NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG IVM VÀ IVC ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG IVM VÀ IVC ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ LAN CHI Niên khóa : 2007 - 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG IVM VÀ IVC ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS CHUNG ANH DŨNG LÊ THỊ LAN CHI Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Bốn năm đại học trơi qua thật nhanh Và để tơi có ngày hôm kết cố gắng thân mà kết động viên giúp đỡ từ nhiều phía Vì vậy, với lòng biết ơn sâu sắc tơi tha thiết gửi lời cảm ơn đến: Ba mẹ em tôi, người yêu thương hết mực, bên cạnh động viên, an ủi tiếp thêm cho sức mạnh, động lực để vượt qua khó khăn, hồn thành bốn năm học hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Thầy Chung Anh Dũng, người thầy tận tụy công việc, cung cấp cho nhiều kiến thức quý báo, đặc biệt kiến thức kỹ thuật IVF, kỹ thuật Thầy tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt khóa luận Anh Nguyễn Chí Hiếu chị Hồng Ngọc Minh, anh chị theo sát giúp đỡ tơi từ ngày đầu thực khóa luận Cảm ơn anh chị nhiều ln đồng hành tơi cách u thương tận tình Tồn thể quý thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học tận tình dạy truyền đạt tri thức khoa học cho bốn năm học trường, tạo cho sở khoa học vững để hồn thành tốt khóa luận cơng việc tương lai i TÓM TẮT Trong luận văn này, trứng chọc hút từ buồng trứng thụ tinh với tinh trùng tươi Sau thu lò mổ, buồng trứng vận chuyển phòng thí nghiệm nước muối sinh lý (0,9% NaCl) Sau thời gian bảo quản, buồng trứng chọc hút bơm tiêm 10 ml với đầu kim 18G Trứng nuôi dung dịch TCM-199 (bổ sung 5% huyết bê) có bổ sung 5% dịch nang trứng với thời gian 36 - 40 Trứng trưởng thành thụ tinh với tinh trùng nồng độ 2-3 x 106 tế bào/ml Sau nuôi cấy, tinh trùng rửa trứng tiếp tục nuôi môi trường Cr1aa có bổ sung 5% FBS IGF-1 với nồng độ 0, 10, 20 ng/ml Tồn quy trình ni cấy tiến hành điều kiện nhiệt độ 38,5oC 5% CO2 Kết thu cho thấy nghiệm thức có bổ sung 5% dịch nang trứng khơng có bổ sung dịch nang trứng cho thấy khác biệt có ý nghĩa tỉ lệ trứng trưởng thành (P=0,00269) Bổ sung dịch nang trứng vào môi trường nuôi trứng trưởng thành làm tăng tỉ lệ trứng trưởng thành Với nhóm nghiệm thức bổ sung IGF-1 với nồng độ 0, 10, 20 ng/ml tỉ lệ phôi dâu hai nghiệm thức 10 ng/ml (20,63%) 20 ng/ml (12,5%) cao so với tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức ng/ml (10,45%).Và tỉ lệ phôi dâu đạt cao nghiệm thức 10 ng/ml Tuy nhiên, khác biệt tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức khơng có ý nghĩa (P=0,2417) Việc kết hợp bổ sung 5% dịch nang trứng môi trường nuôi trứng trưởng thành 0, 10, 20 ng/ml IGF-1 vào môi trường ni phơi tạo nên khác biệt có ý nghĩa tỉ lệ trứng chín (P= 0,0014) Tuy nhiên, tỉ lệ thụ tinh nghiệm thức ni mơi trường có khơng có bổ sung 5% dịch nang trứng khác biệt khơng có ý nghĩa (P=0,8319) Tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức có bổ sung 5% dịch nang trứng 0, 10, 20 ng/ml IGF-1 22,22%, 21,43%, 25% khơng có khác biệt có ý nghĩa tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức (P=0,8319) ii SUMMARY Thesis title: “Research to improve IVM and IVC medium to enhance in vitro production of porcine embryos” In this study, oocytes aspirated from ovaries were fertilized with fresh semen After collected from a slaughterhouse, ovaries were transported to the laboratory in physiological saline solution (0.9% NaCl) with antibiotic At the laboratory, ovaries were aspirated immediately by using a 10 ml syringe with 18G needle Oocytes were incubated in TCM-199 medium (supplemented with 5% calf serum and 5% porcine follicular fluid) for 36–40 hours Maturated oocytes were fertilized with sperm at a concentration of 2-3 x 106 cells/ml After hours co-culture, sperm was washed away and oocytes were continuously cultured in Cr1aa medium supplied with 5% FBS and IGF-1 at the concentrations of 0, 10, 20 ng/ml Culture condition was carried out at 38.5oC and 5% CO2 The result showed that two treatments added with 5% porcine follicular fluid were significantly higher than that of the control treatment in IVM rates (P=0.0026) The addition of follicular fluid into maturation medium increased rate of mature oocyte In experimental groups supplied with IGF-1 at the concentrations of 0, 10, 20 ng/ml, morula rate in 10 ng/ml treatment (20.63%) and 20 ng/ml treatment (12.5%) were higher than rate of morula in ng/ml control group (10.45%) And highest rate of morula was in 10 ng/ml treatment However, different rates of morula in three treatments were no significant (P=0.2417) Supplement both 5% porcine follicular fluid in IVM medium and 0, 10, 20 ng/ml IGF-1 in IVC medium created significant differences in rate of mature oocytes (P= 0.0014) Yet, in two additional treatments with 5% porcine follicular fluid and no additional porcine follicular fluid, rates of fertilization were not significant difference (P=0.8319) Morula rate in treatments were 22.22%, 21.43%, 25% respectively and there was no significant difference in these three treatments (P=0.8319) iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung .3 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Lịch sử tạo phôi heo in vitro 2.1.3 Các nghiên cứu nước thuộc lĩnh vực đề tài 2.1.3.1 Trên giới .4 2.1.3.2 Tại Việt Nam 2.2 Cơ sở khoa học kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm 2.2.1 Sinh lý sinh sản heo .5 2.2.1.1 Hệ sinh dục 2.2.1.2 Quá trình sinh giao tử – trứng 2.2.2 Sinh lý sinh sản heo đực 2.2.2.1 Hệ sinh dục đực 2.2.2.2 Quá trình sinh tinh 2.2.2.3 Đặc điểm tinh trùng 10 iv 2.2.3 Quá trình thụ tinh .11 2.2.3.1 Sự hoạt hóa tinh trùng 11 2.2.3.2 Sự thụ tinh 11 2.2.4 IGF-1 chế kháng apoptosis 12 2.2.5 Các giai đoạn phát triển phôi 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 19 3.2.1 Vật liệu 19 3.2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.2.1.2 Thiết bị, hóa chất dụng cụ 19 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.2.1 Thu nhận buồng trứng từ lò mổ 20 3.2.2.2.Chọc hút trứng phòng thí nghiệm .20 3.2.2.3 Giai đoạn nuôi trứng trưởng thành 21 3.2.2.4 Thụ tinh vi giọt 21 3.2.2.5 Phương pháp thu chuẩn bị dịch nang trứng (FF) .23 3.2.3 Bố trí thí nghiệm 23 3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng dịch nang trứng .23 3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng IGF-1 lên khả tạo phơi in vitro 24 3.2.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng dịch nang trứng IGF-1 24 3.2 4.Xử lí số liệu .25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết 26 4.1.1 Ảnh hưởng dịch nang trứng lên trưởng thành trứng 26 4.1.2 Ảnh hưởng IGF-1 lên lên khả tạo phôi in vitro 27 4.1.3 Ảnh hưởng dịch nang trứng IGF-1 lên tỉ lệ tạo phôi heo in vitro 28 4.2 Thảo luận 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 v 5.1 Kết luận .33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA (Bovine Serume Albumin): albumin huyết bò BO (Brackett – Oliphant): môi trường dùng bước hoạt hóa tinh rửa trứng CS (Calf Serum): huyết bê D-PBS (Dubelco’s Phosphate Buffer Saline): dung dịch đệm phosphate Dubelco FBS (Fetal Bovine Serum): huyết thai bò FF (Follicle Fluid): dịch nang trứng FSH (follicle-stimulating hormone): hormone kích thích nang trứng GV (Gerninal Vesicle): nỗn giai đoạn túi mầm GVBD (Gerninal Vesicle Break Down): noãn giai đoạn tan biến túi mần hCG (Human chorionic gonadotropin) IGF-1 (Insulin-like growth factor 1) IVC (In Vitro Culture): giai đoạn ni phơi điều kiện phòng thí nghiệm IVF (In Vitro Fertilization): thụ tinh điều kiện phòng thí nghiệm IVM (In Vitro Maturation): nuôi trứng trưởng thành điều kiện phòng thí nghiệm IVP (In Vitro production): sản xuất ống nghiệm LH (Luteinizing hormone): hormone gây rụng trứng NST: nhiễm sắc thể PMSG (Pregnant Mare's Serum Gonadotropin): huyết ngựa chữa PZM3: Porcine zygote medium TCM-199 (Tissue Culture Media): môi trường nuôi trứng trưởng thành vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các loại hóa chất mục đích sử dụng .19 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm .25 Bảng 4.1 Kết khảo sát bổ sung dịch nang trứng 26 Bảng 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng IGF-1 nồng độ 10, 20 ng/ml 27 Bảng 4.3 Kết khảo sát bổ sung kết hợp yếu tố dịch nang trứng IGF-1 28 viii 4.1.2 Ảnh hưởng IGF-1 lên lên khả tạo phôi in vitro Bảng 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng IGF-1 hai nồng độ 10 20 ng/ml bổ sung vào môi trường nuôi phôi Chỉ tiêu theo dõi Nồng độ IGF-1 (ng/ml) Đối chứng 10 20 Số trứng IVF 187 146 92 Số phôi 67 63 32 Số phôi dâu 13 10,45 20,63 12,5 Tỉ lệ phôi dâu (%) Tỉ lệ phôi dâu hai nghiệm thức 10 ng/ml (20,63%) 20 ng/ml (12,5%) cao so với tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức ng/ml (10,45%) Và tỉ lệ phôi dâu đạt cao nghiệm thức 10 ng/ml Tuy nhiên, khác biệt tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức khơng có ý nghĩa (P=0,2417) Ngay so sánh tỉ lệ phôi dâu cặp nghiệm thức (0 ng/ml-10 ng/ml; ng/ml-20 ng/ml 10 ng/ml-20 ng/ml) khác biệt khơng có ý nghĩa (P=0,1076; P=0,7612; P=0,3282, tương ứng) Như vậy, IGF-1 bổ sung vào môi trường nuôi phôi nồng độ 10 ng/ml 20 ng/ml có xu hướng cải thiện khả phát triển phơi heo in vitro Hình 4.2 Sự phân chia ngày thứ sau thụ tinh 27 4.1.3 Ảnh hưởng dịch nang trứng IGF-1 lên tỉ lệ tạo phôi heo in vitro Bảng 4.3 Kết khảo sát bổ sung kết hợp yếu tố dịch nang trứng IGF-1 Chỉ tiêu theo dõi Số trứng thực IVM Số trứng chin Tỷ lệ trứng chín (%) Số trứng thực IVF Số trứng thụ tinh Tỷ lệ thụ tinh (%) Số phôi tạo thành, gồm: tế bào tế bào tế bào phôi dâu phôi nang sớm Tỷ lệ phôi dâu (%) Khơng có dịch nang trứng 10 20 Tổng ng/ml ng/ml ng/ml NT NT NT Có 5% dịch nang trứng 10 20 Tổng ng/ml ng/ml ng/ml NT NT 10 NT 11 25 25 25 75 25 25 25 75 13 14 12 39 19 21 20 60 52 56 48 52 76 84 80 80 13 14 12 39 19 21 20 60 10 21 14 31 46,15 71,43 41,67 53,85 47,37 66,67 40 51,67 10 21 14 31 1 2 7 5 1 2 3 2 10 16,67 20 40 23,81 22,22 21,43 25 22,58 Ở nghiệm thức 9, 10, 11, dịch nang trứng cho thấy hiệu rõ ràng việc tác động lên trưởng thành trứng Các nghiệm thức ni mơi trường có dịch nang trứng cho tỉ lệ trứng trưởng thành khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức nuôi môi trường không chứa dịch nang trứng (nghiệm thức 6, 7, 8) (P=0,0014) Tuy nhiên, tỉ lệ thụ tinh nghiệm thức ni mơi trường có khơng có bổ sung 5% dịch nang trứng khác biệt khơng có ý nghĩa (P=0,8319) 28 100,00% Tỉ lệ (%) 80,00% Tỷ lệ trứng chín Tỷ lệ thụ tinh Tỷ lệ phôi dâu 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% NT NT NT NT NT 10 NT 11 Nghiệm thức Biểu đồ 4.1 Tỉ lệ trứng chín, thụ tinh phôi dâu nghiệm thức Tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức 9, 10, 11 có bổ sung IGF-1 vào môi trường nuôi phôi với nồng độ 0,10, 20 ng/ml có khác biệt khác biệt khơng có ý nghĩa (P=0,8319) Hơn so sánh tỉ lệ phôi dâu cặp nghiệm thức (9 - 10; 10 - 11 - 11) khác biệt khơng có ý nghĩa (P=0,9640; P=0,8475; P=0,8927) Tuy nhiên, nghiệm thức 10 (có bổ sung 5% dịch nang trứng 10 ng/ml IGF-1) có tỉ lệ trứng chín tỉ lệ phôi cao (84% 20%) Như vậy, nói việc bổ sung 5% dịch nang trứng môi trường nuôi trứng 10 ng/ml vào mơi trường ni phơi có xu hướng cải thiện tỉ lệ tạo phơi heo in vitro Hình 4.3 Trứng thụ tinh xuất thể cực thứ (A: thể cực) 29 Hình 4.4 Các loại phơi heo (A, B: phôi heo tế bào; C: phôi heo tế bào; D: phôi dâu) 4.2 Thảo luận Trong thí nghiệm 1, trứng heo ni mơi trường có bổ sung dịch nang trứng, tỉ lệ trưởng thành trứng cao nhiều so với trứng heo nuôi môi trường không bổ sung dịch nang trứng khác biệt có ý nghĩa Vì dịch nang trứng có chứa yếu tố thơng thường kích thích tố, protein yếu tố tăng trưởng, chứng minh có lợi cho trưởng thành trứng Điều khẳng định kết nghiên cứu nhiều tác giả giới (Georgios Vatzias Daniel R Hagen, 1999; K Naito, Y Fukuda Y Toyoda, 2005; J Bijttebier cộng sự, 2008, Margot Charles Graves, 2001) Và trứng bò ni bổ sung dịch nang trứng bò tỉ lệ trưởng thành trứng cao nhiều so với đối chứng (Romero-Arredondo A, Seidel GE Jr, 1995) Mặt khác, Ainsworth cộng (1980) chứng minh thành phần khác dịch nang trứng thay đổi tùy vào giai đoạn phát triển nang trứng Do đó, việc sử dụng dịch nang trứng từ nang trứng có kích thước lớn (trên mm) bổ sung 30 vào môi trường nuôi trứng nghiên cứu Margot Charles Graves (2001) cho tỉ lệ trứng trưởng thành cao (89,5%) so với tỉ lệ trứng trưởng thành thí nghiệm (80%) sử dụng dịch nang trứng từ nang có kích thước nhỏ 0,5 mm Hơn thế, nghiên cứu Zai-Dong Hua1, Xin-Min Zheng, Qing-Xin Wei, Hou-Qiang Xu1, Ya-Gang Wang, Xi-Mei Liu, Li Li, Hong-Wei Xiao Xian-Feng Qiao (2010) chứng minh loại trứng có ảnh hưởng lên khả trưởng thành trứng, phân chia hình thành túi phơi Bởi vì, tỉ lệ trưởng thành trứng loại A B (83,2% 65,7%) cao trứng loại C (28,2%) nhiều kết nghiên cứu tác giải Tuy nhiên, nghiên cứu điều kiện nguồn mẫu hạn chế, việc chọn lọc trứng có đủ tiêu chuẩn đảm bảo số lượng cho thí nghiệm khó khăn Điều giải thích tỉ lệ trứng trưởng thành nghiên cứu (80%) thấp so với nghiên cứu khác điều kiện thí nghiệm Yếu tố tăng trưởng IGF-1 chuỗi polypeptide đơn, kích thước 7,6 kDa có cấu trúc tương tự insulin, tổng hợp gan nguyên bào sợi tìm thấy dịch nang trứng (Spier Echternkamp, 1995), ống tử cung (Schmidt cộng sự, 1994), buồng trứng tử cung (Geisert cộng sự, 1991) có ảnh hưởng đến trưởng thành trứng phát triển phơi thai (Watson cộng sự, 1999), kiểm sốt tăng trưởng việc phân chia tế bào Vì vậy, IGF-I bổ sung vào môi trường trưởng thành trứng môi trường nuôi phôi in vitro chuột (Doherty cộng sự, 1994.), thỏ (Herrler cộng sự, 1998) người (Spanos Becker, 2000) để tăng cường phát triển cách giảm necrocytosis tăng phân chia tế bào (Devreker Hardy, 1997) Trong nghiên cứu trước đây, IGF-1 bổ sung vào mơi trường ni phơi bò 50 - 100 ng/ml (Byrne cộng sự, 2002; Sirisathien cộng sự, 2003) , chuột 30 100 ng/ml (Desai cộng sự, 2000; Fabian cộng sự, 2004) heo khảo sát nồng độ 0, 1, 10, 50, 100 ng/ml (Kim S cộng sự, 2005), 100 - 200 ng/ml (Ping Xia1, Francis R Tekpetey1,2, Dr David T Armstrong1, 2005) Nhóm tác giả đưa kết luận nồng độ 200 ng/ml IGF-1 có tác động tích cực đến phát triển phôi giai đoạn tế bào Tuy nhiên, nghiên cứu này, IGF-1 bổ sung vào môi trường nuôi phôi 31 (CR1aa) nồng độ 0, 10, 20 ng/ml kết cho thấy IGF-1 khơng có tác dụng đáng kế suốt q trình phát triển phơi Điều tương tự kết nghiên cứu Kim, J Y cộng (2009) báo cáo sử dụng IGF-1 bổ sung vào môi trường nuôi phôi (PZM3) nồng độ 0, 10, 20 ng/ml Mặt dù vậy, kết nghiên cứu cho thấy IGF-1 có xu hướng cải thiện khả phát triển kéo dài thời gian sống phôi heo in vitro tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức 10 ng/ml 20 ng/ml cao hẳn so với đối chứng nồng độ 10 ng/ml tỉ lệ lên tới 20,63% Việc kết hợp bổ sung dịch nang trứng môi trường nuôi trứng IGF-1 (nồng độ 0, 10, 20 ng/ml) có tác động tích cực lên trưởng thành trứng Tuy nhiên, không cải thiện nhiều tỉ lệ thụ tinh tỉ lệ phôi dâu nuôi cấy in vitro Điều số nguyên nhân chất lượng tinh trùng, chất lượng trứng đem ni kém; thao tác chưa tốt, tốc độ tiến hành cơng việc chậm nên làm giảm khả phát triển trứng phôi Hơn nữa, thời gian thực nghiên cứu hạn chế nên số lần lặp lại thí nghiệm chưa nhiều, dẫn đến số mẫu nghiên cứu ít, điều ảnh hưởng đến kết thống kê Đây mặt hạn chế cần khắc phục nghiên cứu 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Dịch nang trứng có tác động tích cực lên trưởng thành trứng heo, bổ sung vào môi trường nuôi trứng trưởng thành Tỉ lệ trứng trưởng thành mơi trường có bổ sung dịch nang trứng 80% không bổ sung dịch nang trứng 59,69% IGF-1 bổ sung vào mơi trường ni phơi có xu hướng cải thiện khả phát triển phôi heo in vitro Tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml 10,45%, 20,63%, 12,5% Việc kết hợp bổ sung 5% dịch nang trứng môi trường nuôi trứng trưởng thành (TCM-199) 0, 10, 20 ng/ml IGF-1 môi trường nuôi phôi (CR1aa) góp phần cải thiện tỉ lệ trứng trưởng thành Tuy nhiên, chưa tạo khác biệt rõ tỉ lệ thụ tinh tỉ lệ phôi dâu nghiệm thức 0, 10, 20 ng/ml IGF-1 (22,22%, 21,43%, 25%) 5.2 Đề nghị Tiếp tục tiến hành thí nghiệm để kiểm tra cách đầy đủ khả phát triển trứng phơi, từ đưa kết luận cuối ảnh hưởng dịch nang trứng IGF-1 nhóm nghiệm thức 0, 10, 20 ng/ml lên tỉ lệ phôi heo in vitro Khảo sát tác động IGF-1 nồng độ khác 50, 100, 200 bổ sung vào môi trường ni phơi khác (CR1aa, PZM3, mCR1a) Ngồi dịch nang, đa dạng hóa chất bổ sung vào mơi trường nuôi trứng GH, FSH/LH 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Thị Dân Dương Nguyên Khang 2006 Sinh lý vật nuôi Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Chung Anh Dũng 2007 Thuyết minh đề tài nghiên cứu thử nghiệm sản xuất phơi bò in vitro xác định trước giới tính TP Hồ Chí Minh Huế Phan Vũ Hải 2006 Bài giảng sinh sản gia súc Trường Đại học Nông lâm Huế, Viện chăn nuôi 2000 Chuyên san thụ tinh ống nghiệm Số 5-2000 Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm Lê Văn Ban 2007 Giáo trình chăn ni trâu bò Trường Đại học Nơng nghiệp 1, Hà Nội Hồ Mạnh Tường, Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan, Chung Anh Dũng, Nguyễn Thanh Bình, Huỳnh Gia Bảo,Trương Thị Thanh Bình, Nguyễn Hữu Duy, Lê Thụy Hồng Khả, Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Khánh Linh, Nguyễn Thị Mai, Giang Quỳnh Như, Hà Thanh Quế, Nguyễn Ngọc Quỳnh, Mai Công Minh Tâm 2011 Thụ tinh ống nghiệm Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Tiếng Anh Masui Y, Clarke HJ Oocyte maturation 1979 Int Rev Cytol 57:185-282 David G Armstrong and Robert Webb 1997 Ovarian follicular dominance: the role of intraovarian growth factors and novel proteins Reviews of reproduction 2:139146 Ping Xia, Francis R Tekpetey, Dr David T Armstrong 1994 Effect of IGF-I on pig oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development in vitro, and on granulosa and cumulus cell biosynthetic activity Molecular Reproduction and Development 38(4):373–379 Richter KS 2008 The importance of growth factors for preimplantation embryo development and in-vitro culture Curr Opin Obstet Gynecol 20(3):292-304 Kim S, Lee GS, Lee SH, Kim HS, Jeong YW, Kim JH, Kang SK, Lee BC, Hwang WS 2005 Sep Embryotropic effect of insulin-like growth factor (IGF)-I and its receptor on development of porcine preimplantation embryos produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer Mol Reprod Dev 72(1):88-97 Kim, J Y.; Park, M C.; Kim, S B.; Park, H D.; Lee, J H.; Kim, J M 2009 Effects of IGF-I and EGF supplemented to PZM3 culture medium on the development of porcine embryos in vitro Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 22(8):11171123 34 Margot Alves Nunes Dode Charles Graves 2001 Influence of hormones and follicular fluid on maturation of pig oocytes Cienc Rural 31(1):99-104 Georgios Vatzias, Daniel R Hagen 1999 Effect of Porcine Follicular Fluid and Oviduct-Coditioned Media on Maturation and Fertilization of Porcine Oocytes In Vitro Biology of reproduction 60:42-48 Resnicoff M, Abraham D, Yutanawiboonchai W, Rotman HL, Kajstura J, Rubin R, Zoltick P, Baserga R 1995 The insulin-like growth factor I receptor protect tumor cell from apoptosis in vivo Cancer Res 55:2463-2469 10 A.V Makarevich M Markkula 2002 Apoptosis and Cell Proliferation Potential of Bovine Embryos Stimulated with Insulin-Like Growth Factor I During In Vitro Maturation and Culture Biology of Reproduction 66:386 11 Zai-Dong Hua1, Xin-Min Zheng, Qing-Xin Wei, Hou-Qiang Xu1, Ya-Gang Wang, Xi-Mei Liu, Li Li, Hong-Wei Xiao Xian-Feng Qiao 2010 Effect of cumulusoocyte complexes (COCs) culture duration on in vitro maturation and parthenogenetic development of pig oocyte African Journal of Biotechnology 10(5):867-873, 31 35 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng số liệu sử dụng xử lý thống kê Bảng Kết khảo sát bổ sung IGF-1 nồng độ ng/ml mơi trường ni phơi Khơng có IGF-1 Đợt TN Tổng số cột Tỉ lệ phôi dâu (%) Trứng IVF 48 63 18 24 21 13 187 Số phôi dâu 0 10,45 Số phôi 14 19 13 67 Bảng Kết khảo sát bổ sung IGF-1 nồng độ 10 ng/ml môi trường nuôi phôi Đợt TN Tổng số cột Tỉ lệ phơi dâu (%) Có bổ sung IGF-1 (10 ng/mL) Trứng IVF số phôi dâu Số phôi 61 33 24 15 13 146 1 13 20,63 31 10 63 Bảng Kết khảo sát bổ sung IGF-1 nồng độ 20 ng/ml môi trường nuôi phôi Đợt TN Tổng số cột Tỉ lệ phơi dâu (%) Có bổ sung IGF-1 (20 ng/mL) Trứng IVF Số phôi dâu Số phôi 40 24 15 13 92 1 12,5 10 10 32 Phụ lục Hoá chất dùng cho thu mẫu buồng trứng Bảng Thành phần dung dịch nước muối sinh lý Thành phần Hàm lượng NaCl 9g Nước cất 1000 ml Penicilin 0.06g Streptomycin 0.01 g Cách pha dung dịch môi trường thu mẫu buồng trứng: Pha dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% (9 g muối NaCl 1000 ml nước cất hai lần) Sau đem hấp vơ trùng nhiệt độ 120oC, atm Để nguội bổ sung thêm penicilin 100.000 IU, streptomycin 10 mg Môi trường thu dịch nang trứng Bảng Môi trường D-PBS 8662 Thành phần Hàm lượng D-PBS 8662 100 ml Glucose 0,11 g Sodium pyruvate 0.0036 g Bảng Thành phần D- modified PBS Thành phần Hàm lượng D-PBS 8662 97 ml Calf serum ml Penicilin 0.006 g Streptomycin 0.01g Thành phần môi trường nuôi trứng trưởng thành Bảng Thành phần môi trường TCM Thành phần Hàm lượng TCM-199 38 ml Calf serum ml Penicillin 4.000 IU Streptomycin mg Môi trường cho thụ tinh 4.1 Dung dịch BO Bảng Thành phần dung dịch A-BO Thành phần Hàm lượng NaCl 4,3092 g KCl 0,1974 g CaCl2.2H2O 0,2171 g NaH2PO4.2H2O 0,0840 g MgCl2.6H2O 0,0697 g Phenol red (0.5%) 0,1 ml Nước siêu Đủ 500 ml Bảng Thành phần dung dịch B-BO Thành phần Hàm lượng NaHCO3 2,5873 g Phenol red (0.5%) 0,04 ml Nước siêu Đủ 200 ml 4.2 Môi trường BO Bảng Thành phần môi trường BO Thành phần Hàm lượng Dung dịch A-BO 76 ml Sodium pyruvate 0,01375 g Penicilin 10000 IU Streptomycin 10 mg Dung dịch B-BO 24 ml Lưu ý: Chuẩn bị ngày sử dụng Sodium pyruvate kháng sinh thêm vào dung dịch A sau trộn với dung dịch B Tiệt trùng dung dịch phương pháp lọc 4.3 Dung dịch rửa tinh Bảng Thành phần dung dịch rửa tinh Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO 50 ml Na Caffeine Benzoate 0,1942 g Heparin (“Novo-heparin”: 5000 50 µl UI/ml) 4.4 Dung dịch rửa trứng Bảng Thành phần dung dịch rửa trứng Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO 40 ml BSA (Bovine serum albumin) 400 mg 4.5 Dung dịch pha loãng tinh Bảng 10 Thành phần dung dịch pha loãng tinh Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO 10 ml BSA (Bovine serum albumin) 200 mg 4.6 Dung dịch Cr1aa Bảng 11 Thành phần dung dịch A-Cr1aa Thành phần Hàm lượng NaCl 6,7031 g KCl 0,2311 g Natri pyruvate 0,0440 g NaHCO3 2,2011 g Phenol red 10 µg/ml Nước siêu Đủ 700 ml Bảng 12 Thành phần dung dịch B-Cr1aa Thành phần Hàm lượng Hemicalcium lactate 0,5996 g Nước siêu Đủ 200 ml Bảng 13 Thành phần môi trường Cr1aa Thành phần Hàm lượng A-Cr1aa 15,4 ml B-Cr1aa ml MEM (M5650) 0,4 ml L-Glutamic acid 0,2 ml BSA 0,06 g Penicillin 0,0012g Streptomycin 0,002 g Khi sử dụng, bổ sung 5% FBS vào môi trường Cr1aa Phụ lục Hình Trứng khơng thụ tinh Hình Phơi heo giai đoạn tế bào Hình Phôi heo giai đoạn tế bào ... thai bò FF (Follicle Fluid): dịch nang trứng FSH (follicle-stimulating hormone): hormone kích thích nang trứng GV (Gerninal Vesicle): nỗn giai đoạn túi mầm GVBD (Gerninal Vesicle Break Down): noãn... Thesis title: “Research to improve IVM and IVC medium to enhance in vitro production of porcine embryos” In this study, oocytes aspirated from ovaries were fertilized with fresh semen After collected... LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢI THI N MÔI TRƯỜNG IVM VÀ IVC ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS CHUNG ANH DŨNG LÊ THỊ LAN CHI Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN