Điện biến nạp 18  2.2.4.3  Phương pháp chọn dòng vector nhân dòng E.coli 19  2.2.5  Tế bào nhân dòng E.coli [4,28] 21  2.2.5.1  Phân loại: 21  2.2.5.2  Ưu điểm: 22  2.2.5.3  Khuyết điểm: 22  2.2.6  Chọn tế bào nhân dòng E.coli [10,11] 22  3  NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23  3.1.  Sơ đồ chung 23  3.2.  Vật liệu hóa chất nghiên cứu 25  3.2.1  Chủng vi khuẩn 25  3.2.2  Plasmid 25  3.2.2.1  Plasmid nhân dòng pJET 1.2 25  3.2.2.2  Enzyme cắt nối đoạn gen DNA tái tổ hợp 26  3.2.3  Hóa chất mơi trường 26  3.2.3.1  Hóa chất: 26  3.2.3.2  Dụng cụ, thiết bị: 28  3.2.3.3  Các phương pháp thí nghiệm 28  4  5  6  THỜI GIAN ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN LUẬN VĂN 36  NHÂN SỰ THỰC HIỆN 37  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38  6.1.  Xác định số dịng HPV nhiễm tơm sú 38  6.2.  Lâm sàng tôm sú teo gan bệnh nhiễm kèm 41  6.2.1  Khẳng định lâm sàng kiểm chứng PCR tìm chứng dương HPV: 41  Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 6.2.1.1  Bệnh lý: 41  6.2.1.2  Kiểm chứng phương pháp PCR 42  6.2.1.3  Kết PCR mồi đặc hiệu H441 bệnh đồng nhiễm: 43  6.2.2  Thiết kế mồi cho nhân dòng capsid VP vào plasmid PJET1.2 tạo dòng PJET1.2 – moncap 49  6.2.2.1  Thiết kế primer: 49  6.2.3  Phân lập đoạn gen mã hóa capsid VP: 49  6.2.4  Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR mã hóa đoạn gen capsid VP 50  6.2.4.1  Cloning Kit (Fermentas): 50  6.3.  Kết giải trình tự đoạn gen VP 52  6.3.1  Clustal trình tự nucleotide đoạn gene chèn vào plasmid nhân dòng PJET1.2 đoạn gene mã hóa capsid VP gene bank 52  6.3.2  Align PJET1.2–moncap11 với trình tự gene bank: 56  6.3.3  Align PJET1.2–moncap12 với trình tự gene bank: 61  6.3.4  Align clustalW trình tự acid amin protein tái tổ hợp VP với trình tự acid amin protein gene bank: 66  6.3.4.1  Align: 66  6.3.4.2  Clustalw: 67  6.3.4.3  Kết luận: 69  7  TÀI LIỆU THAM KHẢO 70  Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài Những năm gần đây, bệnh dịch virus tôm sú ngày lan nhanh gây thiệt hại kinh tế thảm họa không báo trước cho kinh tế nước nhà giới Bệnh virus nói chung bệnh virus tơm nói riêng đốm trắng, đỏ thân, đầu vàng, cịi, hoại tử, teo gan khơng có thuốc điều trị Năm nay, dịch bệnh teo gan kèm theo bệnh phân trắng làm cho tôm chết hàng loạt sau mưa dầm, nắng hạn, gió bấc hay đứng gió Bệnh teo gan virus HPV (Hepatopancreatic parvovirus), REO III & IV (Reo-like virus of the hepatopancreas) hay vi khuẩn vibrio NHP (Necrotizing Hepatopancreatitis) gây [12, 32] Do đó, việc chuẩn đốn bệnh virus HPV gây teo gan tôm giai đoạn giống tôm mẹ với thời gian ngắn hiệu vấn đề cấp thiết Việc chuẩn đốn bệnh HPV tơm chủ yếu phương pháp PCR Phương pháp nhạy, song giá thành cao cà thực phịng thí nghiệm có trang bị máy PCR Việc chuẩn đoán bệnh đồng ruộng dùng que thử đơn giản dựa nguyên lý kháng nguyên – kháng thể Để tiến tới sử dụng phương pháp chuẩn đoán phản ứng miễn dịch, tiến hành đề tài tạo kháng nguyên protein đặc hiệu cho HPV 1.2 Tên đề tài Nhân dòng gene quy định protein vỏ capsid virus HPV (Hepatopancreatic parvovirus) tế bào E.coli để tạo kháng thể chuẩn đốn bệnh tơm sú 1.3 Mục tiêu đề tài • Xác định số dịng virus HPV, biểu lâm sàng • Xác định bệnh nhiễm kèm tơm sú Việt Nam • Phân lập đoạn gen capsid VP virus HPV • Tạo dịng tế bào vi khuẩn Escherichia coli mang gene capsid VP Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bệnh học tôm sú 2.1.1 Bệnh virus [2,6,9,13,14,15,16,17,18,23,26,29,33,34,35] 2.1.1.1 Nhóm cấp tính a Yellow head virus (YHV) Phân loại: YHV virus có nhân RNA, mạch đơn, họ rhabdoviruses, có dịng: Yellowhead virus YHV, gill-associated virus GAV, lymphoid organ virus LOV Triệu chứng: Phần sống đầu ngực màu vàng gan tôm bị vàng qua lớp mai đầu Biểu ban đầu bệnh gan tơm có màu vàng xanh xám bao quanh từ ngồi vào trong, đơi từ màu xanh chuyển sang màu nâu nhạt Khả phát triển tồn độc lập: • Nước biển: – ngày • Nước ao ni tơm: – 10 ngày • Xác tơm đơng lạnh – 600C: tháng • Thời gian tồn virus tơm bệnh đầu vàng hấp hối chết đến chưa biết b Taura syndrome virus (TSV) Phân loại: TSV virus có nhân RNA mạch đơn, lớp Picornavirales, họ Dicistroviridae Triệu chứng: Xuất đốm trắng đỏ quạt, sau quạt đỏ sáng dần bị chín phần thịt cuối quạt bị rụng Khả phát triển tồn độc lập: • Vẫn cịn hoạt động 00C • Thời gian tồn virus tôm bệnh hấp hối chết đến chưa biết Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang c White Spot syndrome (WSSV) Phân loại: WSSV virus có nhân DNA, mạch đơi, họ Nimaviridae Triệu chứng: xuất nhiều đốm trắng lớp cutin áo đầu tơm Những khoanh trịn chứa nhiều canxi vỏ, vỏ tôm mềm nhũng dễ vỡ miếng gạch vụng Kích thước khoanh trịn khoảng 0.5 – mm Khả phát triển tồn độc lập: nước biển: – ngày d Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis virus (IHHNV) Phân loại: IHHNV virus có nhân DNA, mạch đơn, họ Parvoviridae Triệu chứng: phần phụ đầu tôm bị biến dạng hai mắt không đối xứng, chủy chân bơi bị ngắn bình thường Đường viền lớp áo cutin chuyển từ màu sáng sang màu sậm hay lớp áo có màu sậm Sau đó, thịt tơm có màu xanh Roi anten bị biến dạng khiến tôm bơi lảo đảo Khả phát triển tồn độc lập: chưa biết e Baculavirus penaei (PsSNPV) Phân loại: PvSNV virus có nhân DNA, mạch đơi, họ Baculoviridae Triệu chứng: đoạn ruột có màu trắng sữa Khả phát triển tồn độc lập: Nước biển: ngày nhiệt độ 300C, ngày 250C,12 ngày 200C, 20 ngày 150C, 120 phút 450C, 30 phút 500C, phút 600C Bất hoạt pH = 1.0 – 4.0 f Baculoviral midgut galnd necrosis virus (BMNV) Phân loại: BMNV virus có nhân DNA, mạch đôi, họ Baculoviridae Triệu chứng: Gan tôm xuất vùng màu trắng, đục mờ Tôm giống dạng post bơi lờ đờ mặt nước có đoạn ruột màu trắng Khả phát triển tồn độc lập: Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang Nước biển: ngày nhiệt độ 300C, ngày 250C,12 ngày 200C, 20 ngày 150C, 120 phút 450C, 30 phút 500C,5 phút 600C Bất hoạt pH = 1.0 – 4.0 g Monodon baculovirus (MBV) Phân loại: MBV virus có nhân DNA, mạch đơi, họ Baculoviridae Triệu chứng: gan tơm màu trắng bệch kích thước tơm nhỏ bình thường nhiều Khả phát triển tồn độc lập: Nước ao nuôi tôm nươc biển: ngày nhiệt độ 300C, ngày 250C,12 ngày 200C, 20 ngày 150C, 120 phút 450C, 30 phút 500C,5 phút 600C Bất hoạt pH = 1.0 – 4.0.Thời gian tồn virus tôm hấp hối chết đến chưa biết h Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) Phân loại: IPNV virus có nhân RNA, mạch đơi, họ Birnaviridae, có dịng Triệu chứng: • Tơm giống mê, bơi lờ đờ, phần ngực chân bụng xuất nhiều viết loét, bị rối loạn vận động vào lúc trời chuyển mưa xuất cầu vịng • Tơm trưởng thành thường không chết bị nhiễm Tôm bị nhiễm phát bệnh gan tơm bị thối hóa Khả phát triển tồn độc lập: Nước ao nuôi tôm nươc biển: 30 phút 600C pH = 3, pH = – 9, 10 phút pH = 12.5, pH = 2.5, nhiều tuần 100C, nhiều tháng 40C i Rhabdovirus of Penaeid shrimp (RPS) Phân loại: RPS virus có nhân RNA, mạch đơn, họ rhabdoviridae Triệu chứng: khơng rõ ràng có liên quan tới hệ miễn dịch tơm Cơ quan lympho bị phình to Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 2.1.1.2 Nhóm mãn tính a Reo III IV Phân loại: REO III IV virus có nhân DNA, mạch đơi, họ Reoviridae Triệu chứng: Biểu chưa rõ rãng tăng trưởng kém, tăng mùi bề mặt, vỏ tơm bị melanie hóa, bị đục, mềm thân, thường gan tôm bị teo màu xanh Tôm nhiễm virus thường mắc chứng bệnh đường ruột thần kinh rối loạn vận động Vị trí virus cơng vào gan tơm tế bào F R gan Khả phát triển tồn độc lập: chưa biết rõ b Hepatopancreatic parvovirus (HPV) Phân loại: HPV virus có nhân DNA, mạch đơn, họ parvoviridae Triệu chứng: Gan tơm có bị teo, có kích thước khoảng 1/3 so với gan bình thường, chai dai Giai đoạn cuối, gan bị nhũng rữa lớp biểu mô dai Màu sắc gan tôm biến đổi tùy theo bệnh nhiễm kèm màu xanh nhiễm với vibrio, màu trắng bệch nhiễm với MBV Khả phát triển tồn độc lập: chưa biết rõ c Lymphodial parvo like virus (LPV) Phân loại: LPV virus có nhân DNA, sợi đơn, họ parvoviridae Triệu chứng: giống với IHHNV Khả phát triển tồn độc lập: chưa biết rõ d Lymphoid organ virus (LOV) Gill associated virus (GAV) Phân loại: LOV GAV virus có nhân RNA, mạch đơn, họ rhabdoviruses Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang Triệu chứng: Gan tơm thường có màu nâu hay vàng, kích thước to hơn, nhân tế bào gan bị trương phình nên gan dễ vỡ, biểu mô mềm nhũng Trạng thái bơi lờ đờ tấp bờ vào buổi sáng sớm Khả phát triển tồn độc lập: Nước biển nước ao: ngày nhiệt độ 25 – 280C 30 phút 600C e Spawner isolated mortality virus (SMV) Phân loại: SMV virus có nhân DNA, mạch đơn, họ parvovirus Triệu chứng: Toàn thân bị đỏ sậm phân có màu đỏ Khả phát triển tồn độc lập: chưa biết rõ 2.1.2 Bệnh vi khuẩn [1,3,16,17,19] 2.1.2.1 Nhóm cấp tính a Necrotizing hepatopancreatis (NHP) Triệu chứng: hôn mê, bơi lờ đờ, tăng mùi hôi, biếng ăn, đen mang, mềm thân, tỉ lệ chết cao vòng 30 ngày kể từ ngày nhiễm bệnh Gan tơm bị teo có màu xanh trắng bao quanh gan, mềm nhũng Khả phát triển tồn độc lập: nhiệt độ nước ao cao từ 29 – 300C hay độ muối mặn từ 20 – 40 % điều kiện để vi khuẩn phát triển mạnh b Vibrio species (vibriosis) Phân loại: có nhiều dòng: V harveyi, V vulnificus, V parahaemolyticus, V alginolyticus, V penaeicida, V damsela, V fluvialis, V anguillarum, V campbelli, V nereis, V cholerae (non 01) and V splendidus and Vibrio sp Tuy nhiên V.cholerae nhiễm tôm sú nhiều Nguyên nhân: Nước ao nuôi chất lượng như: giàu dinh dưỡng, màu nước đen, đáy ao bị đóng đáy dư thức ăn hay xác tôm chết nhiều Nhiệt độ nước cao lượng oxy hòa tan nước Mật độ nuôi dày Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang Triệu chứng: Thiếu oxy biểu qua toàn thân bị đỏ, mang chuyển màu từ đỏ sang nâu Kén ăn, bơi tấp bờ Đồng thời phát sáng tôm bị nhiễm V harveyi V splendidus Phần tổn thương bị loét thêm bacteria shell disease gây hay phần rìa mang Màu bị mờ đục đám mây Vết loét nhiễm gan ruột gây nhiễm trùng máu Gan tơm có màu mờ đục xanh Mang có màu nâu c Rickettsia Triệu chứng: Gan tôm xuất màu trắng chấm đen rải rác Tôm kén ăn, màu vỏ sậm, chậm lớn, thường nhiễm kèm với virus vi khuẩn d Aerococcus viridans var homari Triệu chứng: Sức khỏe tôm yếu chết đột ngột tư nằm ngang Các nguyên tố sắc đóng thành vết đen nhỏ lớp mô mang hay phận khác suốt trình nhiễm Khả phát triển tồn độc lập: Nước ao nuôi tôm nươc biển: 30 phút 600C pH = 3, pH = – 9, 10 phút pH = 12.5, pH = 2.5, nhiều tuần 100C, nhiều tháng 40C 2.1.2.2 Nhóm mãn tính a Mycobacteria (mycobacteriosis) Triệu chứng: chưa rõ, lớp mô không sáng mờ đục Mấu gan tôm xuất màu đen bị melanine hóa Vùng màu đen bị lan nhanh vung khác mô liên kết quan tim, buồng trứng, cơ, quan nhận tín hiệu, mang Bệnh phát triển nhanh nhiễm kèm với vi khuẩn gram âm vi khuẩn chịu acid Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 10 b Chitinoclastic bacteria (other than vibrios) associated with shell disease Triệu chứng: xuất đốm nâu hay đen bề mặt cutin Vết lan rộng vùng xung quanh khơng có hình dáng rõ ràng Thường gặp tôm nuôi thâm canh quảng canh cải tiến c Aeromonas sp Và Pseudomonas sp (Necrosis septicemias) Triệu chứng: thường nhiễm chung với vi khuẩn khác, trạng thái bơi lờ đờ bị rối loạn vận động, xuất nhiều đốm nâu mang vùng bụng Toàn thân chuyển màu thành đen hay đỏ d Epibiont bacteria which cause fouling (principally leucothrix mucor) Triệu chứng: xuất mùi hơi, tồn than bị nhớt hay đóng rong khe mang chuyển từ màu vàng nâu sang màu vàng đen 2.1.3 Bệnh Parasites [16,17] a Microsporidia Triệu chứng: vân bị mờ đục micosporidia thay lớp Vỏ tơm bị nhiễm thường có màu xanh đen hay đen b Hematodinium-like organism Triệu chứng: đuôi tôm có màu phấn trắng có chứa chất nhờn có thực vật ký sinh c Parauronema spp Triệu chứng: lông mịn bị lấp đầy khoang bụng khe hở nên tơm có màu sậm 2.1.4 Bệnh nấm [16,17] Fusarium solani (Fusariosis) Triệu chứng: đen mang nhiễm kèm với động thực vật ký sinh vi khuẩn Các phần phụ đầu đuôi bị biến dạng bị Các vết lở nấm gây thường có màu sậm đen bị melanine hóa cutine Nấm nhiễm vị trí đầu, đuôi, phần mang phần nằm sát mang Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 59 1330 Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GCCAAAGAATCTAAGATGTTTAAGGATGCAATGGCAGGTTATCTATTAGATGACGACATG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GCCAAAGAATCTAAGATGTTTAAGGATGCAATGGCAGGTTATCTATTAGATGACGACATG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AACCAGACAAAAGTCACATCAGAACACAACCACGTATTTGCATTCACAGACTTGAGAGAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: AACCAGACAAAAGTCACATCAGAACACAACCACGTATTTGCATTCACAGACTTGAGAGAT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TCGCCAGTAATAAGCGAAGTAGCAGCATACCAGACCAACGATGAACCACCAAAGATAAAT ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::: TCGCCAGTAATAAGCGAAGTAGCAGCATACCAGACCAACGATGAACCACCAAAAATAAAT 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 GGCATTGGAATAGAATACCAGGGATTCAACTTAACATCAGACACAAATGCAGCTCTCATT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GGCATTGGAATAGAATACCAGGGATTCAACTTAACATCAGACACAAATGCAGCTCTCATT 1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 GGTCTCATGCCAAGTAACTGTATAAAGAGAAGGAAGGAGATACAGTCAGGTATGGACAAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GGTCTCATGCCAAGTAACTGTATAAAGAGAAGGAAGGAGATACAGTCAGGTATGGACAAC 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GTAGTATTATGGTCCATGAAGAGTAACAGACTCATAGACAAAAGATTTTGGAAGCCAGAA :::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GTAGTACTATGGTCCATGAAGAGTAACAGACTCATAGACAAAAGATTTTGGAAGCCAGAA 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 GGATGGACCAAAAAGAGCATAAACGGTATGGCTATAGACAAAGTGAACATTACACCAACA :::::::::::::::::::: ::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::: GGATGGACCAAAAAGAGCATGAACGGTATGGCTAAAGACAAAGTGAACATTACACCAACA 1750 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACCTATGATATATATGAGGAAGCTCACGTAACCAGGACAACAGATTATGCAGAATGGGCT ::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ACCTATGATATATATGAAGAAGCTCACGTAACCAGGACAACAGATTATGCAGAATGGGCT 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910 1920 AGGAATGAAATGTTCTATAATGCAAACACTTCACACGGAAGTGTTGGACCAGGTGAAATA ::::::::::: :::::: :::::::::::::: ::::::::::::::::: :::: ::: AGGAATGAAATATTCTATGATGCAAACACTTCATACGGAAGTGTTGGACCAAGTGACATA 1870 1880 1890 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 GCAGATTTTGTACAGAAATACAACGTATGCGGCCAATATGCTACAGACATATTCTTTATG : : :::::::::::::::::::: ::: : :::::::::::::::::::::::::::: GGAAATTTTGTACAGAAATACAACTTATCAGACCAATATGCTACAGACATATTCTTTATG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CCATATGTTCACACACAGAGAGGCATAATTCAAGACATAGTCATAAATTTTGACTTAACA Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 60 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI Moncap11 MoncapNCBI :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: CCATATGTTCACACACAGAGAGGCATAATTCAAGACATAGTCATAAATTTTGACTTAACA 1990 2000 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ATGCAGATTATGGTCAAGAGGATTCCACGTCAAGTATACAATGATTTCTACCACATCAAC ::::: :::::::::::::: ::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::: ATGCAAATTATGGTCAAGAGAATTCCACGTCAAGTATATAATGATTTCTACCACATCAAC 2050 2060 2070 2080 2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ACTAGAGCCATGAATCTAGTTAAATATGACAGTGCGGTAGAAAGATCATTCGGATACGAC :::::::::::::: : ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ACTAGAGCCATGAACCCAGTTAAATATGACAGTGCGGTAGAAAGATCATTCGGATACGAC 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 2210 2220 GAAATATACGCAAGATCCATAAAAATACATGAAAACATAAGTGGAACCCATGGAAGTAAG :::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::: GAAATATATGCAAGATCCATAAAAATACATGAAAACATAAGTGGAACTCATGGAAGTAAG 2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 TATGCAGACAGAGGACCAATAAGTCATATGGAAGCAACAAAGAGGAACTCTTACCAGAGA :::::::: :::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::: TATGCAGATAGAGGACCAATAAGTCATATGGAAGCAACAAAGAGGAACTCTTACCAGAGA 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340 GCATATGCACAGAGAAGAATAATACTAGATCAGGGTGTATCAAAAATGAAGACAAGAAGT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GCATATGCACAGAGAAGAATAATACTAGATCAGGGTGTATCAAAAATGAAGACAAGAAGT 2290 2300 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 AGTGCGGCGGCGGAAGATGACATTCCAGAAGATTGTGACGACTTCCTAGAAACTTCTGAA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: AGTGCGGCGGCGGAAGATGACATTCCAGAAGATTGTGACGACTTCCTAGAAACTTCTGAA 2350 2360 2370 2380 2390 2400 2410 ATTAAGTCGAC :::::: -GTCGAC Kết giải trình tự cho thấy Chúng ta tiến hành dịch mã trình tự trình tự protein để tìm protein tương lai Dạng FASTA: MSPTRKGGNYYASRHFQSKRKNKLARVKDLLASKKKERRFKGKGNTLSEKPSTSEWND PVRQRFPELEQEERNTFAGLLAIEAAPDQRQLGRDNNNQLALVQRDTRVAVRQSTNRG EALEVVRAANEAIRSGGDRLAELVQAYASGFSDSTEIVEVRQEDRVQRDIFQEEGQNL LAIEIALQEPSSVAQQLDQERTPAIKRALELTAEEERIERIENAKKYIEEVIEETNQE LQEQERQEVSAAAEDTMNTEAPVPMETSESGATAAPQQRAAAGGGGSGGGGESAGYGK NPSDSFQRHRNKPVDLKHIGDNVYVAQRVYKVEAECKLVGDKLSWSNTTNSKYLRRLL GVNGNSNSGDIKHSFYTQLSGSIGLGNLALGNYINSWGMDNISKSEDSWAIIATRGKM Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 61 NHLQAFEMVPQYQGETVVGYTSAPLQFGKLLGHVYYPDPKGEERIKIASKADAKESKM FKDAMAGYLLDDDMNQTKVTSEHNHVFAFTDLRDSPVISEVAAYQTNDEPPKINGIGI EYQGFNLTSDTNAALIGLMPSNCIKRRKEIQSGMDNVVLWSMKSNRLIDKRFWKPEGW TKKSINGMAIDKVNITPTTYDIYEEAHVTRTTDYAEWARNEMFYNANTSHGSVGPGEI ADFVQKYNVCGQYATDIFFMPYVHTQRGIIQDIVINFDLTMQIMVKRIPRQVYNDFYH INTRAMNLVKYDSAVERSFGYDEIYARSIKIHENISGTHGSKYADRGPISHIEATKRN SYQRAYAQRRIILDQGVSKMKTRSSAAAEDDIPEDCDDFLETSEI Kết cho thấy, có 50 vị trí nucleotide khác ngân hàng gen bank NCBI có Frame dịch mã protein khơng bị gián đoạn Vậy dịng tế bào E.coli DH5α chứa plasmid PJET – moncap11 chọn làm dòng tế bào nhân dòng capsid VP virus HPV monodon 6.3.3 Align PJET1.2–moncap12 với trình tự gene bank: ALIGN Optimal Global Sequence Alignment Selected Sequence(s) • MoncapNCBI • Moncap12 Import Alignment(s) Return Help Report Bugs ALIGN calculates a global alignment of two sequences version 2.0uPlease cite: Myers and Miller, CABIOS (1989) 4:11-17 MoncapNCBI 2406 nt vs Moncap12 2353 nt scoring matrix: DNA, gap penalties: -16/-4 95.4% identity; Global alignment score: 11015 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 10 20 30 40 50 60 GGATCCATGTCACCTACAAGAAAAGGAGGGAATTATTATGCGAGTAAACACTTCCAAAGT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::: GGATCCATGTCACCTACAAGAAAAGGAGGGAATTATTATGCGAGTAGACACTTCCAAAGT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 AAGCGAAAGAATAAACTAGCGAGAGTGAAAGATTTACTGGCAAGTAAGAAGAAGGAGAGA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: AAGCGAAAGAATAAACTAGCGAGAGTGAAAGATTTACTGGCAAGTAAGAAGAAGGAGAGA 70 80 90 100 110 120 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 62 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI 130 140 150 160 170 180 AGATTTAAAGGAAAAGGAAATACTCTAAGTGAGAAGCCAAGTACATCAGAGTGGAACGAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: AGATTTAAAGGAAAAGGAAATACTCTAAGTGAGAAGCCAAGTACATCAGAGTGGAACGAT 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 CCGGTAAGACAAAGATTTCCAGAATTAGAACAGGAGGAGAGAAATACATTTGCAGGATTA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: CCGGTAAGACAAAGATTTCCAGAATTAGAACAGGAGGAGAGAAATACATTTGCAGGATTA 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 CTAGCAATAGAAGCAGCACCAGACCAAAGACAATTAGGGCGCGATAATAACAATCAACTA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: CTAGCAATAGAAGCAGCACCAGACCAAAGACAATTAGGGCGCGATAATAACAATCAACTA 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 GCACTAGTACAGAGAGACACAAGAGTAGCAGTAAGACAAAGTACAAACAGAGGAGAAGCA ::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GCACTAGTACAGAGAGATACAAGAGTAGCAGTAAGACAAAGTACAAACAGAGGAGAAGCA 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 TTAGAGGTAGTAAGAGCAGCAAACGAAGCAATAAGAAGTGGTGGAGATAGATTAGCAGAA ::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: TTAGAAGTAGTAAGAGCAGCAAACGAAGCAATAAGAAGTGGTGGAGATAGATTAGCAGAA 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 TTAGTACAAGCATACGCATCAGGATTTTCAGACAGCACAGAAATAGTAGAAGTAAGACAA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: TTAGTACAAGCATACGCATCAGGATTTTCAGACAGCACAGAAATAGTAGAAGTAAGACAA 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 GAAGATAGAGTACAGAGAGACATATTCCAAGAAGAAGGACAGAATTTATTGGCTATTGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GAAGATAGAGTACAGAGAGACATATTCCAAGAAGAAGGACAGAATTTATTGGCTATTGAG 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ATTGCATTACAAGAACCAAGCAGTGTAGCGCAACAGTTAGACCAGGAGAGAACTCCAGCA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ATTGCATTACAAGAACCAAGCAGTGTAGCGCAACAGTTAGACCAGGAGAGAACTCCAGCA 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 GTCAAGAGAGCTCTAGAACTAACAGCAGAAGAAGAACGGATAGAACGCATAGAAAACGCT ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ATCAAGAGAGCTCTAGAACTAACAGCAGAAGAAGAACGGATAGAACGCATAGAAAACGCT 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 AAGAAATATATTGAAGAAGTCATAGAAGAGACAAATCAAGAACTACAAGAACAAGAGAGA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: AAGAAATATATTGAAGAAGTCATAGAAGAGACAAATCAAGAACTACAAGAACAAGAGAGA 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 CAAGAGGTAAGTGCGGCGGCGGAAGATACGATGAACACCGAAGCACCCGTCCCGATGGAA ::::: ::::::::::::::::::::::::::::: :: ::::::::::::::::::::: Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 63 Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 CAAGAAGTAAGTGCGGCGGCGGAAGATACGATGAATACTGAAGCACCCGTCCCGATGGAA 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 ACTTCTGAATCCGGAGCCACCGCCGCACCGCAGCAACGAGCTGCTGCGGGCGGCGGCGGT ::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::: ::::::::::::::: ACTTCTGAATCCGGAGCCACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCGGCGGGCGGCGGCGGT 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 AGCGGAGGCGGAGGAGAATCTGCAGGGTACGGAAAAAACCCCAGCGATTCATTCCAGCGC :::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: AGCGGAGGTGGAGGAGAATCTGCAGGGTACGGAAAAAACCCCAGCGATTCATTCCAGCGC 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960 CACCGCAATAAACCCGTTGATCTCAAACACATCGGAGACAACGTATATGTGGCTCAGAGA ::::::::::: :: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: CACCGCAATAAGCCAGTTGATCTCAAACACATCGGAGACAACGTATATGTGGCTCAGAGA 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 GTTTATAAGGTAGAAGCTGAGTGTAAACTGGTAGGGGACAAGTTATCGTGGTCAAACACG ::::: ::::::::::::::::::::: ::: :: :::::::::::::::::::::::: GTTTACAAGGTAGAAGCTGAGTGTAAATGGGTGGGAGACAAGTTATCGTGGTCAAACACG 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ACAAACAGTAAATATCTCAGGAGACTGTTGGGAATAAACGGCAACAGTAACTCTGGAGAT ::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::: ACAAACAGTAAATATCTCAGGAGACTGTTGGGAGTAAACGGCAACAGTAACTCTGGAGAT 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ATTAAGCACAGTTTCTACACACAGCTATCTGGAAGTATTGGTTTGGGAAATCTTGCTCTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ATTAAGCACAGTTTCTACACACAGCTATCTGGAAGTATTGGTTTGGGAAATCTTGCTCTG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GGTAACTACATAAACTCGTGGGGTATGGACAACATATCCAAGAGCGAGGACAGTTGGGCT ::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GGTAACTACATAAACTCATGGGGTATGGACAACATATCCAAGAGCGAGGACAGTTGGGCT 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ATCATAGCCACCAGGGGCAAGATGAACCATCTACAGGCATTTGAGATGGTTCCACAATAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ATCATAGCCACCAGGGGCAAGATGAACCATCTACAGGCATTTGAGATGGTTCCACAATAC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 CAAGGAGAAACTGTAGTGGGATATACAAGTGCACCGCTACAGTTTGGTAAACTTTTGGGA :::::::::::::::::::::::::::::::: CAAGGAGAAACTGTAGTGGGATATACAAGTGC -1270 1280 1290 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CATGTATACTATCCAGATCCCAAAGGTGAAGAAAGGATAAAGATAGCAAGTAAAGCTGAT :::::::::::::::::: : :: ::::: :::::::: :::::: -GATCCCAAAGGTGAAGAAGGAATTAAGATGGCAAGTAAGGCTGAT 1300 1310 1320 1330 1390 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ 1400 1410 1420 1430 1440 Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 64 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 GCCAAAGAATCTAAGATGTTTAAGGATGCAATGGCAGGTTATCTATTAGATGACGACATG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GCCAAAGAATCTAAGATGTTTAAGGATGCAATGGCAGGTTATCTATTAGATGACGACATG 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AACCAGACAAAAGTCACATCAGAACACAACCACGTATTTGCATTCACAGACTTGAGAGAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::: AACCAGACAAAAGTCACATCAGAACACAACCACGTATTGGCATTCACAGACTTGAGAGAT 1400 1410 1420 1430 1440 1450 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TCGCCAGTAATAAGCGAAGTAGCAGCATACCAGACCAACGATGAACCACCAAAAATAAAT ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::: TCGCCAGTAATAAGCGAAGTAGCAGCATACCAGACCAACGATGAACCACCAAAGATAAAT 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1570 1580 1590 1600 1610 1620 GGCATTGGAATAGAATACCAGGGATTCAACTTAACATCAGACACAAATGCAGCTCTCATT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GGCATTGGAATAGAATACCAGGGATTCAACTTAACATCAGACACAAATGCAGCTCTCATT 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1630 1640 1650 1660 1670 1680 GGTCTCATGCCAAGTAACTGTATAAAGAGAAGGAAGGAGATACAGTCAGGTATGGACAAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GGTCTCATGCCAAGTAACTGTATAAAGAGAAGGAAGGAGATACAGTCAGGTATGGACAAC 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GTAGTACTATGGTCCATGAAGAGTAACAGACTCATAGACAAAAGATTTTGGAAGCCAGAA :::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GTAGTATTATGGTCCATGAAGAGTAACAGACTCATAGACAAAAGATTTTGGAAGCCAGAA 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1750 1760 1770 1780 1790 1800 GGATGGACCAAAAAGAGCATGAACGGTATGGCTAAAGACAAAGTGAACATTACACCAACA :::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GGATGGACCAAAAAGAGCATAAACGGTATGGCTAAAGACAAAGTGAACATTACACCAA-1700 1710 1720 1730 1740 1750 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACCTATGATATATATGAAGAAGCTCACGTAACCAGGACAACAGATTATGCAGAATGGGCT ::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: TATGAGGAAGCTCACGTAACCAGGACAACAGATTATGCAGAATGGGCT 1760 1770 1780 1790 1800 1870 1880 1890 1900 1910 1920 AGGAATGAAATATTCTATGATGCAAACACTTCATACGGAAGTGTTGGACCAAGTGACATA ::::::::::: :::::: :::::::::::::: ::::::::::::::::: :::: ::: AGGAATGAAATGTTCTATAATGCAAACACTTCACACGGAAGTGTTGGACCAGGTGAAATA 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1930 1940 1950 1960 1970 1980 GGAAATTTTGTACAGAAATACAACTTATCAGACCAATATGCTACAGACATATTCTTTATG : : :::::::::::::::::::: ::: : :::::::::::::::::::::::::::: GCAGATTTTGTACAGAAATACAACGTATGCGGCCAATATGCTACAGACATATTCTTTATG 1870 1880 1890 1900 1910 1920 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CCATATGTTCACACACAGAGAGGCATAATTCAAGACATAGTCATAAATTTTGACTTAACA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: CCATATGTTCACACACAGAGAGGCATAATTCAAGACATAGTCATAAATTTTGACTTAACA 1930 1940 1950 1960 1970 1980 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 65 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 MoncapNCBI Moncap12 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ATGCAAATTATGGTCAAGAGAATTCCACGTCAAGTATATAATGATTTCTACCACATCAAC ::::: :::::::::::::: ::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::: ATGCAGATTATGGTCAAGAGGATTCCACGTCAAGTATACAATGATTTCTACCACATCAAC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ACTAGAGCCATGAACCCAGTTAAATATGACAGTGCGGTAGAAAGATCATTCGGATACGAC :::::::::::::: : ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ACTAGAGCCATGAATCTAGTTAAATATGACAGTGCGGTAGAAAGATCATTCGGATACGAC 2050 2060 2070 2080 2090 2100 2170 2180 2190 2200 2210 2220 GAAATATATGCAAGATCCATAAAAATACATGAAAACATAAGTGGAACTCATGGAAGTAAG :::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::: GAAATATACGCAAGATCCATAAAAATACATGAAAACATAAGTGGAACCCATGGAAGTAAG 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2230 2240 2250 2260 2270 2280 TATGCAGATAGAGGACCAATAAGTCATATGGAAGCAACAAAGAGGAACTCTTACCAGAGA :::::::: :::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::: TATGCAGACAGAGGACCAATAAGTCATATAGAAGCAACAAAGAGGAACTCTTACCAGAGA 2170 2180 2190 2200 2210 2220 2290 2300 2310 2320 2330 2340 GCATATGCACAGAGAAGAATAATACTAGATCAGGGTGTATCAAAAATGAAGACAAGAAGT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: GCATATGCACAGAGAAGAATAATACTAGATCAGGGTGTATCAAAAATGAAGACAAGAAGT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2350 2360 2370 2380 2390 2400 AGTGCGGCGGCGGAAGATGACATTCCAGAAGATTGTGACGACTTCCTAGAAACTTCTGAA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::: AGTGCGGCGGCGGAAGATGACATTCCAGAAGATTGTGACGACTTCCTAGACACTTCTGAA 2290 2300 2310 2320 2330 2340 GTCGAC :::::: TTAAGTCGAC 2350 Kết giải trình tự cho thấy có 110 vị trí nucleotide khác ngân hàng gen bank NCBI Chúng ta tiến hành dịch mã trình tự DNA trình tự protein để tìm vị trí stop codon cho frame Kết thấy frame có vị trí stop codon Nên dòng tế bào E.coli DH5α chứa plasmid PJET – moncap 12 không chọn Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 66 6.3.4 Align clustalW trình tự acid amin protein tái tổ hợp VP với trình tự acid amin protein gene bank: 6.3.4.1 Align: ALIGN Optimal Global Alignment of Two PS Selected Sequence(s) • Moncap11pro • MoncapNCBIpro ALIGN calculates a global alignment of two sequences version 2.0uPlease cite: Myers and Miller, CABIOS (1989) 4:11-17 Moncap11pro 799 aa vs MoncapNCBIpro 798 aa scoring matrix: BLOSUM50, gap penalties: -12/-2 97.7% identity; Global alignment score: 5118 Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro 10 20 30 40 50 60 MSPTRKGGNYYASRHFQSKRKNKLARVKDLLASKKKERRFKGKGNTLSEKPSTSEWNDPV :::::::::::::.:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: MSPTRKGGNYYASKHFQSKRKNKLARVKDLLASKKKERRFKGKGNTLSEKPSTSEWNDPV 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 RQRFPELEQEERNTFAGLLAIEAAPDQRQLGRDNNNQLALVQRDTRVAVRQSTNRGEALE :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: RQRFPELEQEERNTFAGLLAIEAAPDQRQLGRDNNNQLALVQRDTRVAVRQSTNRGEALE 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 VVRAANEAIRSGGDRLAELVQAYASGFSDSTEIVEVRQEDRVQRDIFQEEGQNLLAIEIA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: VVRAANEAIRSGGDRLAELVQAYASGFSDSTEIVEVRQEDRVQRDIFQEEGQNLLAIEIA 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 LQEPSSVAQQLDQERTPAVKRALELTAEEERIERIENAKKYIEEVIEETNQELQEQERQE ::::::::::::::::::.::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: LQEPSSVAQQLDQERTPAKKRALELTAEEERIERIENAKKYIEEVIEETNQELQEQERQE 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 VSAAAEDTMNTEAPVPMETSESGATAAPQQRAAAGGGGSGGGGESAGYGKNPSDSFQRHR :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: VSAAAEDTMNTEAPVPMETSESGATAAPQQRAAAGGGGSGGGGESAGYGKNPSDSFQRHR 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 NKPVDLKHIGDNVYVAQRVYKVEAECKLVGDKLSWSNTTNSKYLRRLLGVNGNSNSGDIK :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::.:::::::::: NKPVDLKHIGDNVYVAQRVYKVEAECKLVGDKLSWSNTTNSKYLRRLLGINGNSNSGDIK 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 HSFYTQLSGSIGLGNLALGNYINSWGMDNISKSEDSWAIIATRGKMNHLQAFEMVPQYQG Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 67 MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr Moncap11pro MoncapNCBIpr :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: HSFYTQLSGSIGLGNLALGNYINSWGMDNISKSEDSWAIIATRGKMNHLQAFEMVPQYQG 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 ETVVGYTSAPLQFGKLLGHVYYPDPKGEERIKIASKADAKESKMFKDAMAGYLLDDDMNQ :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ETVVGYTSAPLQFGKLLGHVYYPDPKGEERIKIASKADAKESKMFKDAMAGYLLDDDMNQ 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 TKVTSEHNHVFAFTDLRDSPVISEVAAYQTNDEPPKINGIGIEYQGFNLTSDTNAALIGL :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: TKVTSEHNHVFAFTDLRDSPVISEVAAYQTNDEPPKINGIGIEYQGFNLTSDTNAALIGL 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 MPSNCIKRRKEIQSGMDNVVLWSMKSNRLIDKRFWKPEGWTKKSINGMAIDKVNITPTTY ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::.:::: :::::::::: MPSNCIKRRKEIQSGMDNVVLWSMKSNRLIDKRFWKPEGWTKKSMNGMAKDKVNITPTTY 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 DIYEEAHVTRTTDYAEWARNEMFYNANTSHGSVGPGEIADFVQKYNVCGQYATDIFFMPY :::::::::::::::::::::.::.::::.::::: : :::::: ::::::::::: DIYEEAHVTRTTDYAEWARNEIFYDANTSYGSVGPSDIGNFVQKYNLSDQYATDIFFMPY 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 VHTQRGIIQDIVINFDLTMQIMVKRIPRQVYNDFYHINTRAMNLVKYDSAVERSFGYDEI ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::: VHTQRGIIQDIVINFDLTMQIMVKRIPRQVYNDFYHINTRAMNPVKYDSAVERSFGYDEI 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 YARSIKIHENISGTHGSKYADRGPISHIEATKRNSYQRAYAQRRIILDQGVSKMKTRSSA :::::::::::::::::::::::::::.:::::::::::::::::::::::::::::::: YARSIKIHENISGTHGSKYADRGPISHMEATKRNSYQRAYAQRRIILDQGVSKMKTRSSA 730 740 750 760 770 780 790 AAEDDIPEDCDDFLETSEI :::::::::::::::::: AAEDDIPEDCDDFLETSE- 6.3.4.2 Clustalw: CLUSTALW Multiple Sequence Alignment Selected Sequence(s) • Moncap11pro • MoncapNCBIpro CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment Moncap11pro MoncapNCBIpro MSPTRKGGNYYASRHFQSKRKNKLARVKDLLASKKKERRFKGKGNTLSEKPSTSEWNDPV MSPTRKGGNYYASKHFQSKRKNKLARVKDLLASKKKERRFKGKGNTLSEKPSTSEWNDPV *************:********************************************** Moncap11pro MoncapNCBIpro RQRFPELEQEERNTFAGLLAIEAAPDQRQLGRDNNNQLALVQRDTRVAVRQSTNRGEALE RQRFPELEQEERNTFAGLLAIEAAPDQRQLGRDNNNQLALVQRDTRVAVRQSTNRGEALE Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 68 ************************************************************ Moncap11pro MoncapNCBIpro VVRAANEAIRSGGDRLAELVQAYASGFSDSTEIVEVRQEDRVQRDIFQEEGQNLLAIEIA VVRAANEAIRSGGDRLAELKQAYASGFSDSTEIVEVRQEDRVQRDIFQEEGQNLLAIEIA *******************:**************************************** Moncap11pro MoncapNCBIpro LQEPSSVAQQLDQERTPAIKRALELTAEEERIERIENAKKYIEEVIEETNQELQEQERQE LQEPSSVAQQLDQERTPAVKRALELTAEEERIERIENAKKYIEEVIEETNQELQEQERQE ******************:***************************************** Moncap11pro MoncapNCBIpro VSAAAEDTMNTEAPVPMETSESGATAAPQQRAAAGGGGSGGGGESAGYGKNPSDSFQRHR VSAAAEDTMNTEAPVPMETSESGATAAPQQRAAAGGGGSGGGGESAGYGKNPSDSFQRHR ************************************************************ Moncap11pro MoncapNCBIpro NKPVDLKHIGDNVYVAQRVYKVEAECKLVGDKLSWSNTTNSKYLRRLLGVNGNSNSGDIK NKPVDLKHIGDNVYVAQRVYKVEAECKLVGDKLSWSNTTNSKYLRRLLGINGNSNSGDIK *************************************************:********** Moncap11pro MoncapNCBIpro HSFYTQLSGSIGLGNLALGNYINSWGMDNISKSEDSWAIIATRGKMNHLQAFEMVPQYQG HSFYTQLSGSIGLGNLALGNYINSWGMDNISKSEDSWAIIATRGKMNHLQAFEMVPQYQG ************************************************************ Moncap11pro MoncapNCBIpro ETVVGYTSAPLQFGKLLGHVYYPDPKGEERIKIASKADAKESKMFKDAMAGYLLDDDMNQ ETVVGYTSAPLQFGKLLGHVYYPDPKGEERIKIASKADAKESKMFKDAMAGYLLDDDMNQ ************************************************************ Moncap11pro MoncapNCBIpro TKVTSEHNHVFAFTDLRDSPVISEVAAYQTNDEPPKINGIGIEYQGFNLTSDTNAALIGL TKVTSEHNHVFAFTDLRDSPVISEVAAYQTNDEPPKINGIGIEYQGFNLTSDTNAALIGL ************************************************************ MoncapNCBIpro Moncap11pro MPSNCIKRRKEIQSGMDNVVLWSMKSNRLIDKRFWKPEGWTKKSMNGMAKDKVNITPTTY MPSNCIKRRKEIQSGMDNVVLWSMKSNRLIDKRFWKPEGWTKKSINGMAIDKVNITPTTY ********************************************:**** ********** Moncap11pro MoncapNCBIpro DIYEEAHVTRTTDYAEWARNEMFYNANTSHGSVGPGEIADFVQKYNVCGQYATDIFFMPY DIYEEAHVTRTTDYAEWARNEIFYDANTSYGSVGPSDIGNFVQKYNLSDQYATDIFFMPY *********************:**:****:*****.:*.:******: *********** Moncap11pro MoncapNCBIpro VHTQRGIIQDIVINFDLTMQIMVKRIPRQVYNDFYHINTRAMNLVKYDSAVERSFGYDEI VHTQRGIIQDIVINFDLTMQIMVKRIPRQVYNDFYHINTRAMNPVKYDSAVERSFGYDEI ******************************************* **************** Moncap11pro MoncapNCBIpro YARSIKIHENISGTHGSKYADRGPISHIEATKRNSYQRAYAQRRIILDQGVSKMKTRSSA YARSIKIHENISGTHGSKYADRGPISHMEATKRNSYQRAYAQRRIILDQGVSKMKTRSSA ***************************:******************************** Moncap11pro MoncapNCBIpro AAEDDIPEDCDDFLETSEI AAEDDIPEDCDDFLETSE****************** Clustal W options and diagnostic mesages Alignment type: Protein Alignment order: aligned Pairwise alignment parameters Method: accurate Matrix: Gonnet Gap open penalty: 10.00 Gap extension penalty: 0.10 Multiple alignment parameters Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 69 Matrix: Gonnet Gap open penalty: 10.00 % identity for delay: 30 on Penalize end gaps: on Gap separation distance: Negative matrix?: no Gap extension penalty: 0.20 Residue-specific gap penalties: Hydrophilic gap penalties: on Hydrophilic residues: GPSNDQEKR CLUSTAL W (1.81) Multiple Sequence Alignments Sequence type explicitly set to Protein Sequence format is Pearson Sequence 1: MoncapNCBIpro 798 aa Sequence 2: Moncap11pro 799 aa Start of Pairwise alignments Aligning Sequences (1:2) Aligned Score: 97 Time for pairwise alignment: 0.083437 Guide tree file created: [ /tmp-dir/29135.CLUSTALW.dnd] Start of Multiple Alignment There are groups Aligning Group 1: Sequences: Score:17137 Time for multiple alignment: 0.203694 Alignment Score 4784 CLUSTAL-Alignment file created [ /tmp-dir/29135.CLUSTALW.aln] 6.3.4.3 Kết luận: Kết Clustal Alignment cho thấy vị trí khác acid amin PJET – moncap 1.1 capsid VP ngân hàng genbank 97.9%, nghĩa có 50 nu khác có 17 vị trí làm thay đổi acid amin Trong 17 vị trí đó, nhận thấy có vị trí ảnh hưởng tới cấu trúc bậc hai proteon tái tổ hợp VP Vị trí trình tự DNA biến đổi acid amin vị trí: 50 nucleotide khác với peak đạt giá trị cao (>0.5) kết giải trình tự Kết luận sai khác trình tự dịng HPV monodon có nguồn gốc từ Thái Lan q trình thích nghi với điều kiện sống Việt Nam Vậy việc nhân dịng đoạn gene mã hóa capsid VP E.coli nhằm tạo kháng thể cho việc chuẩn đốn bệnh tơm sú hiệu phương pháp khác bước đầu thành công với dự đốn vùng antigen cho kháng thể đơn dịng tương lai Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO A) Ngoài nước 1) Anderson, I.G., Shamsudin, M.N and Shariff, M 1988 Bacterial septicemia in juvenile tiger shrimp, Penaeus monodon, cultured in Malaysian brackishwater ponds Asian Fis Sci 2: 93-108 2) Anderson, I.G., Shariff, M and Nash, G 1989 A hepatopancreatic microsporidian in pond-reared tiger shrimp, Penaeus monodon, from Malaysia J Invertebr Pathol 53: 278-280 3) Bell, T.A and Lightner, D.V 1991 Chemotherapy in aquaculture today – current practices in shrimp culture: available treatments and their efficiency In: C Michel and D.J Alderman (eds.) Chemotherapy in Aquaculture: from Theory to Reality Office International des Epizooties, Paris pp 45-57 4) Current protocol in molecular biology 2000, pp 84 - 93, 234 – 349 5) Dagert, M and Ehrlich, S.D 1974 Prolonged incubation in calcium chloride improves competence of Escherichia coli cells Gene 6:23-28 6) Diseases of Aquatic Organisms, 57: 141-146 7) Dower, W.J., Miller, J.F., and Ragsdale, C.W 1988 High efficiency transformation of E coli by high voltage electroporation Nucl Acids Res 16:6127-6145 8) Engle, M.J Richardson, D.C 1982 DNA ligases In The enzymes Vol 15B (P.D, Boyer, ed), pp – 30 9) Frelier, P.K., Sis, R.F., Bell, T.A and Lewis, D.H 1992 Microscopic and ultrastructural features of necrotizing hepatopancreatitis in Texas cultured shrimp (Penaeus vannamei) Vet Pathol 29: 269-277 10) Hanahan, D 1983 Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166:557-580 11) Holland, Amsterdam Mandel, M and Higa, A 1970 Calcium-dependent bacteriophage DNA infection J Mol Biol 53:159-162 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 71 12) Itami, T 1996 Vaccination and immunostimulation in shrimps SICCPPS book of abstracts, SEAFDEC, Iloilo City, Philippines p 50 13) Jean-Robert Bonami,* Jocelyne Mari, Bonnie T Poulos and Donald V Lightner Characterization of hepatopancreatic parvo-like virus, a second unusual parvovirus pathogenic for penaeid shrimps 14) Jurairat Phromjai1, Wasana Sukhumsirichart2, C Pantoja3, D V Lightner3, T W Flegel1,*Different reactions obtained using the same DNA detection reagents for Thai and Korean hepatopancreatic parvovirus of penaeid shrimp 15) Lightner, D.V., Redman, R.M and Bonami, J.R 1992 Morphologic evidence for a single bacterial epiology in Texas necrotizing hepatopancreatitis in Penaeus vannamei (Crustacea: Decapoda) Dis Aquat Org 13:321-328 16) Lightner, 1996 (Ed.) A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, USA 17) Lightner, D.V (ed.) 1996 A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA 18) Kathy A La Fauce, Jennifer Elliman, Leigh Owens Molecular characterisation of hepatopancreatic parvovirus (PmergDNV) from Australian Penaeus merguiensis 19) Krol, R.M., Hawkins, W.E., and Overstreet, R.M 1991 Rickettsial and mollicute infections in hepatopancreatic cells of cultured pacific white shrimp (Penaeus vannamei) J Invertebr Pathol 57: 362-370 20) Marcil, R and Higgins, D.R 1992 Direct transfer of plasmid DNA from yeast to E coli by electroporation Nucl Acids Res 20:917 21) Michael A.Innis, David H Gelefand, John J Sninnsky PCR applications protocols for functional genomes Copy right 1999 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 72 22) Miller, J.F., Dower, W.J., and Tompkins, L.S 1988 High-voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA Proc Natl Acad Sci U.S.A 85:856-860 23) OIE, Hepatopancreatic parvovirus, năm 2007 24) Owens, L and Hall-Mendelin, 1989 Recent Advances in Australian prawns (sic) diseases and pathology Advances in Tropical Aquaculture, Tahiti, AQUACOP, IFREMER, Actes de Colloque 9: 103-112 25) Sombat Rukpratanporn1, Wasana Sukhumsirichart2, Siwaporn Longyant3, Parin Chaivisuthangkura3, Weerawan Sithigorngul3, Paisarn Sithigorngul3 and Piamsak Manasveta1 preliminary study on production of monoclonal antibodies against hepatopancreatic parvovirus (hpv) in Penaeus monodon 26) Umesha, R.K, Uma, A., Otta, S.K., Karunasagar, I and Karunasagar, I 2003 Detection by PCR of hepatopancreatic parvovirus (HPV) and other viruses in hatchery reared Penaeus monodon postlarvae 27) Shigekawa, K and Dower, W.J 1988 Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: A general approach to the introduction of macromolecules into cells BioTechniques 6:742-751 28) Woodcock, D.M., Crowther, D.M., Doherty, J., Jefferson, S., DeCruz, E., Noyer-Weidner, M., Smith, S.S., Michael, M.Z., and Graham, M.W., "Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants", Nucl Acids Res 17, 3469-3478 (1989) B) Trong nước: 29) Bùi Quang Tề - Bệnh học thuỷ sản - phần – Nhà xuất nông nghiệp – năm 2006 30) Quyền Đình Thi – Cơng nghệ sinh học - tập 1: kỹ thuật phân tích DNA – Nhà xuất khoa học kỹ thuật năm 2005 31) Hồ Huỳnh Thùy Dương – Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục năm 2004 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân Trang 73 C) Web: 32) http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=8&id=27 (Vaccine cho tôm, hướng nghiên cứu đầy tiềm gian khó (23-012007) Tác giả TS Nguyễn Quốc Bình Trung tâm cơng nghệ sinh học TP.HCM, 23/1/2007) 33) http://www.vietlinh.com.vn/kithuat/benhthuysan/teoganphantrang.htm (cập nhật ngày 21/11/2004) 34) http://app.ctu.edu.vn/mkfish/uploads/nghiencuu_kh/detai_truong.htm 35) http://www.vnexpress.net/Vietnam/Suc-khoe/2005/04/3B9DD3D5 (Thứ tư, 13/4/2005, 16:08 GMT+7) 36) http://www.metabolicengineering.gov/me2003/pdf/ingram.pdf Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân ... hiệu cho HPV 1.2 Tên đề tài Nhân dòng gene quy định protein vỏ capsid virus HPV (Hepatopancreatic parvovirus) tế bào E .coli để tạo kháng thể chuẩn đoán bệnh tơm sú 1.3 Mục tiêu đề tài • Xác định. .. Xác định số dịng virus HPV, biểu lâm sàng • Xác định bệnh nhiễm kèm tôm sú Việt Nam • Phân lập đoạn gen capsid VP virus HPV • Tạo dòng tế bào vi khuẩn Escherichia coli mang gene capsid VP Luận... dịch bệnh teo gan kèm theo bệnh phân trắng làm cho tôm chết hàng loạt sau mưa dầm, nắng hạn, gió bấc hay đứng gió Bệnh teo gan virus HPV (Hepatopancreatic parvovirus), REO III & IV (Reo-like virus