Khảo sát sự tương quan giữa hàm lượng sắc tố Chlorophyll và hợp chất thứ cấp Saponin tổng số trong mô tế bào in Vitro Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv

Khảo sát sự tương quan giữa hàm lượng sắc tố Chlorophyll và hợp chất thứ cấp Saponin tổng số trong mô tế bào in Vitro Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv Khảo sát sự tương quan giữa hàm lượng sắc tố Chlorophyll và hợp chất thứ cấp Saponin tổng số trong mô tế bào in Vitro Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Phân bổ theo giới íứa tuổi bệnh nhân sau: số bệnh nhân nam cao gấp 2,7 ỉần số bệnh nhân nữ; tuổi bệnh nhân tập ỉrung chủ yếu nhóm tuổi 40, số bệnh nhân 20 tuổi chiếm tỷ íệ tháp (1,61%) Bệnh nhân nhỏ tuổi 12 tuổi lớn tuổi 93 tuổi Tỷ lệ phát M ỊB(+) 436 mẫu đờm 94/436 (21,56%) cao gấp hái lần ty lệ phát AFB(+) 47/436 (10,77%) Theo bác cáo nghiên cứu đại học ChengMai, Thái Lan, độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Xpert tương ứng 95,3% 86,4%; kỹ thuật nhuộm Ziehi Neeisen tương ứng ià 60,5% 98,5% [7] Để tính độ nhạy độ đặc hiệu, cần cố kỹ íhuật thứ ba nuôi cấy vi khuẩn, tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán vi khuẩn lao bệnh phầm bệnh nhân Tuy nhiên việc sử dụng kỹ thuật xét nghiệm lâm sàng có giới hạn thời gỉan lâu, yêu cầu chặt chẽ an toàn sinh học giá thành cao Trong nghiên cứu không tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lao Về tính kháng rifampicin: Gene rpoB đoạn ADN có kích thước 3519 bp, nằm nhiễm sắc thể vi khuẩn lao chịu trách nhiệm mã hoá tiểu đơn vị p enzyme ARN-polymerase RIF gắn vào tiểu đơn vị p ức chế trình phiên mã tạo ARN íhơng tin cùa vi khuần iao [5,6,9] Đột biến vùng lõi gen rpoB ức chế gắn RIF Đột biến thường xảy vị trí 526 531, vị trí 511, 516, 518, 522 j 8] Có khoảng 96,1% chùng kháng RỈF có đột biển gen nàv [4J Những chủng vi khuẩn íao kháng rifampicin đống thời kháng nhiều kháng sinh chống lao khác kháng rifampicin thường xảy sau đột biển kháng thuốc khác ban đầu isoniazid Trong 94 mẫu đờm MTB(+) có 10 mẫu cho kết phát vi khuẩn lao có đột biến kháng rifampicin, điều đáng lưu ý 8/10 mẫu gửi từ Bệnh viện Lao bệnh phổi Hải phòng Việc phát đột biển vùng lõi gen rpoB có ý nghĩa cho lựa chọn kháng sinh điều trị cho bệnh nhân kháng đa thuốc KẾT LUẬN Với 436 mẫu bệnh phẩm đờm, kỹ thuật GeneXpert MTB/RIF phát MTB(+) íà 94/436 (21,56%), nhuộm Ziehl Neelsen phát AFB(+) 47/436 (10,77%) v ề tính kháng RiF: có 10,64% số mẫu có MTB(+) phát kháng RIF; 85,11% số mẫu có MTB(+) bảo cáo nhạy cảm với RIF; 4,26% số mẫu có MTB(+) báo cáo khơng xác định tính kháng RIF.Trong 10 mẫu kháng rifampicin, vùng gen đột biến phốt probe E (6/10), probe B (3/10) probe D (1/10) TÀI LIỆU THAM KHẢO Hướng dẫn quy trinh thực hành chuẩn xét nghiệm vi khuẩn lao (2012) Bộ Y tế, Chương trinh chống lao quốc gia Global Tuberculosis Report 2015, WHO, France, http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/191102/1/9789 241565059_eng.pdf _ GeneXperi DX system (2008), Operation Manual, Software version 2.1, Cepheid GeneXpert MTB/RÍF(2009), Two hour detection of MTB and resistance to rifampicin, Cepheid Boehme cc et al (2011), Feasibility, diagnosis accuracy and effectiveness of decentralized use of the Xpert MTB/RIF test for diagonis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicenter implementation study Lancet, 377:1495-05 _ loannidis p,et al (2011), Cepheid GeneXpert MTB/RIF assay for Mycobacterium tuberculosis detection and rifampicin resistance identification in patients with substantia! clinical indications of tuberculosis and smear-negative microscopy results J Clin Microbiol, 49(8): 3068-70 Konokwan et al (2015), Comparison of Xpert MTB/RIF assay and the conventional sputum microscopy in detecting Mycobacterium tuberculosis in Northern Thailand, Tuberculosis Research and treatment, volume 2015 Mboowa et al (2014), Rifampicin resistance mutation on the 81 bp RRDR of rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis clinical isolated using Xpert MTB/RIF in Kampala, Uganda: a retrospective study, BMC infectious Diseases, 14:481 TelentiA, Imboden.p., p Marches, F.,Lowrie, D., Cole.S-, Colston, M.J.Matter, L.,Schopfer, K., Bodmer, T (1993), “Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, Lancet 341, pp.647'650 KHÀO SÁT Sự TƯƠNG QUAN GIỮA HÀM LƯỢNG SẮC TÓ CHLOROPHYLL VÀ HƠP CHÁT THỨ CÁP SAPONIN TỎNG SỐ TRONG MÔ TỀ BÀO IN VITRO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv) Mai Hương Trà (Bộ môn Sinh - Khoa Dược, Đại học Lạc Hồng) Đô Đăng Giáp (Viện Sinh học nhiệt đới, Tp HCM) TÓM TẤT Sâm Ngọc Linh, thần dược, sớm cạn kiệt đứng trước nguy tuyệt chủng bị săn lùng riết Để bào tồn phát triển loài quý cần phài quan tâm nghiên cứu giúp nắng cao chắt lượng nguồn nguyên liệu Trong nghiên cứu này, chúng tồi khảo sát điều kiện thích hợp cho việc tăng sinh tổng hợp chất thứ cắp mô sẹo sãm Ngọc Linh, thời tìm tương quân hàm lữợng sắc tố chlorophyll hợp chất thứ cấp saponin mô sẹo giai đoạn phát sinh hỉnh thái Nấng độ đường sucrose thích hợp bỗ 492 sung vào mơi trường cho q trình tăng sinh mơ sẹo 50 g/l Ánh sáng đèn LED vàng giúp cho mô sẹo sâm Ngọc Linh tăng trường tốt tổng hợp saponin cao Mô sẹo giai đoạn phốt sinh hình thái cho thấy chlorophyll tăng kéo theo saponin tăng, ngược lại Mơ sẹo nuôi cấy điều kiện chiếu sang mang lại hàm lượng saponin cao so với toi Từkhoá: Mô sẹo; sucrose; saponin; chlorophyll; Panax vietnamensis Ha et Grush SUMMARY Ngoe Linh ginseng, panacea tree, has been exhausted and on the verge o f extinction due to hunting aggressively To preserve and develop this precious species must study to help improve the quality o f material sources In this study, we surveyed most suitable conditions for the proliferation and synthesis o f secondary metabolites in Ngoe Linh ginseng callus, as well as found the correlation between the concentration o f chlorophyll pigments and saponin (secondary metabolite) in morphogenesis stage The most suitable concentration of sucrose for callus proliferation is 50 g/l Yellow LED light helps Ngoc Linh ginseng callus grow best and highest saponin synthesis Besides, the callus morphology showed that the amount o f chlorophyll increases leading to the increase o f saponin and vice versa Callus in lighting conditions produces saponin higher than in the dark Keywords: Callus; sucrose; saponin; chlorophyll; Panax vietnamensis Ha et Grushv GIỚI THIỆU Việt Nam quốc gia có nguồn thuốc dồi ỉruyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc iừ iâu đời Trong so đó, sâm Ngọc Linh loài dược liệu quan tâm nghiên cứu bời tính thần dược Sâm Ngọc Linh có nhiều cơng dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý trầm càm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phịng chổng ung íhư Ginsenosides (saponin) đánh giá thành phần quan trọng tronq rễ nhân sâm Ngồi ra, nhân sâm cịn chứa nhiều thành phần khác như: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo vitamin Những kếỉ nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học cơng bố cịn kéo dài danh sách saponin sâm Ngọc Linh íên tổng cộng 52 loại Như vậy, sâm Việt Nam loại sâm có hàm ỉượng saponin nhiều the giới [6Ị Vì dược liệu quý nên sâm Ngọc Linh bị khai thác mức, dường khơng cịn thấy ỉự nhiên Trước thực tế nhân giống sâm Ngọc Linh gặp nhiều khó khăn, nhằm góp phan giải phần nhỏ nguồn nguyên liệu khan hiếm, làm để cao hàm lượng saponin tích tụ mơ sẹo sâm Ngọc Linh ni cấy in viíro; tiếp số nghiên cứu trước ứng dụng thành công hệ thống phát sáng LED điều kiện in vitro, nghiên cứu điều kiện môi trường ánh sang thích hợp cho việc tăng sinh, tổng hợp hợp chất thứ cấp saponin VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 1.1 Ngùồn mẫu in vitro Mô sẹo in vitro sâm Ngọc Linh iấy từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật (Viện Sinh học Nhỉẹt đới TP Hồ Chí Minh) 1.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường MS [3] bổ sung 30 g/l đường sucrose; g/i agar; mg/l 2,4-D 0,2 mg/l TDZ Môi trường điều chỉnh pH từ 5,7-5,8; hầp khử trùng 121°c atm 20 phút 1.3 Điều kiện nuôi cấy Các binh mắu ổược nuôi cấy điều kiện độ ẩm 70-80%, nhiệt độ 22±2°c, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Phương pháp 2.1 Khào sát anh hưởng nồng độ đường khác lên phát triển mô sẹo sâm Ngộc Linh nuôi cấy in vitro Các mẫu mơ sẹo sâm Ngọc Linh có trọng íượng 0,2 g ni cấy mơi trường MS có bỗ sung mg/í 2.4-D; 0,2 mg/l TDZ; g/i agar Sau đó, bổ sung thêm vào mơi trường nồng độ đường khác nhau: 30 g/í; 40 g/l; 50 g/l va 60 g/l Cac bình nuoi cấy sau đặí điều kiện anh sáng huỳnh quang Các tiều trọng lượng tươi mo sẹo sâm Ngọc Linh thu nhậri sau tuần 2.2 Khảo sát ảnh hường ánh sáng iên phát triền tổng hợp saponin mô sẹo sầm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Các mẫu mô sẹo sâm Ngọc Linh có trọng lượng 0,2 g ni cấy mơi trường MS có bổ sũng mg/i 2.4-D; 0,2 mg/l TDZ, 50 g/l sucrose, g/l agar Các binh nuoi cấy sau đặt đieu kiẹn chiếu sáng khác nhau: ánh sáng Huỳnh quang, ánh sáng LED Xanh, ánh sáng LED Vàng ánh sáng LED Grow Light Các tiêu trọng lượng tươi, hàm íượng saponin, hàm lượng chlorophyll thu nhận sau tuần 2.3 Bước đầu đánh giá khả tổng hợp saponin tổng số sâm Ngọc LĨnh nuôi cay in vitro điều kiện sốc ánh sang Các mẫu mô sẹo sâm Ngọc Linh có trọng lượng 0,2 g ni cấy mơi trường MS có bổ sungl mg/l 2.4-D; 0,2 mg/l TDZ, 50 g/l sucrose, g/ỉ agar Các bình ni cáy sau đặt điều kiện ánh sáng tốt thí nghiêm ni cấy tuần Sau tuần nuôi cấy ta tiến hành đưa Ỷ2 số mẫu vào điều kiện nuôi cấy không ánh sáng Các tiêu trọng iượng tươi, hàm lượng saponin, hàm lượng chlorophyll thu nhận sau tuần Định lượng saponin chlorophyll mô sẹo sâm Ngọc Linh sau tuần nuôi cấy., * Định lượng saponin Cân g mẫu mo sẹo sâm Ngọc Linh, chiết siêu âm với MeOH 30 phút Cô đền cắn, hòa cắn với nước cất Dịch nước lắc với diethyl ether màu nhạt màu, loại diethyl ether Thêm n-BuOH vào dịch nước, lắc đến n-BuOH hấp thụ saponin (trờ nên đục) Tách dịch n-BuOH co 493 đến cắn thu chế phẩm saponỉn Hịa cắn vào ml methanol, hút xác 100 ụ\ vào ống nghiệm, cho tiếp 0,25 ml vanillin 8% cồn tuyệt đối 2,5 ml H2S04 72%, thêm methanol cho đủ ml, ủ 10 phút 60°c, sau đặt ống nghiệm tủ iạnh 2-8 c đến phút đo phổ hấp phụ bước sóng 546 nm (lặp lại lần) Lượng saponin tơng đứợc tính theo cơng thức: I i x: Độ hấp thụ cùa mẫu (OD) * Phương pháp đo chlorophyll [1] Sau tuan nuôi cấy, nghiệm thức lấy 10 mẫu Mỗi mẫu cân 0,2 g mô sẹo đữợc nuôi cấy vả cắt nhuyễn Cho mẫu vào ống nghiệm, sau cho vào ống nghiệm 10 ml acetone 80% Đậy kín ống nghiệm, bọc giấy bạc xung quanh ống nghiệm, đặt vào chỗ toi ngày Sau ngày, tiến hành đo mật độ quang ống nghiệm nghiệm thức phổ hấp thu 645nm 663 nm máy đo quang phổ Tổng chlorophyll = Chi a + Chỉ b (mg/g lá) Hàm lượng chlorophyll a b tính theo cơng thức sau: Chi a (ma / a lốì = ((12,7 X Abs663) - (2,6 X Abs 645)) X 10ml Acetone 80% ' 9 ' mg A (trọng lượng mâu) Chl b (mq / a lá) ' - ((22,9 X Abs645H4,68 X Abs663)) x1 Qml Acetone 80% mg A (trọng lượng mẫu) Phân tích xử lý số liệu: s ố iiệu thí nghiệm đươc Với a, b, c, thể khác biệt theo phương phân tích thơ Microsoft Office Excel SPSS pháp Duncan (1955) với độ tin cậy p s 0,05 theo phương pháp Duncan [2] với mức độ tin cậy Trong thí nghiệm tăng sinh cua mô sẹo sâm pá0,05 Ngọc Linh in vitro tốt nuôi cấy mơi KẾT LUẬN trương MS có nồng độ đường sucrose 50 g/i với trọng Khảo sát ảnh hưởng nòng độ đường lượng tươi mo sẹo thu cao nhẩt (0,312 gX khác lên pháỉ triển mô sẹo sâm Ngọc cao nồng độ đường sucrose 40 g/l (0,254 Linh nuôi cấy in vitro g) 30 g/í (0,234 g) Riêng nghiệm thức có nồng Nồng độ đường ban đầu có ảnh hưởng rắt nhiều độ đường sucrose 60g/l tăng trường cùa mô sẹo đến tăng sinh nuôi cầy mô tế bào thực vật không nhiều, với trọng iượng tươi thấp (0,230 Việc tim nồng độ đường thích hợp cho g) Như vậy, cho thấy nồng độ đừờng sucrose trình tăng sinh rriơ sẹo sâm Ngọc Linh nhằm ban đầu có tác đụng kích thích tăng sinh cho mơ sẹo, góp phần phát sinh mô sẹo tốt cho dược íiệu nhừ nồng độ đường cao sê có tăng sinh mô sẹo lớn Tuy nhiên, nồng độ sucrose cao (60 Dưới ảnh hưởng cùa nồng độ đường khác g/l) dẫn đến áp suất thẩm thấu vượt giới hạn cho nhau, tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi phép tế bào, dẫn đến nước, vi thể ảnh hưởng cấy in vitro sau tuần có khác biệt mặt thống kê xấu iên sinh trưởng chủng Như vậy, nồng đọ (Bang 1) đường sucrose bổ sung vào mơĩtrường 50 g/l ià thích Bảng Ảnh hường cùa nồng độ đường khác hợp cho trình tằng sinh mô sẹo sâm lên phát triển mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy Ngọc Linh nuôi cáy in vitro Kết tương in vitro đong với đề tài nghiên cứu Nguyễn Thị Liễu vả Nghiệm Nòng độ đường sucrose Trọng lượng tươi cộng (2011 ) tìm nồng độ đường sucrose thức ứ m 5Ỏ g/l ỉả thích hợp cho tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Đổi chứng 30 0,234 ± 0,02d Linh Đ40 40 0,254 ± 0,02b Đ50 50 0,312 ±0,04c Đ60 60 0,230 ±0,01 a mÊmmm mÊẸẵẫềệÊiÊmÊÊẫỀ *ềm •■ ";J J , Hình 1: Mơ sẹo sâm Ngọc Linh sau ỉuần nuôi nông độ đường khác nhau, a) Đường sucrose 30 g/l; b) Đường sucrose 40 g/i; c) Đường sucrose 50 g/l; d) Đường sucrose 60 g/ỉ 494 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng iên sự(Bảng 2) phát triển mô sẹo tổng hợp chất thứ cấp Bàng 2: Ảnh hưởng ánh sáng lên tăng saponin sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vỉtro sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 2.1 Ảnh hưởng ánh sáng tăng sau tuần nuôi cấy trưởng cùa mô sẹo sâm Ngọc Linh nhiều loài thực vật, tác động lên hình Nghiệm íhức Điều kiện ánh sánq Trọng iượng tươi (q) Đối chứnq thành tầng trưởng mô sẹo nuôi cấy in Huỳnh quang 0,292 ± 0.01c L1 LED Xanh vitro, ánh sáng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp 0,269 ±0,01b 12 LED Vànq 0,336 ± 0,02d hợp chất thử cấp tế bào Vì vậy, việc tìm L3 LED Grow Light 0,243 ±0,01a loạị ánh sáng thích hợp cho sinh sinh trường tổng hợp hợp chất saponin mô sẹo sâm Với a, b, c, d thể khác biệt với độ tin cậy Ngọc Linh nuôi cấy in vitro việc làm cần thiết nhằm theo phương pháp Duncan (1955) với độ tin cậy p < cung cấp nguồn nguyên liệu tốt cho mục đích 0,05 nghiên cứu, sản xuat chế phẩm saponin sau Từ kết thí nghiệm cho thấy tăng sinh Sau tuần nuôi cấy điều kiện ánh sáng, kết cùa mô sẹo sâm Ngọc Linh đạt hiệu tốt cho thấy mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy nuôi cấy đèn LED vàng Điều ánh sáng LED vàng với trọng lượng tươi mô tương đồng với nghiên cứu Ngô Thành Tàỉ sẹo thu cao (0,336 g), cao nghiệm (2013), ánh sáng vàng thúc đẩy việc tăng sinh mô thức đối chứng đèn huỳnh quang (0,292 g) đèn sẹo sâm Ngọc Linh Tuy nhiên, ánh sáng đèn LED xanh (0,27 g) Riêng nghiệm thức đèn Grow huỳnh quang LED xanh tác động tích cực lên Light khơng thúc đẩy tăng sinh mơ sẹo, có tăng sinh mẫu cấy !ượng tươi cùa mơ sẹo íhấp (0,243 g) 2.2 Ảnh hường ánh sáng tồng Kết nghiên cứu cho thấy ánh sáng LED vàng hợp saponin mơ sẹo sâm Ngọc Linh thích hợp cho q trình tăng sinh mơ sẹo Ngồi tác động lên sinh trưởng phát triển tồng hợp hàm lượng chlorophyll mồ sẹo thi ánh sáng tác động lên tổng saponin mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Kết hợp hợp chất thứ cấp Trong thí tương tự với nghiên cứu nghiệm này, vai trò ánh sáng đến tổng hợp Dương Tấn Nhựt cộng từ năm 1996 đến năm saponin hàm lượng sắc tố mô sẹo sâm 2007 [5] ứng dụng thành công hệ thống phát sáng Ngọc Linh điều kiện ánh sáng khác LED điều kiện in vitro Những nghiên cứu thể bảng giải phẫu học, quang hợp cũna chứng minh Bảng 3: Ảnh hưởng ánh sáng lên tổng nuôi cấy hệ thong LED tốt hợp chlorophyll saponin mô sẹo sâm Ngọc Linh so sánh với hệ ỉhống chiếu sáng đèn huỳnh nuôi cầy in vitro sau tuần nuôi cạy quang Nghiệm Điêu kiện ánh Chlorophyll Saponin tống 2.3 Mối tương quan hàm lượng sắc tố thức sáng (mg/g mồ seo) số (mg) chlorophyll saponin mô sẹo sâm Ngọc Đối Linh 0,100 ± 0,02c 25,75 ± 0,52c chứng Huỳnh quang Trong trinh nghiên cứu mô sẹo sâm Ngọc Linh L1 LED Xanh 0,082 ± 0,01b 24,35 ± 0,63b giai đoạn chuẩn bị bước sang phát sinh hỉnh thái L2 LED Vàng 0,152 ±0,01d 33,21 ± 0,67d thành chồi thi nhóm có phát mới: hàm L3 LED Grow light 0,045 ±0,01 a 16,47 ± 0,52a lượng sắc tố chlorophyll tăng thi kéo theo hàm lượng hợp chất thứ cấp saponin tăng theo loại ánh pháp Duncan (1955) với độ tin cậy p