Thử nghiệm sản xuất phôi bò in vitro xác định trước giới tính

Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ************ LÊ CÔNG THIỆN THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT PHƠI BỊ IN VITRO XÁC ĐỊNH TRƯỚC GIỚI TÍNH Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2006 – 2008 Mã số ngành: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 i CƠNG TRÌNH NÀY ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM Cán hướng dẫn khoa học: TS CHUNG ANH DŨNG Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, Ngày….tháng….năm 2008 ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc TP.HCM, Ngày ….tháng….năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ CÔNG THIỆN Phái: Nam Sinh ngày: 13/01/1983 Nơi sinh: Cần Thơ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106685 Năm trúng tuyển: 2006 TÊN ĐỀ TÀI: “Thử nghiệm sản xuất phơi bị in vitro xác định trước giới tính” NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG • Thu nhận buồng trứng từ lị mổ, chọc hút trứng ni trứng trưởng thành • Khảo sát yếu tố ảnh hưởng nhiệt độ, loại tinh sử dụng đến tỷ lệ trứng trưởng thành, tỷ lệ thụ tinh ống nghiệm phát triển phơi • Đơng lạnh phơi để bảo quản theo phương pháp thủy tinh hóa NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày … tháng … năm 2008 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày … tháng …… năm 2008 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Học hàm, học vị, họ tên chữ ký) Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chuyên ngành thơng qua Ngày….tháng….năm 2008 TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi cảm ơn đến Giám Hiệu Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực tiễn quý báu cho suốt năm tháng học cao học trường Đặc biệt xin gửi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Chung Anh Dũng, trưởng phịng Cơng Nghệ Sinh Học thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, hướng dẫn, tạo điều kiện, giúp đỡ, cho nhiều kinh nghiệm quý giá lúc làm đề tài viện để tơi hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị em làm việc phòng, đặc biệt chị Ngọc Minh, chị Quỳnh Lan giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp cao học ngành Công Nghệ Sinh Học tháng ngày học bên nhau, trao đổi kiến thức giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối xin cảm ơn gia đình bên con, hy sinh nhiều cho sống Tp HCM, ngày 30 tháng 11 năm 2008 Lê Cơng Thiện iv TĨM TẮT Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (IVF) áp dụng chăn nuôi sử dụng phổ biến nhiều nước giới Kỹ thuật IVF sử dụng chăn nuôi nhằm gia tăng nhanh số lượng đàn gia súc, khai thác tiềm di truyền đực lẫn Ngồi cịn cung cấp vật liệu phôi với số lượng nhiều cho nhà nghiên cứu với nghiên cứu khác Kỹ thuật IVF kết hợp với số phương pháp xác định giới tính phơi trở thành cơng cụ đắc lực cho nhà chọn giống chăn nuôi nhằm tạo đàn gia súc biết trước giới tính mong muốn Để tạo phơi biết trước giới tính, người ta sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt, phương pháp phân tích thể nhiễm sắc…Đa số phương pháp làm ảnh hưởng đến phôi phải cắt phần phơi để phân tích, ngồi có phương pháp địi hỏi phải có thiết bị đắt tiền kính hiển vi vi thao tác dùng để cắt phôi Trong đề tài này, dùng loại tinh đông lạnh phân loại mang nhiễm sắc thể giới tính X nhằm tạo phơi bị mang cặp nhiễm sắc thể giới tính XX Thí nghiệm tiến hành sau: - Thu nhận buồng trứng lò mỗ tiến hành bảo quản buồng trứng loại nhiệt độ 37oC, nhiệt độ phòng, nhiệt độ 10oC tiếng (đối với nhiệt độ bảo quản 37oC nhiệt độ môi trường) 16 tiếng (đối với nhiệt độ 10oC) nhằm xác định ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản buồng trứng lên tỷ lệ thụ tinh phát triển phơi Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng loại tinh bình thường chưa phân loại giới tính - Tiến hành thụ tinh với hai loại tinh bình thường tinh phân loại giới tính để so sánh tỷ lệ thụ tinh phát triển phôi hai loại tinh - Thử nghiệm đông lạnh phôi theo phương pháp thủy tinh hóa Kết chúng tơi thu sau: Kết tỷ lệ trưởng thành trứng (IVM) thí nghiệm bảo quản buồng trứng nhiệt độ môi trường với khoảng thời gian bảo quản 77.65%, nhiệt độ v 37oC với khoản thời gian bảo quản 68.5%, nhiệt độ 10oC với thời gian bảo quản 16 68.31% Sự sai khác có ý nghĩa nhiệt độ bảo quản môi trường nhiệt độ 37oC, nhiệt độ bảo quản môi trường nhiệt độ 10oC với P < 0.05 Sự sai khác nhiệt độ bảo quản 37oC 10oC khơng có ý nghĩa với P > 0.05 Tỷ lệ thụ tinh (IVF) nhiệt độ bảo buồng trứng 37oC 25.85%, nhiệt độ môi trường 27.17%, nhiệt độ 10oC 6.02% Sự sai khác có ý nghĩa nhiệt độ bảo quản nhiệt độ môi trường nhiệt độ 37oC khơng có ý nghĩa mặt thống kê với P > 0.05 Sự sai khác nhiệt độ bảo quản 37oC 10oC, nhiệt độ mơi trường nhiệt độ 10oC có ý nghĩa mặt thống kê với P < 0.001 Kết phát triển phôi (IVC) cho thấy, nhiệt độ bảo quản buồng trứng nhiệt độ môi trường, số phôi phát triển đến giai đoạn tế bào 27.66%, giai đoạn tế bào 21.28%, giai đoạn tế bào 25.53%, giai đoạn phôi dâu 17.02%, giai đoạn phôi nang 8.51% Đối với thí nghiệm bảo quản buồng trứng 37oC, số phôi phát triển đến giai đoạn tế bào 13.16%, giai đoạn tế bào 52.63%, giai đoạn tế bào 28.95%, giai đoạn phôi dâu 5.26%, khơng ghi nhận có phát triển phơi đến giai đoạn phơi nang Đối với thí nghiệm bảo quản buồng trứng 10oC, số phôi phát triển đến giai đoạn tế bào 60%, giai đoạn tế bào 30%, giai đoạn tế bào 10%, không ghi nhận phát triển phôi giai đoạn phôi dâu phôi nang Ở thí nghiệm ảnh hưởng loại tinh sử dụng lên tỷ lệ thụ tinh phát triển phôi: Tỷ lệ thụ tinh loại tinh giới tính 25.33%, tinh thường 27.17% Sự sai khác ý nghĩa mặt thống kê với P > 0.05 Kết IVC tinh giới tính cho thấy: Các phôi phát triển giai đoạn tế bào 15.79%, giai đoạn tế bào 21.05%, giai đoạn tế bào 21.05%, giai đoạn phơi dâu 42.11%, khơng ghi nhận có phát triển phôi giai đoạn phôi nang Trong loại tinh bình thường cho thấy: số phôi phát triển đến giai đoạn tế bào 27.66%, giai đoạn tế bào 21.28%, giai đoạn tế bào 25.53%, giai đoạn phôi dâu 17.02%, giai đoạn phôi nang 8.51% vi Thử nghiệm đơng lạnh phơi giới tính giai đoạn phôi dâu, nhiên phôi sau rã đơng tiếp tục ni khơng phát triển tiếp đến giai đoạn phơi nang Qua thí nghiệm rút số kết luận sau: -Nhiệt độ bảo quản buồng trứng nhiệt độ mơi trường vịng thích hợp cho trưởng thành trứng in vitro, tỷ lệ thụ tinh phát triển phôi -Việc sử dụng loại tinh giới tính khơng ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh so với loại tinh bình thường Tuy nhiên phát triển phơi so với thí nghiệm sử dụng loại tinh bình thường vii SUMMARY The in vitro fertilization technique (IVF) has been applied in husbandry in many coutries This techque aimes at increasing the animal number in the herd and exployed the genetic potential of both male and female animal Besides, it also supplies the materials for the scientists in other researches The IVF combined with the sex-determining techniques has become the powerful tool for the breeder to select the animals with desirable sex In oder to produce the sexed embryos, some methods have been used such as PCR with specific primers, chromosome analysis Unfortunately, these techniques cause harmful to the embryos due to the partly cleavage of the embryos for analyzing Furthermore, They requires some expensive instruments such as micro-manipulating microscope to cleave the embryos In this thesis, we used freezing sex-sorted sperm in oder to produce sexed embryos The experiment was conducted as following: -Collecting the ovaries at the slaughter house and storing at different kinds of temperature: 37oC, environment temperature (ET) in hours and 10oC in 16 hours In this experiment, we used the freezing unsorted sperm - Conducting the IVF with freezing sorted sperm and unsorted sperm - Conducting the cryopreservation of embryos with the vitrification method The results were showed as follow: The maturation rate of oocytes from ovaries stored at environment temperature was 77.65%, at 37oC was 68.5% and at 10oC was 68.31% The difference was significant beetween environment temperature and 37oC storing experiment, between environment temperature and 10oC storing experiment But the maturation rate between 37oC and 10oC storing experiment was not significantly different The in vitro fertilization rate of ovaries stored at 37oC was 25.85%, at environment temperature was 27.17% and at 10oC was 6.02% These rate was significantly different between environment temperature and 10oC storing viii experiment , betweent 37oC and 10oC storing experiment with P < 0.001 But the environment and 37oC storing experiment was not significantly different The embryos development rates showed that: at the environment temperature storing experiment the number of embryos developed to the cell stage was 27.66%, the cell stage was 21.28%, the cell stage was 25.53%, the morula stage was 17.02%, the blastocyst stage was 8.51% At the 37oC storing experiment, the number of embryos developed to the cell stage was 13.16%, the cell stage was 52.63%, the cell stage was 28.95%, the morula stage was 5.26%, and there was no embryos at blastocyst stage At the 10oC storing experiment, the number of embryos developed to the cell stage was 60%, the cell stage was 30%, the cell stage was 10% and there no embryos developed to the morula and blastocyst stage The results of the experiment using two kind of sperm (sorted and unsorted) showed that: The IVF rate was 25.33% when using the freezing sorted sperm and 27.17% when using the freezing unsorted sperm These rates were not significantly different The result of IVC (in vitro culuture) showed that: At the experiment using sorted sperm, the number of embryos developed to the cell stage was 15.79%, the cell stage was 21.05%, the cell stage was 21.05%, the morula stage was 42.11% and there was no embryo developed to the blastocyst stage At the experiment using unsorted sperm showed that: the number of embryos developed to the cell stage was 27.66%, the cell stage was 21.28%, the cell stage was 25.53%, the morula stage was 17.02% and the blastocyst stage was 8.51% The result of cryopreservation showed that embryos that had been cryopreserved had a quite normal appearance But these embryos stopped developing when cultured We concluded that the environment temperature storage in hours is suitable for the maturation of oocytes in vitro, the in vitro fertilization rate, the development of embryos There is no difference between experiment using the sex sorted sperm and unsorted sperm at the IVF rate, but the IVC development was higher at the experiment using the unsorted sperm ix MỤC LỤC Phần I: MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu 1.3 Nội Dung Phần II:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thụ tinh ống nghiệm 2.1.1 Các phương pháp thụ tinh in vitro 2.2 Sơ lược lịch sử phương pháp thụ tinh ống nghiệm (IVF) 2.3 Môi trường nuôi cấy phôi .6 2.3.1 Nước 2.3.2 Các ion 2.3.3 Carbohydrate .7 2.3.4 Các amino acid 2.3.5 Vitamin 2.3.6 Tiền chất nucleic acid 2.3.7 Chelators .9 2.3.8 Các chất chống oxi hóa .10 2.3.9 Kháng sinh 10 2.3.10 Protein .11 2.3.11 Hormone yếu tố tăng trưởng 11 2.3.12 Hệ đệm 11 2.4 Noãn bào trưởng thành noãn bào 12 2.5 Đánh giá kết thụ tinh .15 2.6 Đánh giá phân loại phôi 18 2.6.1 Cơ sở đánh giá phân loại 18 2.6.2 Đánh giá phân loại phôi theo giai đoạn phát triển .20 2.6.3 Đánh giá phân loại phôi theo chất lượng phôi 20 2.6.4 Phơi sử dụng 21 84 Hình 27 Phơi giai đoạn phơi dâu tạo từ việc sử dụng loại tinh giới tính Hình 28 Phơi giới tính giai đoạn phơi dâu, quan sát vật kính 20X 85 PHỤ LỤC 1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản buồng trứng lên trưởng thành trứng Bảng 1.1 Bảng phân tích số liệu trắc nghiệm χ2 thí nghiệm bảo quản nhiệt độ 37oC nhiệt độ môi trường Trị quan sát Oi Nhiệt độ Số trứng trưởng thành Số trứng không trưởng thành Tổng Tỷ lệ trứng trưởng thành Nhiệt độ 37oC 137 63 200 68.5 198 57 255 77.65 335 120 Số trứng không trưởng thành 455 Nhiệt độ môi trường Tổng Số trứng trưởng thành Trị lý thuyết Ei Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ môi trường 147.25 52.75 187.75 67.25 Số trứng trưởng thành Số trứng không trưởng thành Nhiệt độ 37oC (Oi –Ei) /Ei Nhiệt độ mơi trường χ tính tốn : 4.83 χ2 tra bảng (1, 0.05): 3.84 χ2 tính toán > χ2 tra bảng, P < 0.05 0.71 1.99 0.56 1.56 Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ môi trường P Thời gian bảo quản giờ P < 0.05 Số trứng đem nuôi 200 255 Thời gian nuôi 24 24 Số trứng trưởng thành 137 198 Tỷ lệ IVM (%) 68.5 77.65 86 Bảng 1.2 Bảng phân tích số liệu trắc nghiệm χ2 thí nghiệm bảo quản nhiệt độ 37oC nhiệt độ 10oC Trị quan sát Oi Nhiệt độ Số trứng trưởng thành Số trứng không trưởng thành Tổng Tỷ lệ trứng trưởng thành Nhiệt độ 37oC 137 63 200 68.5 125 58 183 68.31 262 121 Số trứng không trưởng thành 383 Nhiệt độ 10oC Tổng Số trứng trưởng thành Trị lý thuyết Ei Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ 10oC 136.81 63.19 125.19 57.81 Số trứng không trưởng thành Số trứng trưởng thành Nhiệt độ 37oC 0.0003 (Oi –Ei)2 /Ei Nhiệt độ 10oC 0.0003 χ2 tính tốn : 0.0017 χ2 tra bảng (1, 0.05): 3.84 χ2 tính tốn < χ2 tra bảng, P > 0.05 0.0005 0.0006 Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ 100C Thời gian bảo quản 16 Số trứng đem nuôi 200 183 24 24 Số trứng trưởng thành 137 125 Tỷ lệ IVM (%) 68.5 68.31 Thời gian nuôi P P > 0.05 87 Bảng 1.3 Bảng phân tích số liệu trắc nghiệm χ2 thí nghiệm bảo quản nhiệt độ mơi trường nhiệt độ 10oC Trị quan sát Oi Nhiệt độ Số trứng trưởng thành Số trứng không trưởng thành Tổng Tỷ lệ trứng trưởng thành Nhiệt độ môi trường 198 57 255 77.65 125 58 183 68.31 323 115 Số trứng không trưởng thành 438 Nhiệt độ 10oC Tổng Số trứng trưởng thành Trị lý thuyết Ei Nhiệt độ môi trường Nhiệt độ 10oC 188.05 66.95 134.95 48.05 Số trứng không trưởng thành Số trứng trưởng thành Nhiệt độ môi 0.5267 trường (Oi –Ei)2 /Ei Nhiệt độ 10oC 0.7339 χ2 tính tốn : 4.8013 χ2 tra bảng (1, 0.05): 3.84 χ2 tính tốn > χ2 tra bảng, P < 0.05 1.4793 2.0613 Nhiệt độ môi trường Thời gian bảo quản Số trứng đem nuôi 255 Thời gian nuôi 24 Số trứng trưởng thành 198 Tỷ lệ IVM (%) 77.65 Nhiệt độ 100C P 16 P < 0.05 183 24 125 68.31 88 1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản buồng trứng đến tỷ lệ IVF Bảng 1.4 Bảng phân tích số liệu thu ngày thứ sau thụ tinh trắc nghiệm χ2 thí nghiệm bảo quản nhiệt độ 37oC nhiệt độ môi trường Trị quan sát Oi Nhiệt độ Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh Tổng Tỷ lệ trứng thụ tinh Nhiệt độ 37oC 38 109 147 25.85 47 126 173 27.17 85 235 Số trứng không thụ tinh 320 Nhiệt độ môi trường Tổng Số trứng thụ tinh Trị lý thuyết Ei Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ môi trường 39.05 107.95 45.95 127.05 Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh Nhiệt độ 37oC (Oi –Ei) /Ei Nhiệt độ mơi trường χ tính tốn : 0.01 χ2 tra bảng (1, 0.05): 3.84 χ2 tính tốn < χ2 tra bảng, P > 0.05 0.03 0.01 0.02 0.01 Nhiệt độ 37oC Thời gian bảo quản Số trứng đem thụ tinh 147 Số hợp tử tạo thành 38 Tỷ lệ IVF (%) 25.85 Nhiệt độ môi trường P P > 0.05 173 47 27.17 89 Bảng 1.5 Bảng phân tích số liệu thu ngày thứ sau thụ tinh trắc nghiệm χ2 thí nghiệm bảo quản nhiệt độ môi trường nhiệt độ 10oC Trị quan sát Oi Nhiệt độ Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh Tổng Tỷ lệ trứng thụ tinh Nhiệt độ môi trường 47 126 173 27.17 10 156 166 6.02 57 282 Số trứng không thụ tinh 339 Nhiệt độ 10oC Tổng Số trứng thụ tinh Trị lý thuyết Ei Nhiệt độ môi trường Nhiệt độ 10oC 29.09 143.91 27.91 138.09 Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh Nhiệt độ môi 11.03 trường (Oi –Ei)2 /Ei Nhiệt độ 11.49 10oC χ2 tính toán : 27.08 χ2 tra bảng (1, 0.001): 10.83 χ2 tính tốn > χ2 tra bảng, P < 0.001 2.23 2.32 Nhiệt độ môi trường Thời gian bảo quản Số trứng đem thụ tinh 173 Số hợp tử tạo thành 47 Tỷ lệ IVF (%) 27.17 Nhiệt độ 10oC P P < 0.001 16 166 10 6.02 90 Bảng 1.6 Bảng phân tích số liệu thu ngày thứ sau thụ tinh trắc nghiệm χ2 thí nghiệm bảo quản nhiệt độ 37oC nhiệt độ 10oC Trị quan sát Oi Trị lý thuyết Ei (Oi –Ei)2 /Ei Nhiệt độ Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh Tổng Tỷ lệ trứng thụ tinh Nhiệt độ 37oC 38 109 147 25.85 10 156 166 6.02 48 265 313 Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh 22.54 124.46 25.46 140.54 Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh 10.60 1.92 9.39 1.70 Nhiệt độ 10oC Tổng Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ 10oC Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ 10oC χ2 tính tốn : 23.60 χ2 tra bảng (1, 0.001): 10.83 χ2 tính tốn > χ2 tra bảng, P < 0.001 Nhiệt độ 37oC Nhiệt độ 10oC P Thời gian bảo quản 16 Số trứng đem thụ tinh 147 166 Số hợp tử tạo thành 38 10 Tỷ lệ IVF (%) 25.85 6.02 P < 0.001 91 1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản buồng trứng lên phát triển phôi 1.4.1 So sánh nhiệt độ bảo quản 37oC nhiệt độ môi trường Bảng 1.7 Phôi giai đoạn tế bào khác Nhiệt độ bảo Phôi tế Phôi tế Phôi tế Tổng quản bào bào bào Nhiệt độ 38 20 11 37oC Nhiệt độ môi 47 13 10 12 trường Phôi dâu Phôi nang Bảng 1.8 Tỷ lệ % số phôi giai đoạn tế bào khác Nhiệt độ bảo Phôi tế Phôi tế Phôi tế Phôi dâu quản bào (%) bào (%) bào (%) (%) o Nhiệt độ 37 C 13.16 52.63 28.95 5.26 Nhiệt độ môi 27.66 21.28 25.53 17.02 trường Phôi nang (%) 0.00 8.51 1.4.2 So sánh nhiệt độ bảo quản 37oC nhiệt độ 10oC Bảng 1.9 Phôi giai đoạn tế bào khác Nhiệt độ Phôi tế Phôi tế Phôi tế Tổng bảo quản bào bào bào Nhiệt độ 38 20 11 37oC Nhiệt độ 10 10oC Phôi dâu Phôi nang 0 Bảng 1.10 Tỷ lệ % số phôi giai đoạn tế bào khác Nhiệt độ bảo Phôi tế Phôi tế Phôi tế Phôi dâu quản bào (%) bào (%) bào (%) (%) o Nhiệt độ 37 C 13.16 52.63 28.95 5.26 o Nhiệt độ 10 C 60.00 30.00 10.00 0.00 Phôi nang (%) 0.00 0.00 92 1.4.3 So sánh nhiệt độ bảo quản nhiệt độ môi trường nhiệt độ 10oC Bảng 1.11 Phôi giai đoạn tế bào khác Nhiệt độbảo Phôi tế Phôi tế Phôi tế Tổng quản bào bào bào Nhiệt độ môi 47 13 10 12 trường Nhiệt độ 10 10oC Phôi dâu Phôi nang 0 Bảng 1.12 Tỷ lệ % số phôi giai đoạn tế bào khác Nhiệt độ bảo Phôi tế Phôi tế Phôi tế Phôi dâu quản bào (%) bào (%) bào (%) (%) Nhiệt độ môi 27.66 21.28 25.53 17.02 trường Nhiệt độ 10oC 60.00 30.00 10.00 0.00 Phôi nang (%) 8.51 0.00 1.5 Ảnh hưởng loại tinh sử dụng đến kết tỷ lệ thụ tinh Bảng 1.13 Ảnh hưởng loại tinh lên tỷ lệ IVF Tinh giới tính Tinh thường Nhiệt độ bảo quản Thời gian bảo quản Nhiệt độ môi trường Nhiệt độ môi trường giờ Số trứng đem thụ tinh 75 173 Số trứng thụ tinh 19 47 25.33 27.17 Tỷ lệ IVF P P > 0.05 93 Bảng 1.14 Bảng phân tích số liệu thu ngày thứ sau thụ tinh trắc nghiệm χ2 thí nghiệm sử dụng loại tinh bình thường loại tinh giới tính Trị quan sát Oi Loại tinh sử dụng Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh Tổng Tỷ lệ trứng thụ tinh Tinh giới tính 19 56 75 25.33 Tinh thường 47 66 126 182 173 248 27.17 Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh 19.96 46.04 55.04 126.96 Số trứng thụ tinh Số trứng không thụ tinh 0.05 0.02 0.02 0.01 Tổng Trị lý thuyết Ei (Oi –Ei)2 /Ei Tinh giới tính Tinh thường Tinh giới tính Tinh thường χ tính tốn : 0.09 χ2 tra bảng (1; 0.05): 3.84 χ2 tính tốn < χ2 tra bảng, P > 0.05 1.6 Ảnh hưởng loại tinh sử dụng đến phát triển phôi Bảng 1.15 Phôi giai đoạn tế bào khác Loại tinh Phôi tế Phôi tế Phôi tế Tổng sử dụng bào bào bào Tinh giới 19 4 tính Tinh 47 13 10 12 thường Phôi dâu Phôi nang 8 Bảng 1.16 Tỷ lệ % số phôi giai đoạn tế bào khác Loại tinh sử Phôi tế Phôi tế Phôi tế Phôi dâu dụng bào (%) bào (%) bào (%) (%) Tinh giới tính 13.16 52.63 28.95 5.26 Tinh thường 27.66 21.28 25.53 17.02 Phôi nang (%) 0.00 8.51 94 PHỤ LỤC 2.1 Môi trường lấy mẫu buồng trứng lò mổ Thành phần NaCl Nước cất Penicilin Streptomycin Hàm lượng 9g 1000ml 100.000 IU (60,35mg) 10mg Ghi chú: Có thể pha nước muối hấp tiệt trùng trước sau ngày lấy mẫu buồng trứng, bổ sung thành phần kháng sinh vào 2.2 Môi trường chọc hút trứng Tiến hành pha D-PBS (+): Thành phần D-PBS (mã số D8662) Glucose.H2O Sodium pyruvate Hàm lượng 100 ml 0.11g 0.0036g Lọc vô trùng màng lọc 0.22 µm tủ cấy vơ trùng, sau trữ lạnh tủ lạnh tuần Hôm ngày lấy mẫu trứng, bổ sung thêm thành phần : Thành phần D-PBS (+) Calf serum Penicillin Streptomycin Hàm lượng 97 ml ml 6,035mg 10 mg Lọc môi trường màng lọc tủ cấy vơ trùng, tạo đĩa rửa có phủ dầu khống, phần lại cho vào tủ CO2 nhiệt độ 38.5 0C, 5% CO2 hai trước sử dụng 95 2.3 Môi trường nuôi trứng trưởng thành Thành phần TCM-199 (M7528) Calf serum Penicillin Streptomycin Hàm lượng 9,5 ml 0,5 ml 0.6035mg 1mg Lưu ý: -Pha ngày lấy trứng, lọc vô trùng môi trường tủ cấy vô trùng -Tạo đĩa rửa (2.5-3.5ml cho đĩa) đĩa vi giọt ni có phủ dầu khoáng, để tủ CO2 nhiệt độ 38.5o C, 5% CO2 Mơi trường cho hoạt hóa tinh thụ tinh Dung dịch BO Dung dịch A-BO Thành phần Hàm lượng NaCl 4.3092g KCl 0.1974g CaCl2.2H2O 0.2171g NaH2PO4.2H2O 0.0840g MgCl2.6H2O 0.0697g Phenol red (0.5%) 0.1ml Nước siêu Thêm vào cho đủ 500ml Dung dịch B-BO Thành phần NaHCO3 Phenol red (0.5%) Nước siêu Hàm lượng 2.5873g 0.04ml Thêm vào cho đủ 200ml Lưu ý: A-BO B-BO trữ lạnh tủ lạnh tháng 96 Môi trường BO Thành phần Hàm lượng Dung dịch A-BO Sodium pyruvate Penicilin Streptomycin Dung dịch B-BO 76ml 0.01375g 10000 IU 10mg 24 ml Lưu ý: -Dung dịch BO hoàn chỉnh pha ngày sử dụng -Các thành phần dung dịch A phải hòa tan theo thứ tự -10 lần khối lượng NaH2PO4.2H2O MgCl2.6H2O hịa tan 10ml nước siêu lấy 1ml dung dịch sử dụng -Tiệt trùng môi trường phương pháp lọc Dung dịch rửa tinh Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO Na Caffeine Benzoate Heparin (“Novo-heparin”: 5000U/ml) Lưu ý: cần pha khoảng 20-25ml đủ cho Dung dịch rửa trứng Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO BSA (Bovine serum albumin) 40ml 400mg 50 ml 0.1942g 50µl lần hoạt hóa Lưu ý: Chỉ cần pha 10-20 ml tùy theo lượng trứng hay nhiều Dung dịch pha loãng tinh Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO BSA (Bovine serum albumin) 10ml 200 mg Lưu ý: Chỉ cần pha 5ml cho lần hoạt hóa 97 Mơi trường nuôi phôi CR1aa A-CR1aa Thành phần Hàm lượng NaCl KCl Na pyruvate NaHCO3 Phenol red Nước siêu 6.7031g 0.2311 0.0440 2.2011 0.01 (10 µg/ml) Up to 770 ml Lưu ý: Lọc tiệt trùng màng lọc trữ lạnh tháng B-CR1aa Thành phần Hàm lượng Hemicalcium lactate Nước siêu 0.5996 g Thêm vào 200ml Lưu ý: Lọc tiệt trùng màng lọc trữ lạnh tháng Mơi trường CR1aa Thành phần Hàm lượng A-CR1aa B-CR1aa BME Essential Amino Acid MEM Non Essential Amino Acid L – Glutamic Acid (20 mg/ml) BSA (Bovine Serum Albumin Penicillin – G (100IU/ml) Streptomycin Sulfate (100µg/ml) 7.7ml 2ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 3mg/ml 10000IU 10mg Lưu ý: Lọc tiệt trùng màng lọc, tạo vi giọt rữa, tạo vi giọt nuôi đặt vào tủ ấm CO2 38.5oC, 5% CO2 Tạo vi giọt nuôi phôi giống với ni trứng trưởng thành Mơi trường trữ tủ lạnh tuần 98 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: LÊ CƠNG THIỆN Phái: Nam Sinh ngày: 13/01/1983 Nơi sinh: Cần Thơ Địa liên lạc: 110/17 Hàm Nghi Phường Bến Nghé Q1 TPHCM Điện Thoại nhà: 0832719446 Di động: 0989367443 QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Năm 2005: Tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Năm 2006 – 2008: Tham dự lớp cao học khóa 2006 – 2008, ngành Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Tp.HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC Từ 11/2005 – 01/2006: Nhân viên phịng kiểm nghiệm vi sinh thuộc cơng ty chế biến thủy sản thực phẩm Thành Hải Khu cơng nghiệp Tân Tạo Quận Bình Tân Tp HCM Từ 10/2007 đến nay: Nhân viên phịng cơng nghệ sinh học thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm Q1 Phường Đa Kao Tp HCM ... Phái: Nam Sinh ngày: 13/01/1983 Nơi sinh: Cần Thơ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106685 Năm trúng tuyển: 2006 TÊN ĐỀ TÀI: ? ?Thử nghiệm sản xuất phơi bị in vitro xác định trước giới tính? ??... hồn tồn, 31 phôi không bắt màu 10 phôi không rõ Để làm sáng tỏ trường hợp này, bảy phôi xác định giới tính đem cấy truyền cho bị nhận Kết sáu bảy bê dự đoán trước giới tính sinh xác White cộng... phơi xác định phôi đực 31% phôi Kết tương ứng với kết 26 xác định giới tính qua phân tích thể nhiễm sắc Cũng tác giả White cộng sự, 1987 tiến hành cấy phôi với phương pháp xác định giới tính phơi