Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong định lượng tạp đồng phân đối quang dạng R của Valsartan trong dược phẩm

Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong định lượng tạp đồng phân đối quang dạng R của Valsartan trong dược phẩm Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong định lượng tạp đồng phân đối quang dạng R của Valsartan trong dược phẩm luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Ứ N G D Ụ N G P H Ư Ơ N G PH ÁP ĐIỆN DI M A O Q U Ả N TR O N G ĐỊNH LƯ NG TẠP Đ N G PH ÂN Đ ỐI Q U A N G D Ạ N G R CỦA VALSARTAN TRONG D ợ c PHẢM Ts Nguyễn T hị Ngọc Vân*; Ths Kyun g R a n L ** TÓ M T T Valsartan sử dụng điều trị tăng huyết áp [1] Trong cấu trúc phân tử có cacbon bất đổi xứng, có đồng phân S­valsartan có lấc đụng dược lý [2] Đên chưa có nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng phân đối quang valsartan phẩm Mục tiêu nghiên cứu nhằm: Phái triển quy írình định lượng đồng thời valsartan đồng phân đối quang dược ph ầ n với độ nhạy cao thời gian phân tích nhanh Đối tưọng phương pháp nghiên cún: Chế phẩm viên nén Valsarect® (160 mg valsartan) and Diovan® (160 mg valsartan) sàn xuất bời công ty dược phẩm JW (Ansung, Hàn Quốc) công ty Novartis (Basel, Switzerland) Phương pháp nghiên cứu: Tối ưu hóa điều kiện điện tách đồng thời valsartan đồng phân đối quang tiến hành thẩm định quy tr nh định lượng Từ đó, áp đụng quy tr nh định ỉượng vài chể phầm thị trường Kết quả: Điều kiện điện di tối ưu gồm dung dịch đệm phosphate 25 mM, pH 8, chứa 10 mM Acetyl­(5­CD làm chất điện giải nền, điện áp đụng 30 kV 30°c Ibuprofen sử đụng làm chất chuẩn nội Quy tr nh thẩm định với khoảng nồng độ 0,5 ­ 30 pg/ml đồng phân dạng R Giới hạn phát 0,01%, giới hạn định lượng 0,05%, so với nồng độ valsatan mg/mỉ Tỷ lệ hồi phục đồng phân R từ 97 ­ 99,6% chế phẩm chứa valsartan Quy tr nh áp đụng để định lượng tạp đồng phân dạng R có viên nén chứa valsartan Kết luận: Quy tr nh định iượng thẩm định có tính đặc hiệu, cho độ đdng độ xác cao Phương pháp tiến hành đơn giản, tiếl kiệm đung môi hoá chất, đồng then cho kết đáng tin cậy * Từ khóa: Vaỉsartan; Phương pháp điện di mao quàn; Dạng đồng phân đối quang dạng R Application o f capillary electrophoresis method fo r determination o f the R-enantiomer ofValsartan as impurity in pharmaceuticalformulation Sum m ary Valsartan is widely applied for treatment of hypertension and administrated as a single isomer (S­valsartan) To the best of our knowledge, the enantiomeric purity determination of Valsartan in commercial products has never been investigated in capillary electrophoresis (CE) method Thus, the aim of our study is to develop a CE method for simultaneous determination of Valsartan and R­enantiomer in pharmaceutical formulation with high sensitivity and short analytical time Materials and method: Valsarect® tablets (160 mg VAL) were kindly supplied by JW pharmaceutical industries corporation (Korea) Diovan® tablets (160 mg VAL) were manufactured by Novartis (Basel, Switzerland) Method: Optimization of the electrophoretic conditions and method validation Then apply method for determination of pharmaceutical formulation Results: optimized conditions included 25 mM phosphate buffer, pH 8.0, containing 10 mM Acelyl­(5­CD as background electrolyte, an applied voltage of +30 kV and a temperature of 30°c Ibuprofen was used as internal standard The assay was validated for the R­enantiomer in the range of 0.5 ­ 30 ng/mL The limit of detection was 0.01%, the limit of quantitalion was 0.05%, compared to a concentration of valsartan of mg/ml Intra­day precision varied between 2.57% and 5.6% Relative standard deviations of inter­day precision ranged between 4.46% and 6.76% for peak area ratio The percentage recovery of the R­enantiomer ranged between 97.0 to 99.6% in valsarian product The assay was applied to determine the R­enanliomer as an impurity * Đại học Y Dược cần Th ** Đại học Quẩc gia Kangwon, Hàn Quốc 641 Conclusion: Th basic charact ristics o f th CZEfulfil g n ral validation crit ria and thus th m thod can b us d in routin analysis It nabl s d t ction as low as 0.01% o f impurity R- nantiom r o f valsartan in drugs * K y words: Valsartan; Capillary l ctrophor sis m thod; R- nantiom r LĐẶTVẨNĐẺ V alsartan có tên khoa học N ­(l~oxo­pentyl)­N ­[2’~(lH ­tetrazol­5­yl)[l,l­b iphenyl]­4­yi] methyl] ­L­valin Thuốc có tác động ức chế chọn lọc thụ thể type Angiotensin II (A TI), làm giảm huyết áp sử đụng điều trị tăng huyét áp [11 Trong cấu trúc phân tử cửa valin, có cacbon bất đối xống nhiên có đồng phân S­valsarían có tác dụng lỷ, đồng phân đối quang (R­valsartan) xem tạp chất công thức [2] Việc nghiên cứu thiết lập giới hạn tạp chất tồn bên cạnh thành phần có hoạt tính ngày trờ nên quan Èrọng ngành dược So với HPLC, kỹ thuật điện mao quản cần lượng nhỏ dung môi, chất chọn lọc đối quang lượng m ẫu nhỏ Kỹ thuật có nhiều ưu điểm hiệu cao, nhiều chế tách khác linh hoạt chọn lựa thay đổi dung môi chất chọn lọc [3,4] Cho đến nay, chưa có nghiên cửu sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng phân đối quang valsartan dược phẩm V vậy, mục tiêu nghiên cửu nhằm P hát triển m ột quy trình định lượ ng đồng thời valsartan đồng ph â n đổi quang cửa n dược p h ẩ m với độ nhạy cao ph â n tích n hanh đáp ú n g n h u cầu p h â n tích n> (2) (3) ' H nh Cấu trúc hoá học valsartan, R­valsartan Ibuprofen (chuẩn nội) II Đ Ố I T Ư Ợ N G VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊN c ứ u 2.1 Đ ố i tượng nghiên cứu ­ Chế phẩm viên nén Valsarect® (160 mg valsartan) and Diovan®(160 m g vaỉsartan) sản xuất cơag ty JW Pharmaceutical (Ansung, Hàn Quốc) công ty Novartis (Basel, Switzerland Thiết bị phân tích - Máy điện di mao quản Hewlett Packard313(CA, USA) với đầu dò dãy diod quang (DAĐ) sử dụng phần mềm HP3DCE Chemstation để điểu khiển thiết bị thu thập liệu ­ Khối phổ kế JEOL (JAPAN), JM S­700 trang bị đầu dị ion hóa điện tử hoạt động ché độ ion dương Phạm vi quét từ 50 ­ 500 mỉz ­ Máy quét phổ đo đường bay ion (Matrix­assisted laser desorption/ionization Time of flight (MALDI­TOF)) ­ M áy Brucker Avance­600 (600.25 MHz, Brucker, Germany) đo phổ *H­NMR dùng TMS làm chất đối chiếu Phổ ghi 600 M Hz với dung môi CD3OD 648 H a chat, dung mơi Tat hóa chất thuốc thù sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích Chuẩn valsartan cung cấp công ty dược phẩm JW (Ansung, Hàn Quốc) Chuẩn đồng phân đối “ Acetyỉ­p­cyđodextrin (A­p­CD) công ty Wacker­Chemie GmbH (Burghausen, Đức), a­cyclodextrin (a­CD), p­cyclodẹxtrin (p­CD), y­cyclodextrin (y­CD), 2­hydroxypropyl­cc­cycỉo­dextrm (HP~a~CD) methyl­p­cyđodextrin (M “P~CD) cung cấp bời Sigma­Aldrich, 2­(Hyđroxypropyl)~p­cyclodexirin (HP“ p­CD) mua từ công ty Fluka (Đức) ­ Acid phosphoric natri hydroxid mua từ Cơng ty Hóa chấÊ tinh khiết Duksan, Hàn Quốc, Dikali dihyđrogenphosphat loại P.A ­ Nước cất khử khoáng 2.2 Phư ơng pháp nghiên u 2.2.1 Chu ẩn b ị dung dịch chuẩn đồng phân dạng R valsartan R­valsartan chuẩn bị phản ứng hóa học chuyển dạng đồng phân từ nguyên liệu valsartan (S­ valsartan) Từ mẫu phản ứng, đồng phân dạng R phân lập tù hệ thống HPLC bán điều chế Điều kiện sắc ký: cột Chiralcel OD­H (5 Ịim, 10 X 250 mm), n­hexane 2­propanoI: tr íỉuoro­acetic acid (92 : : 0.1, tt/tt/tt) đùng làm pha động với tốc độ dịng 2.0 ml/phút, bước sóng phát 220 nm Sau thu đồng phân dạng R, kiểm ỉra độ tinh khiết hệ thống HPLC phân E ích CỘE Ch ralcel OĐ­H (5jim, 250 X 4.6 mm, i.d.) pha động gồm có n­hexane:2­propanoỉ: trifluoroacetic acid (90:10: 0,1, tt/tưtt), tốc độ dòng ỉà 0.8 ml/phút, bước sóng 220 nm, Xác định cấu trúc chuẩn R­vaỉsartan phổ MALDI­TOF M S, ‘H NMR: MALDI­TOF/EI m/z 436.1973 [M+H3+, m/z 432.1991 [M~H203; lH­NMR (CD3OD) 7.02 ­ 7.66 (aromatic proton ), 4.66 ­ 4.76 (U ­H , CH2 coupling), 4.61 (NH), 4.58 (6­H, CH, d), 2.63 (7­H, CH, m), 2.20 ­ 2.26 (2­H, c u 2, m), 1.53 ­ 1.66 (3­H, CH2, m), 1.25 (4­H, CH 2, m), 0.84 ­1 (8,9­H, CH3, dd), 0.96 (5­H, CH 3,t) V o y a o o r s p a o #1 = N F (A) =>NR(2 00)=»SWB =>CtiaP = sa z , 14SSO] S8 17 B 3376 S 24 8 Sao 440 450 M a BU(irựz) 80 4e8 V o y u g o r S p o c #1 CO.NF1.0=»NH{2.00)=>SM5=O.CT{BP = S , 17027] S (B) 4- ,3 Mima(m/2) I H nh Phổ M A L D ITOF MS (A) valsartan (B) đồng phân R­valsartan So sánh với tài liệu tham khảo [2] phổ valsartan (công ty dược phẩm JW ) nhằm xác định xác chất chuẩn nhóm nghiên cứu chuẩn bị đồng phân đối quang R valsarían 649 2.2.2 C hu ẩn b ị dun g d ịch chuẩn gốc Dung dịch chuẩn gốc valsartan (10 mg/ml) R­valsartan (100 ng/ml) pha ừong dung môi methanol, dung địch chuẩn làm việc chuẩn bị cách pha loãng hỗn hợp methanol : nước (1:1, tt/tt) Nồng độ đung dịch chuẩn Vãlsartan, R­valsartan chuẩn nội tương ứng mg/ml, 10 fig/ml, ịig/mJ Nồng độ R­valsartan hỗn hợp 1% so với valsartan, phù hợp với giới hạn cho phép tạp đồng phân quang học chế phẩm (theo Dược điển Mỹ ƯSP 32) 2.2.3 C hu ẩn b ị d u n g dịch th Cân 20 viên chế phẩm nghiền thành bột Cân lượng bột tương ứng với 10 m g valsartan, cho vào b nh định mức đung tích 10 ml hịa tan với khoảng ml ethanol, đem siêu âm 15 phút thêm ml IS, ml hỗn hợp methanol: nước (50:50, tưtt) Tiếp tục đánh siêu âm hỗn hợp 15 phút để chất tan hoàn toàn Dung dịch lọc qua giấy lọc W hatman kích thước 0,45 p,m Tối ưu hóa điều kiện điện dỉ tách đồng thời vaỉsarỉan đồng phân đổi quang ­ Khảo sát chọn dẫn xuất cyclodextrin chọn lọc phù hợp ­ Nồng độ dẫn xuất cyclodextrin chọn lọc ­ Nồng độ pH đệm ­ Nhiệt độ cột dòng điện phù hợp Thẩm định quy trình định lượng Phương pháp thầm định thực theo hướng đẫn ICH 2005 Q2 (R l) [5] với tiêu chí gồm tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ xác, độ đóng độ thơ phương pháp Tính tuyến tính xây dựng với nồng độ khác đung dịch đồng phân dạng R Giới hạn phát giới hạn định lượng dựa tín hiệu nhiễu tương ứng 3:1 10:1 Quy tr nh định lượng thẩm định vói khoảng nồng độ từ 0,05 ­ 3,0 % hàm lượng tạp R­valsartan so với hoạt chất valsartan chế phẩm Cyclođextrin N(mM ) a­CD (Ỉ­CD Y-cD 10 M­Ị5­CD 10 A­I5­CD HP­a­CD HP­Ê­CD ĨS Thời gian di chuyển (phứt) Valsartan R­vaisartan Ss ­ 10 ­ ­ ­ ­ ­ ­ 10 ­ ­ ­ ­ 17.234 16.847 2.95 ­ ­ ­ 15.977 16.147 1.26 10 9.398 10 ­ 10 10.401 10.817 3.08 III K Ế T QUẢ 3.1- Tối ưu hóa điều kiện điện di Khảo sát chọn đẫn xuất cyclodextrin chọn lọc phù hợp: Độ phân giải đồng phân đối quang valsartan 3,08 khỉ sử dụng A­Ị3­CD Bảng 1: đẫn xuất cyclodextrin chọn lọc khảo sát cho quy tr nh tách đồng thời đồng phân đối quang valsarían ­ Khơng tách Nồng độ tối ưu cùa A­P­CD khảo sát cách thay đổi từ đến 35 mM Độ phân giải tốt nồng độ 10 mM để tách valsartan đồng phân đạng R Nồng độ đệm phosphate khảo sát khoảng 25 ­ 100 niM, nồng độ điện giải tối ưu 25 mM, độ phân giải phù hợp thịi gian phân tích 650 ngắn Khoảng pH từ ­ áp dụng để tối ưu hóa pH chất điện giải, pH chọn Nhiệt độ thay đổi từ 15 ­ 30°c, nhiệt độ chọn ià 30°c Hiệu điện áp dụng khảo sát cách thay đổi từ 15 ­ 30 kV Khi điện tăng iên đến 30 Kv, thời giạn phân tích rút ngắn lại pic nhọn Do đó, điện 30 kV chọn để tách đồng phân đối quang valsartan Như vậy, điều kiện sắc ký tối ưu bao gồm đệm phosphat 25 mM, pH chứa A­p­CD 10 mM chất điện giải nền, nhiệt độ mao quàn ià 30°c điện áp dụng 30 kV Điện di đồ đặc trưng valsartan đồng phân dạng R phân tích điều kiện tối ưu (hình 3) A, ,00(2012VA­.t o o 1.1^010VANSJVO­O­to*.0> / (1) “ (2) /ì o­ / (3) I V J •*­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­ - é a T* R ' H nh Điện di đồ đặc trưng hỗn hợp gồm valsartan (1 mg/ml), đồng phân đối quang R nồng độ 0,1% chuẩn nội nồng độ 0,1% so với nồng độ hoạt chất valsartan Điều kiện tách: cột mao quản silica kích thước 64,5, chiều dài hiệu 56 cm, 50 Ịim i.d., đệm phosphat 25 mM, pH to mM A­p­CD; điện 30 kV; bước sóng phát 205 nm; nhiệt độ cột 30°c (1) chuẩn nội (ibuprofen); (2) vaisartan; (3) đồng phân R vaisartan 3.2 T h ẩm định phư oiìg pháp Khoảng tuyến tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Thông sổ _ _ Phương tr nh hồi quy y = 1.3812 X + 0.1724 Khoảng nồng độ khảo sát % đồng phân R so với n c ™ /™r ^ _, _ „ //lf, valsartan (lmg/ml) ° ’5 ­ 30 ^ /m h Tưcmg ứng 0,05 ­ 3,0 (%) R2 L.O.D (% đồng phân R so với vaĩsartan) 0,01 (%) L.O.Q (% đồng phân R so với valsartan) 0,05 (%) Độ xác Độ xác (%) Trong ngày (R.S.D, %) Liên ngày (R.S.D, %) 0,1 2,57 6,76 0,8 2,76 4,88 5,60 4.46 Lượng chuẩn thêm vào (%) Lưọng t m lại (%) Độ phục hồi (%) Bias (%) 0,08 0,1 0.12 0.0855 0.1040 0.1268 98.04 96.96 99.61 6.9 4.Ĩ 5.7 3.3 Đ ộ thơ phư ong pháp Độ thô phương pháp xác định thông quạ thay đổi nhỏ so yới điều kiện tối ưu khảo sát mà không làm ảnh hưởng đến kết định lượng Để xác định độ thô cùa phương pháp, yếu tố sau chọn 651 để khảo sát: đệm pH ± 0,2; 10 mM A­p­CD ± 1; 25 mM đệm phosphate ± 2; điện thé 30 ± kV Kết quả: thay đổi nhỏ khơng làm thay đổi tỷ ệ điện tích đỉnh R­valsartan so vói pic chuẩn nội 3.4 ứ n g dụng quy trình thẩm định để định lượng chế phẩm chứa valsarỉan Hàm lượng đồng phân R valsartan viên nén Valsarect Diovan Chế phẩm Tạp đồng phân R­valsartan (%) R.S.D (%) Valsarect® 0.116 L S I S J Va u v t y 0.215 1.55 £\ J Z i IV BÀN LUẬN Valsartan dẫn xuất tetrazol chứa gốc aciđ (pKa = 4,73) gốc carboxylic (pKa = 3,9) Do đó, khoảng pH trung tính chọn cho phân tích đồng phân quang học với mục đích proton hóa hồn tồn hạn chế đòng điện thẩm thấu để quan sát kết Kết khảo sát chọn dẫn xuất cycỉođextrin chọn lọc phù hợp tr nh bày bảng 1, điều kiện điện chọn đệm phosphat 50 mM (pH 7) chứa dẫn xuất CD (a ­ ,p­, y­, M­Ị3­, A­ỊỈ­, H P ­a­ and HP­p­CD) Độ phân giải đồng phân đối quang valsartan 2,95 sử đụng M­ỊÌ­CD 3,08 sử dụng A­p­CD Tuy có độ phân giải giống so với M­p­CD A­p­CD chọn lựa thời gian phân tích ngắn tín hiệu cao so với nhiễu Do tính lưỡng tính valsartan nên thịi gian lưu chịu ảnh hưởng nhiều pH, v pH định khả tích điện âm hay dương hcrp chất Khoảng pH từ ­ áp dụng để tối un hóa pH chất điện giải Két quả, di chuyển chất tăng giá trị pH tăng, pH q cao làm tăng dịng EOF đó, khơng thuận lợi tách đồng phân đối quang Do đó, đệm phoaphat 25 mM pH chọn lựa làm chất điện giải tối ưu Với điều kiện tối ưu vừa khảo sát, thời gian điện di valsartan đồng phân đạng R tương ứng 5,6 5,9 phút Quy tr nh thẩm định với khoảng nồng độ 0,5 ­ 30 fig/ml đồng phân dạng R Giới hạn phát 0,01%, giới hạn định lượng 0,05%, so với nồng độ valsatan mg/ml Độ xác ngày với giá trị RSD khoảng 2,57 “ 5,6%, độ xác liên ngày với RSD khoảng 4,46 ­ 6,76% Tỷ lệ hồi phục đồng phân R từ 97 ­ 99,6% chế phẩm chứa valsartan Phương pháp ứng dụng để định lượng tạp đồng phân đối quang R­valsartan hai chế phẩm viên nén Valsarect ® Diovan H àm lượng R­valsartan tính tốn dựa vào đường chuẩn, 0,22% viên Diovan® 0,12% viên Valsarect Kết định lượng cho thấy phương pháp có tính chọn lọc để phân tích tạp đồng phân mà không bị ảnh hưởng bời tá có cơng thức V K É T LUẬN Các kết thực nghiệm cho thấy phương pháp điện di mao quản định lượng tạp đồng phân R­valsartan với điều kiện khảo sát có tính đặc hiệu, cho độ đứng độ xác cao Phương pháp điện mao quản tién hành đơn giản, tiết kiệm dung mơi hố chất, đồng thời cho kết đáng tin cậy T À I L IỆU T H AM K H Ả O G Flesch, Ph Muller, p Lloyd Absolute bioavailabiỉity and pharmacokinetics of valsartan, an angiotenin II receptor antagonist in man, Eur J Clin Pharmcol 52 (1997) 115­120 J Nie, B Xiang, Y Feng, D Wang Isolation and identification of process impurities in crude valsartan by HPLC, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance Spectroscopy, J Liq Chromatogr R lat T chnol 29 (2006) 553­568 L Suntomsuk Recent advances of capillary electrophoresis in pharmaceutical analysis Anal Bioanal Ch m 398 (2010) 29­52 Sánchez­Hernández L., Garcia­Ruiz c , Luisa Marina M., Luis Crego A Recent approaches for enhancing sensitivity in enantioseparations by CE, El ctrophor sis 31 (2010) 28­43 International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use, Q2(RI), Valsartaniđat on of Analytical Procedure: methodology, 2005, http://www.ich.org 652 ... cửu sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng phân đối quang valsartan dược phẩm V vậy, mục tiêu nghiên cửu nhằm P hát triển m ột quy trình định lượ ng đồng thời valsartan đồng. .. chứa valsartan Phương pháp ứng dụng để định lượng tạp đồng phân đối quang R? ?valsartan hai chế phẩm viên nộn Valsarect đ v Diovan H m lng R? ?valsartan tính tốn dựa vào đường chuẩn, 0,22% viên Diovan®... dung dịch chuẩn đồng phân dạng R valsartan R? ?valsartan chuẩn bị phản ứng hóa học chuyển dạng đồng phân từ nguyên liệu valsartan (S­ valsartan) Từ mẫu phản ứng, đồng phân dạng R phân lập tù hệ thống