Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài một số chủng nấm men và xác định tỷ lệ đề kháng với thuốc kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài một số chủng nấm men và xác định tỷ lệ đề kháng với thuốc kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài một số chủng nấm men và xác định tỷ lệ đề kháng với thuốc kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR J Clin

Microbiol 2003 41 (10) pp .4873-5 _

11 Lovchik, J A., Drysdale M., Koehler T M , et aỉ

Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus

anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of

inhalational anthrax Infect Immun 2012 80(7), pp

2414-25

12 Ngan, G J „ Ng L M., Lin R I , et a!

Development of a novel multiplex PCR for the detection

and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi

and Paratyphi A Res Microbiol 2010.161(4), pp 243-8

PHỤ LỤC

Phụ lục gồm:

Phụ lục 1 Các bài báo đã công bố liên quan đến công

trình

Đinh Thị Thu Hằng và Nguyễn Thái Sơn Nghiên cứu

toàn bộ trình tự gen pagA ỉren một số chủng Bacilius

anthracis phân íập ở miền Bắc Việt Nam Tạp chí Y Dược

học Quân sự 2015.40(3), pp 135-143

Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng Tuyên và CS Thiết kế chửng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis Tạp chí

Y Dược học Quân sự 2015.40(6), pp 17-26

Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc Minh Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội tại tải tổ hợp xác định đổng thời vi khuẩn Bacillus

a n i u i a ^ i S V O t o r s i n i c a p c ? d ik > i <?ụ C m I Ỵ I t y i s U Ự f J i i U n y

2015 XXV(8 (168)), pp 239-246

Phụ lục 2, Đăng ký sáng chế của Cục Sở hữu Trí tuệ Việt Nam và Phiếu kết quả phân tích cua Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin vồ Sinh phẩm y tế

Phụ lục 3 -17 Trinh tự các gen giải trình tự của các chủng B anthracis phân lập ở Việt Nam được đăng ký trên Genbank

Phụ lục 18 Giấy xác nhận ứng dụng kết quả đề tài (Phụ íục có minh chứng kèm íheo trong Báo cáo toàn văn đầy đu)

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH DANH LOÀI MỘT

SỐ CHỦNG NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐÈ KHÁNG VỚI THUỐC KHÁNG NÁM BẰNG PHƯƠNG PHAP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH

Ths Ngô Thị Minh Châu, TS.Tôn Nữ Phương Anh, CN Đ ỗ Thị Bích Thảo

Bộ môn Ký Sinh Trùng - Đại học Y Dược Huế, Việt Nam

TS Antoneila Santona, TS Siĩvana Sana, GS.Piero Cappucineỉli

Khoa Vi sinh lâm sàng và thực nghiệm - Đại học Sasarí, Cộng hòa Ý

TÓM TẮT

Nấm men là tác nhàn gây bệnh quan trọng ờ người, đặc biệt bệnh do nấm Candida sp là bệnh phò biến Nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành irên 121 chung nấm men phân lập ở Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế.

Mục tiêu: Định danh loài một so chủng nấm men phân lập được từ câc bệnh nhàn được chẩn đoán nhiễm nấm nông hoặc nấm sâu vả xác định tỷ lệ đề kháng với một số thuốc kháng nấm Phương pháp nghiên cứu: Chúng tôi âp dụng kỹ thuật khối phổ MALD! - TOF (Maldi Tof Mass: Matrix-assisted laser desorption/ionization Mass Spectrometry), kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để định danh loài vi nấm Kháng nấm đồ được thụ-c hiền bằng phương pháp khuếch tán trên đ a thạch Kết quả: Có 121 chủng nấm phân lập được, trong đó C.albicans 43,80% và các loài c non albicans khàc gồm: C.ỉrópicalis 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata 7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.krusei 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%, c.norvegensis 0,83%, c.mesorvgosa 0,83% Ngoài ra chúng tôi cũng phân lập được 1 số loài nấm men khác như: Geotríchum capitatum 1,65%, Tríchosporon asahii 1,65% Đânh giá sự nhạy cảm của 6 loài vi nấm Candida

sp có tần xuất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi nhận 100% nhạy càm với amphotericin B và nystatin Tỷ lệ

đề khàng của C non albicans yà c albicans với fluconazole và itraconazole lần lượt là 40,74%, 3,77% và 5,66%, 50% Kết quả của chúng tôi cũng ghi nhận 20,37% c non albicans và 18,86% c albicans đề kháng với 5- fluorocystocine Tỷ lệ đề kháng với caspofungin của c non albicans và c albicans lần iưọt là 7,41% và 13,2% Kết luận: Giống Candida sp chiếm ƯU thế với loài c albicans có tỷ lệ cao nhất Một số loài Candida non albicans biếm gặp được phân lập trong nghiên cứu này: c orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, và c.mesorugosa Ngoài ra cắc loài nấm men khác cũng được định danh gồm Geotríchum capitatum và Trichosporort asahii Tất cả loài Candida sp nhạy càm tot với amphotericin B và nystàtin, nhưng có một tỷ lệ đáng kề c non albicans đề kháng với kháng nấm thuộc nhóm azole.

Từ khóa: Nấm men, Candida sp, kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF, khống nấm đồ, đề kháng.

SUMMARY

APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUE TO IDENTIFY YEASTS SPECIES AND EVALUATION ANTIFUNGAL SUSCEPTIBỈL YTI TESTING BY DISK DIFFUSION METHOD ' _ _ _ _

Ths Ngo Thi Minh Chau, TS.Ton NuPhuongAnh, CN Đo Thi Bich Thao (Parasitology Department- Hue University o f Medicine and Pharmacy, Vietnam)

TS Antonella Santona, TS Silvana Sana, GS.Pieró Cappucinelli (Microbiology laboratory, Department Biomedical Science in Sassari, Italy) Background: Yeasts are important opportunistic pathogen in human, in which Candida sp are the most

common causative agents The present study was earned out on 121 yeast strains collected in Hue Medicine and Pharmacy Hospital and Hue Central Hospital Objective: 1 To identify yeasts species from systemic mycoses and superficial mycoses 2 To determine the resistance rate to antifungal drugs o f Candida species by disk diffusion method Method: We applied MALDI - TOP Mass Spectrometry techniques, PCR and sequencing type to detect yeasts species Antifungal susceptibility testing was checked by disk diffusion method Results: There wem 121 yeast strains collected, in which C.albicans 43.80% and other c non albicans species including C.tropicalis 17.35%, c.parapsilosis 12.41%, C.glabrata7.44%, c.orthopsilosis 4.96%, C.metapsilosis 0.83%, c.krusei 3.30%, c.guilliermondii 3.30%, c.famata 1.65%, C.norvegensis 0.83%, c.mesorugosa 0.83% In addition, other yeast species were indentified including Geotrichum capitatum i.65%, Trichosporon asahii 1.65% Antifungal susceptibility testing was done to determine the resistant rate o f the six most Candida species isolated in this study The resuls showed that 100% strains susceptible to amphotericin B and nystatin The resistant rate o f c non albicans and c albicans to fluconazole and itraconazole were 40.74%, a 77% and 5.66%, 50% respectively Our results showed that 20.37% o f c non albicans and 18.86% o f c albicans were resistance to 5- Fiuorocystocine The resistant rate to caspofungine o f c non albicans and c albicans were 7.41% and 13.2% respectively Conclusion: Yeast isolations from patients in Hue city showed that Candida sp was the most genus identification, in which c albicans was the most species This study reported some rare species o f c non albicans, including c orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, and c.mesorvgosa Moreover, other yeasts non Candida were identified including Geotrichum capitatum and trichosporon asahii A ll Candida species were susceptible to amphotericin B and nystatin There was a significant resistance o f c non albicans to the azole drugs.

Keywords: Yeast, Candida sp., M ALD I- TOF Mass Spectrometry, antifungal susceptibility testing, resistance.

ĐẬT VÁN ĐỀ

Nấm men gây bệnh cho người gồm các giống

Candida sp, Cryptococcus sp, Rhodotorula,

Malassezia, Trichosporon [15j Trong các giống nấm

men này thỉ giống Candida sp là giống gây bệnh phổ

biến nhat [4,8,15] v ề mặt bệnh sinh, ơ người khỏe

mạnh một số giống Candida sp có thể sống hoại sinh

ờ một số vị trí của cơ íhể và trở thành tác nhân gây

bệnh trong một số điều kiện thuận lợi nhất định [15]

Bẹnh lý ở người do nấm Candia sp rất đa dạng, bệnh

có thể là các thề bệnh nấm nông như viêm âm đạo -

âm hộ, viêm da, viêm quanh móng - viêm móng, viêm

giác mạc, viêm ống tai cho đến các thể bệnh nấm

sâu xâm lấn như viêm phổi, viêm nội mạc cơ tim,

nhiễm trùng huyết {15] Candida sp là tác nhân gây

nhiễm trùng huyết phổ biến, xếp thứ 4 trong 10 tác

nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng huyết phổ biến nhất ở

bệnh nhân điều tri tại các đơn vị chăm sóc tích cực

[4.8.12], và nhiễm Candida sp xâm lấn ở các bệnh

nhân vởi các bệnh lý nặng đã làm tăng tỷ lệ tử vong

cũng như tăng chi phí điều trị [4,9] Sự đa dạng trong

bệnh nguyên của bệnh thuộc giống nấm Candida sp

và sự khác nhau ìrong đáp ứng đ ề u trị với thuổc

kháng nắm đâ làm cho việc điều trị, tiên lượng bệnh,

đặc biệt là trong những trường hợp bệnh nấm lan tỏa

[7.9.10.12] Vì vậy nghiên cứu về bệnh nguyên thuộc

giống Candida sp va mức độ nhạy với thuốc kháng

nấm của các loài vi nấm thuộc giống này đang là vấn

đề được sự quan tâm của nhieu nhà nghiên cửu ở

nhiều quốc gia khác nhau

Kỹ thuật phân lập định đanh nấm men có thể !à

những kỹ thuật đơn giản như nuôi cấy trên môi trường

chuyên biệt, hoặc íàm các thử nghiệm sinh hóa khác

nhau [15] Tuy nhiên giới hạn của các kỹ thuật truyền

thống là mất nhiều thời gian, và trong một số trường

hợp rất khó để phân biệt một số loài [13,16] Sự chậm

trê trong chẩn đoán các tác nhân vi sinh vật có thể gây

cản trở trong công tác đ ề u trị và làm tăng chi phí điều

írị [8] Vì vậy, hiện nay kỹ thuật khối phổ MALDl - TOF

được nhiều nghiên cứu trên thế giới đề cập đến với ưu

điểm là có độ nhạy, độ chính xác cao, thực hiện tự động hóa và ít tổn thời gian Những ưu điểm này iàm cho kỹ thuật khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu các tác nhân VI sinh vật gây bệnh ờ người trong đó có nấm men Trong thực tế ky thuật khối phổ MALDI - TOF có thể giúp định danh bệnh nguyên từ khuẩn iạc trong vài phút [13] Bên cạnh đó, thử nghiệm đánh giá về mức độ nhạy cảm của nấm Candida sp với các thuốc kháng nấm chưa được nghiên cứu nhiểu

ở Việt Nam Một so nghiên cứu được thực hiện nhưng chỉ khảo sát đáp ứng bằng điều trị lâm sàng hoặc nghiên cứu với íi loại thuốc kháng nẩm Vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với các mục tiêu sau:

Áp dụng ky thuật sinh học phân tử định danh loài nấm men phấn lập được từ bệnh nhân bị bệnh nắm nông vá nấm sâu.

Xâc định tỷ lệ đề khâng với các thuốc kháng nấm cửa một số loài riam Candida sp phân lập được

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGiÊN cứ u

Có 121 chủng nấm men được phân lập từ 103 bệnh nhân từ Bệnh viện Trung ương Huế và Bệnh viẹn Trường Đại học Y Dược Huế trong thời gian từ 1.2013 - 6.2014 Qui trình phân lập được tiến hành như sau: bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường Sabouraud dextrose agar Chloramphenicol (Biorad, France), 72 giờ sau được cấy chuyền sang môi trường Chromogennic agar (Oxoid, UK) Các loài vi nấm phân lập được sau đỏ được cất giữ ơ -200C trong dung dịch gỉyceroi15%

Các kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài vi nấm được thực hiện tại Khoa Sinh học phân tử, ĐH Sassari, Cộng hòa Ý Trong đó kỹ thuật khối phổ MALDI - TỎF tiến hành để đỉnh danh loài vi nấm trực tiếp từ khúm nấm nuôi cấy và đọc kết quả bằng hệ íhổng máy khối phổ Bruker Daltonik MALDI Biotyper Các chủng vi nấm có kết quả độ tin cậy thấp khi định danh bằng khối phổ sẽ được áp dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS1 và ITS2 đế xác định vùng giao gen (interna! transcribed spacer: ITS) trong cấu trúc ribosom DNA của vi nấm Qui trình tách chiếc

DNA của vi nấm được thực hiện theo phương pháp

của Zang và cộng sự [18] DNA của vi nấm được iàm

tinh sạch theo kít DNA Clean and Concentrator TM -5

(ZYMORESEARCH, USA), và được gửi đi giải trinh tự

gene để xác định ioài tại Sequencing Service LMU

(http://www.ai.bio.lmu.de/sequencing) Kết quả giải

trình tự gen được phân tích với p h in mềm Geneious

4.8.4 và đối chiếu với GeneBank để định danh loài với

(http://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cg)

Từ các chủng vi nấm phân lập đứợc, chủng tôi tiến

hành đánh giá sự nhạy cam vởi thuốc kháng nấm cíia

6 loài vi nấm có tần xuất phân lập với íỷ iệ cao trong

nghiên cứu bao gồm: c albicans, c tropicalis, c.

khuếch tán trên đĩa thạch theo hướng dẫn của CLSI,

M - 44 A (Clinical and Laboratory Standars Institute,

USA) với loại thuốc kháng nấm bao gồm amphotericin

B 10ụg, nystatin 100UI, fluconazole 25 Mg,

itraconazole 8pg, 5-fiuorocytosine 1 ụg và caspofungin

5|jg (Các loại đĩa kháng nấm là sản phẩm cùa

Liofilchem Laboratory, Cộng hòa Ý) Các chùng c

albicans ATCC 90028, c parapsiiosis ATCC 22019 và

c krusei ATCC 6258 được làm các chứng chuẩn của

thừ nghiệm kháng nắm Thử nghiệm kháng nấm đồ

được thực hiện tại Bộ môn Ký sinh trùng, Trường Đại

học Y Dược Huế

KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Đặc điểm cúa đối tượng nghiên cứu

Có 103 bệnh nhân được chọn vào trong nghiên

cứu của chúng tôi trong thời gian từ 1.2013 - 6.2014

Trong đó có 81 bệnh nhân đến từ Bệnh viện trường

ĐH Y Dược Huể gồm các khoa: Khoa Hồi sức tích cực

(ICU Intensive Care Unit) 16 người (15,53%), Khoa

Mắt 2 người (1,94%), Khoa NỘI 19 người (18,45%),

Khoa Ngoại chấn thương 2 người (1,94%), Khoa Tai

Mũi Họng 3 người (2,91%), Khoa Nhi 5 người (%),

Khoa Úng Bướu 13 người (12,62%), Phòng khám Da

iiễu 11 người (10,68%) và Phòng khám Phụ Khoa 10

người (9,71%) Ngoài ra có 22 bệnh nhân đến từ Bệnh

viện Trung ương Huế: Khoa Huyét học lâm sàng 14

người (13,59%), Khoa Nhi thận - Tiết Niệu 8 người

(7,77%) Tuổi trung bình của đối tượng trong nghiên

cứu chúng tôi là 45 tuổi, tuổi nhỏ nhất là 21 ngày tuổi,

tuổi iớn nhất là 89 tuổi Trong kết quả của chúng tôi có

41 bệnh nhân nam (39,81%) và 62 bệnh nhân nữ

(60,19%)

2 Nguồn gốc bệnh phẩm phân lập của các

Nquôn gốc phân ỉập Sô íượng Tỷ lệ %

nghiến cứu cua chúng tôi là niêm mạc miệng (25,24%), đàm (18,45%); nước tiểu (15,53%), tuy vậỵ chúng tôi cũng ghi nhận sự đa dạng trong phân bố vế nguồn gốc phân lập được

3 Sổ lượng chủng vi nấm phân Ịập

Từ 103 bệnh nhân nói trên chủng tôi phân lập được 121 chung nấm men Kết quả này được giai thích là do có 87 bệnh nhân chỉ nhiễm duy nhất 1 chủng vi nấm từ 1 vị trí phân lập, 14 bệnh nhân nhiễm

2 chủng vi nấm khác nhau từ 1 vị trí phân lập và 2

bệnh nhân nhiễm 3 chùng nấm khác nhau từ 1 vị trí phân lập;

4 kết quả định danh bằng kỹ ỉhuật khối phổ MALDi - TOF

Với kỹ thuật khối phỗ kết quả định danh như sau: C.albicans là loài phổ biến (53 chủng chiếm 43,80%) Các loài c non albicans phân lập được trong nghiên cứu là C.tropicaiỉs (21 chủng chiếm 17,35%), c.parapsilosis (12 chủng chiếm 9,93%), c.orthopsilosỉs (5 chủng chiếm 4,13%), c.metapsiíosis (1 chủng chiếm 0,83%), c.glabrata (9 chủng chiếm 7,44%), c.krusei (4 chùng chiếm 3,30%), c.norvegensis (1 chủng chiếm 0,83%), c.guilíiermondii (4 chủng chiểm 3,30%) Ngoài ra chúng tôi ghi nhận các loại nấm men khác íà Geotrichum capỉtatum (1,65%), Trichosporon asahii (0,83%) và có 8 chùng (6,61 %) nấm men không định danh được với kỹ thuật khối phố MALDI-TOF

5 Kết quả glảì trình trình tự gen của 8 chùng vi nấm không đĩnh danh được băng kỹ thuật khối phổ M A LD I-TO F

3 chùng Candida parapsilopsis, 2 chủng Debaryomyces hansenii (Candida famata), 1 chùng Candida orthosilopsis, 1 chủng Candida mesorugosa,

1 chủng Trichosporon asahii

6 Kết quả định danh loài dựa trên kết quà tổng

c.non aỉbicans

c.parapsilosis 15 12,41

c.guilliermondii 4 3,30

Loài nẫm men khác

Geotrichum capitatum 2 1,65 Trichosporon asahii 2 1,65

7 Tỷ lệ đề kháng với một số thuốc khàng nấm cùa các chùng nắm Candida sp.

Candida sp

{Số chủng nấm thử nghiệm kháng

nấm)

Amphotericine

B Nystatine Fluconazole itraconazole Fiuorocytosine5- Caspofungine

c.parạpsiỉosis (9) 0 0 1 (11,11%) 1 (11,11%) 2 (22,22%) 1 (11,11%)

Tất cả các loài vi nám thuộc giống Candida sp

trong nghiên cứu này đều nhạy cảm với amphoỉericỉn

B và nystatin Trong khi đó, c non albicans đề kháng

với fluconazole và itraconazole hơn c albicans và sự

khốc biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,0001) Tỷ lệ

khác biệt về đề kháng của C albicans và c non

albicans với 5-fluorocystocine và caspofungin không

có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

BAN LUẬN

Theo y van, nấm Candida sp có thể sống hoại sinh

trên mộỉ số vị trí của cơ thể và trờ thành tác nhẩn gây

bệnh khỉ có yếu tố thuận lợi [8,151 Các đối tượng

ĩrong nghiên cứu của chúm tôi đen từ nhiều khoa

phòng khác nhau nhưng chiem tỷ lệ cao là các bệnh

nhân bệnh nặng tại các đơn vị như ICU, Khoa Nội,

Khoa Ung bướu, Huyết học lâm sàng, Nhi Tiết niệu

Sự đa dạng của các loài nấm men phân lập từ các

khoa phòng khác nhau trong nghiên cứu này cho thấy

sự phỗ biến của bệnh lý do nấm men trên những bệnh

nhan có yểu tố nguy cớ Theo báo cáo tổng quan của

Gary w yếu tố vật chủ có vai trò quan- trọng trong

bệnh do vi nấm, cẩc bệnh nhân bị bẹnh nặng điều tri

tại ICU, bệnh bong, phẫu thuật, chấn thương là các

nhóm nguy cơ của bệnh nấm do giảm sức đề kháng,

hoặc luôn dùng kháng sinh íiều cao phổ rộng làm roi

loạn khuẩn chí tạo moi trường thuận lợi cho nấm phát

triển [3] Vi vậy bệnh nấm sâu, đặc biệt bệnh do nấm

Candida sp đang được đánh giá là nhóm bệnh mới

nồi trong các bệnh nhiễm trùng ở các đối tượng suy

giảm mien dịch bầm sinh hoặc mắc phải Nghiên cứu

của chúng tôi cũng ghi nhận được một tỷ ỉệ nhất định

nhiễm 2 đen 3 loài VI nấm từ một vị trí phân iập

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả ở nhiều

quốc gia khác nhau về mặt bệnh nguyên thuộc giống

Candida sp., có 5 loài gây bệnh pho biến là Candida

albicans, Candida giabrata, c.parapsiiopsis,

C.tropicalis và c.krusei [4,8,15] Kết quả nghiên cứu

của Nguyễn Khắc Lực và cọng sự ở Học viẹn Quân y

ghi nhạn các loài Candida sp phổ biến !à ò.albicans

65%, c giabrata 6,67%, c tropỉcalis 6,67%,

c.parapsolosis 5%, c.krusei 3,33% [2] Theo báo cáo

tồng quan của Giri s về bệnh nguyên nấm Candida

sp gây nhiễm trùng huyết thỉ hơn 90% thuộc các loài

nói trên [4] Nghiên cứu của Li F và cộng sự tại Trung

Quốc từ 2006 -2011 ghi nhận trong tống số 91 chùng

vi nấm phân lập từ máu và dịch tiết của cơ thể tỷ !ệ

nhiễm nấm Candida sp lần lượt là: c albicans với tỷ

lệ 41,29% ở bệnh phẩm máu vắ 59,06% trong các dịch tiết cua cơ the, tỷ íệ này là 18.06% và 25,72% với c tropicalis, c.parapsilosỉs !à 17,42% và 5,43%, c.glabrata là 11,61% và 3,99%, mộí số !oài Candida khác là 11,61% và 5,80% [10] Yashavanth R

và cộng sự nghiên cứu về nhiễm nấm Candida sp đường tiết niệu ghi nhận Candida albicans 30,3%, Candida giabrata 9,09%, C.tropicalis 45,45% và c.krusei 15,15% [17j Ngoài ra một số loài vi nấm thuộc giống này cũng được ghi nhận là bệnh nguyên như c.kefur, c.guiiiìermondii, c.lustitaniae, c.steiiatoidea, c.dubliniensis [4] Kết quả định danh loài thuộc giống Candida sp trong nghiên cứu cùa chúng tôi cho thấy C.albicans chiếm tỷ lệ 43,80% cao hơn so những loài khác, đ ề u này phù hợp với y văn là C.aibicans là loài gặp phồ biến nhất [3,15] Tuy nhiên chúng tôi cũng ghi nhận tỷ lệ nhiêm nhóm" c.non aíbicans !à 52,9%, tương đương tỷ lệ C.aìbicans (43,80%), điều này phù hợp với ghi nhận của những nghiên cứu gần đay ỉà cố sự trội len cùa nhóm Candida non aíbicans Nghiên cưu cua Hail G và cộng

sự tại Mỹ 2003 về nhiễm trùng huyết do Candida sp ghi nhận 57% thuộc nhóm c.non albicans [6] Trong nhóm ò.non albicans, chúng tôi ghi nhận các ỉoài có ty

lệ cao là C.tropicalis 17,35%, tiếp đến là c.parapsilosis 9,09%, c.giabrata 7,44% Đánh giá về sự phổ biến cua C.tropỉcaiis, nhiều khảo sáí cho kết quả đây là loài được ghi nhận VỚI tần suất xếp thứ 2 - 3 trong nhóm c.non albicans [1 1Ị c giabrata thường được ghi nhận

có tần suất phổ biển thứ 2 sau C.albicans trong giống Candida sp nói chung [14], tuy vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận sự trội hơn về tỷ iệ cùa C.tropicaiis và c.parapsilosis, có thể đây ià một điểm khác biệt về phân bố loài của giống Candida ơ người Việt Nam Ngoài c.parapsilosis, định danh dựa vào kỹ thuật khối phổ có thể phân biệt các đồng phân khác là c.orthosiiosis và c.nietapsilosis, đây chính íà điểm mạnh cùa kỹ thuật khối phổ so với các kỹ thuật định danh cổ điền khắc như dựa vào hình thai học hoặc định danh dựa vào các phản ứng lên men đường hoặc đồng hóa đường [153 Nghiên cứu của chúng tôi cũng phân íập được các loài nấm Candida non albicans CO

xu hướng đề kháng thuốc đã được công trình trong nước và trên thế giới công bố như c.glabrata, c.krusei, c.norvegensis [1,5,7]

Trong kết quả của chúng tôi có 6,61% nấm men

không định danh được với kỹ thuật khối phổ MALDI -

TOF Điều này cũng tương tự với ghi nhận của một số

tác giả khác trên the giới, ván đề này được giải íhích là

do thiếu cơ sở dữ liệu và đã được đề cập tới trong một

số công trinh của các tác giả khác nhau [13,16] Với

các chủng không xác định này, kết quả qiải trinh tự

cho các loài nấm men là c.parapsilosis,

c.orthopsilosis, c.famata, c.mesorugosa,

Trichosporon asahii Trong đó một số loài nấm rất

hiếm gặp ở người và có thể là lần đầu tiên được báo

cáo phân lập ở Việt Nam như c.orthopsilosis, c

metapsiiosis, c.norvegensis, c mesorugosa

Kết quả của thử nghiệm kháng nầm trong nghiên

cứu của chúng tôi cho thấy các loài vi nấm thuộc giổng

Candida phân lập được tại thành phố Huế đều nhạy

cảm tốt với các ỉhuốc kháng nấm thuộc nhóm polyene

(amphotericin B và nystatin) Trong khỉ đó, c albicans

được ghi nhận ít đề kháng với thuốc kháng nấm thuộc

nhóm azoie (fluconazole và itraconazole) hơn là

những loài c non albicans Những loài Candida sp có

tỷ iệ đề kháng cao với fluconazole, một loại thuốc

kháng nấm thường dùng phồ biến trong điều trị bệnh

nấm sâu cũng như dự phòng nhiễm trùng cơ hội do

nấm ở bệnh nhân AIDS tại Việt Nam là C tropỉcaiis

(52,38%), c orthopsilosis (83,33%) và c krusei

(100%) Tỷ lệ đề kháng của các loài c non albicans

với itraconazole mặc dù thấp hơn so với fluconazoie

nhưng nhìn chung vẫn có tỷ lệ đề kháng cao: c

tropicalis (52,38%), c ortbopsilosis (83,33%) và c

krusei (75%) Một số công trinh nghiên cứu khác ở

Thổ Nhĩ Kỳ, Malaysia cũng ghi nhận tỷ iệ đề kháng

đáng kể cua Candida sp, với azole [5,7] Chúng tôi

cũng ghi nhận tỷ lệ đề kháng với 5-fluorocystocine của

c albicans (18,86%), C.tropicalis (19,05%), c

parapsilosis (22,22%), c orthopsiiosỉs (16,67%) và c

krusei (100%) Ngoài ra, kết quả kháng nấm đồ từ

nghiên cứu này cũng bước đầu cho thấy có tỷ lệ đề

kháng nhất định của Candida sp với caspofungin, đây

íà thuốc kháng nấm mới thuộc nhóm echinocandin

chưa được dùng phổ biến ờ Việt Nam Tuy nhiên do

giới hạn của nghiên cứu này là chỉ mới đánh giá thử

nghiệm kháng thuốc với một lượng nhỏ của từng

chủng nấm thuộc nhóm c non albicans vì vậy để kểí

luận chính xốc cho vấn đề này cần tiếp tục nghiên cứu

ờ cỡ mẫu lớn hơn

Tóm lại, từ kết quả nghiên cứu này cho thấy sự đa

dạng trong bệnh nguyên của các loài nếm men phân

lập được từ bệnh nhân ở thành phố Huế và kết quả

kháng nấm đồ bước đầu cho thấy tỷ lệ đề kháng của

các loài c non albíans với fluconazole và itraconazole

là cao hơn so với loài C.albicans Từ đó cho thấy việc

định danh íoài và làm thử nghiệm kháng nấm ià cần

thiết và hữu ích trong việc định hướng đ ề u trị và tiên

lượng bệnh do nấm Candida sp

KETLUẬN

Đề tài cua chúng tôi áp dụng kỹ thuật khối phổ

MALDI - TOF và giải trình tự gen để xác định loài của

121 chủng nấm men phân íập từ 103 bệnh nhân thuộc

Bệnh viện trường ĐH Y Dược Huế và Bệnh viện Trung

Ương Huế Kết quả nghiên cứu cùa chứng tôi ghi nhận

tỷ lệ của các ỉoài nắm men như sau: C.albicans 43,80% và 52,9% các loài c non albicans bao gồm: C.tropicalís 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata 7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.kruseí 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%, c.norvegensis 0,83%, c.mesoruaosa 0,83% Ngoài ra chúng tôi cũng phân lập được 2 loài nấm men khác: Geotrỉchum capitatum 1,65%, Trichosporon asahỉi1,65%

Đánh giá sự nhạy cảm của 6 loài V! nấm Candida

sp có tần suất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi nhận 100% nhạy cảm với amphotericin B và nystatin

Tỷ íệ đề kháng của c non albicans và c albicans với fluconazole và itraconazole lần iượt là 40,74%, 3,77%

và 5,66%, 50% Kết quả của chủng tôi cũng ghi nhận 20,37% C non albicans và 18,86% c albicans đề kháng vởi 5- fluorocystocine Tỷ lệ đề kháng với caspofungin cùa c non albicans và c albicans lần iượ ilà 7,41 % và 13,2%

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu với số lượng chùng vi nấm phân lập nhiều hơn để có sổ liệu xác thực về đề khống với nhóm azole cùa c non aibicans Định danh ioài và kháng nấm đồ là cần thiết và hữu Ich với bệnh nấm Candida sp., đặc biệt là trong tường hợp bệnh nấm sâu

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Phan Tuấn Anh, Cừ Thị Kim Loan (2010), Xác định

tỷ lệ và đặc điềm dịch tễ học viêm âm đạo tái phát do nẩm, Tạp chí Y hoc TP Hồ Chí Minh, 14(1), trang 194 - 199

2 Nguyễn Khắc Lực, Đỗ Ngọc Anh (2013), Xác định loài một so nắm men phân lập từ ngươi bằng kỹ thuật PCR-RFLP, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng, Chuyên đề hội nghị Khoa học - Đào tạo chuyên ngành Ký sinh toàn quốc lan thứ 41, ỉrang 93-

3 Gary w Procop, Glenn D Roberts (2004), Emerging fungal diseases: the importance of the host, Clin Lab Med, 24, 691-719

4 Giri s, Kindo AJ, A review of Candida species causing blood stream infection., Indian J Med Microbiol., 30(3): 270-8

5 Guze! AB, Aydm M, Mera! M, Kalkanci A, ilkit M (2013), Clinical Characteristics of Turkish Women with Candida krusei Vaginitis and Antifungai Susceptibility of the c krusei Isolates, Infect Dis Obstet Gynecol., doi: 10.1155/2013/698736

6 Mali G, Hail L, Joyce M, Lodge B, Procop G, et al Multicenter evaluation of Candida albicans PNA FISH probe in biood cultures that contained yeast Presented at the ASM General Meeting; May 18, 2003

7 Jacinta Santhanam, Nazmiah Yahaya, Muhammad Nazri Aziz, Species distribution and antifungal susceptibility patterns of Candida species: is low susceptibility to itraconazole a trend in Malaysia ?, Med J Malaysia, 68 (4), p.343 -347

8 Julie Deialoye, Thierry calandra (2014), Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient, Virulence, 5 (Ị), 154-162

9 Juyal D, Sharma M, Pal s, Rathaur VK, Sharma N

(2013), Emergence of rton-aibicans Candida species in

neonatal candidemia, N Am J Med Sci., 5(9), p.541-545

10 Li F, Wu L, Cao B, Zhang Y, Li X, Liu Y (2013),

Surveillance of the prevalence, antibiotic susceptibility,

and genotypic characterization of invasive candidiasis in a

teaching hospitai in China between 2006 to 2011, BMC

infect Dis., 3(1), p.353-356

11 Melyssa Negri,, Sónia Silva, Diogo Breda, Mariana

Henriques, Joana Azeredo, Rosario Oliveira (2012),

Candida tropicaiis biofilms: Effect on urinary epithelial

cells, Microbial Pathogenesis, 53, 95-99

12 Piayford EG, Marriott D, Nguyen Q, Chen s, Ellis

D, Slavin M, Sorrell TC (2008), Candidemia in

nonneuỉropenic critically ill patients: risk factors for non­

albicans Candida spp Crit Care Med, 36, p.2034-2039

13 Giovanna Pulcrano, Dora Vita lula, Antonio

Voiiaro, Aiessandra Tucci, Monica Cerullo, Matilde

Esposito.Fabio Rossano, Maria Rosaria Catania (2013),

Rapid and reliable MALDi-TOF mass spectrometry

identification of Candida non-albicans isolates from

bloodstream infections, Journal of Microbiological Methods, 94, p 262-266

14 Rupinder Kaur, Renee Domergue, Margaret L Zupancic and Brendan p Cormack (2005), A yeast by any other name: Candida giabrata and its interaction with the host, Current Opinion in Microbiology, 8, p.378-384

15 William E.Dismukes et al (2003), Clinical mycology, Oxford University press

16 Gốrkem Yaman, lẹin Akyar, Simge Can (2012), Evaluation of the MALĐI TOF-MS method for identification

of Candida strains isolated from biood cultures, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 73, p 65-67

17 Yashavanth R et all (2013), Candiduria: prevalence and trends in antifungai susceptibility in a tertiary care hospital of mangalore, J Clin Diagn Res., 7(11), p.2459-2461

18 Zhang, Y-, et al (2010), A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains Letters in applied microbiology, 51(1): p 114-118

NGHIÊN Cứu ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GENEXPERT MTB/RIF

TRONG PHÁT HIỆN VI KHUẢN ' l a o t ạ i h ả i p h ò n g

Hà Thị Bích Ngọc (Tiến s ĩ Sinh học, Bộ môn Vi sinh Đ ại học Y Dược Hải Phòng) Chu Thị Nga (Thạc s ỉ Bác sĩ, Khoa Vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hài Phòng) Trần Đức (Tiến s ĩ Bấc sĩ, Khoa Vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng) Nguyễn Hùng Cường Ợiến s ĩ Bác sĩ, Bộ môn v ị sinh Đ ại học Ỷ Dược Hải Phòng) Phạm Văn Quang (Thạc sĩ, Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Hải Phòng)

TÓM TẤT

Đặt vấn đề: Năm 2011, WHO đă khuyển cáo m ờ rộng trìền khai kỹ thuật GeneXpert MTB/RIFIà hệ thống chẩn đoán phân tử tự động sử dụng kỹ thuật PCR để xác định sự có mặt cùa vi khuần lao và phát hiện đột biến khàng rifampicin trong gen rpoB cồa vi khuẩn lao [2,7] Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giả hiệu quảứng dụng kỹ thuật GeneXpert tại Hải Phòng vể xấc định tỷ lệ nhiêm vi khuẩn lao và phât hiện tình trạng khảng rifampicin đồng thời xác định vùng gen đột biến kháng rifampicin Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xét nghiệm GeneXpert MTB/RIF được tiến hành song song với kỹ thuật soi đờm trực tiếp bằng nhuộm Ziehl Neelsen 436 mẫu bệnh phẩm đờm của 436 bệnh nhàn Kết quà: Bệnh nhân được phát hiện có VI khuẩn lao ở nam cao gấp gần 5 lần so với nữ và những bệnh nhân mắc lao thường ở độ tuổi ngoài 40 Tỷ lệ phàt hiện MTB(+) trong 436 mẫu đờm là 94/436 (21,56%) cao gấp hai lần tỷ lệ phát hiện AFB(+) là 47/436 (10,77%) Trong 94 mẫu đờm có MTB(+) kỹ thuật GeneXpert phái hiện 10 mẫu kháng rifampicin, tương đương 10,64% Phât hiện tỷ lệ đột biến tại vùng lõi cùa gen rpoB bơi các mẫu dò probe E (60%), probe B (30%) và probe D (10%).Ket luận: Kỹ thuật GeneXpert MTB/RIF giúp chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và tính kháng rifampicin với qui trình thao tác đơn giản và đạt hiệu quả tốt, cho phép phât hiện vi khuẩn lao với số lượng rất ít.

Từ khoá: GeneXpert, Mycobacterium tuberculosis, kháng rifampicin.

SUMMARY

RESEARCHON IMPLEMENTING GENEXPERT TECHNIQUE TO DIAGNOSIS MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN HAI PHONG

Ha Thi Bich Ngoc (Doctor o f Biology, Department o f Medical Microbiology, Hai Phong University o f Medicin and Pharmacy)

Chu ThiNga (Master Doctor, Faculty o f Microbiology, Vietnam Czech General Hospital) Tran Due (PhD Doctor, Faculty o f Microbiology, Vietnam Czech General Hospital)

Nguyen Hung Cuong (PhD Doctor, Department o f Medical Microbiology, Hai Phong University o f Meciicin and Pharmacy) Pham Van Quang (Master, Laboratory Faculty, HaiPhong Pulmonary Tuberculosis Hospital) Background: In 2011, WHO recommendedusing Xpert MTB/RIF techniquewidely (MTB: Mycobacterium tuberculosis; RIF: rifampicin), is asemi quantitative nested real-time PCR invitro diagnostic test for the detection MTB and the detection o f rifampicin resistance associated mutation o f the rpoB gene [2 ,7Ị Purposes: To evaluate the effectiveness o f implementing GeneXpert technique in Haiphong city, about determine the rate o f MTB infection and detection o f rifampicin resistance with gene region associated mutation o f the rpoB gene.