Khảo sát các phương pháp cố định saccharomyces cerevislae trên chất mang cellulose vi khuẩn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  TÔ THỊ HUYỀN TRANG KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, T7 – 2010 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 10 tháng 08 năm 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày 30 tháng năm 2010 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TÔ THỊ HUYỀN TRANG Giới tính : Nữ Ngày, tháng, năm sinh : 30/10/1984 Nơi sinh : Thái Bình Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học MSHV : 03108150 1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát phương pháp cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae chất mang cellulose vi khuẩn 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 lên chất mang cellulose vi khuẩn phương pháp: bẫy hấp phụ, nhốt chủ động cố định phức chất mang BC-A - So sánh xác định phương pháp tối ưu cho cố định nấm men chất mang cellulose vi khuẩn 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng năm 2010 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 07 năm 2010 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN! Xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô môn Công nghệ Sinh học tạo điều kiện cho tơi bạn tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Em xin cảm ơn Cô: TS Nguyễn Thúy Hương – Một người Thầy gần gũi thương yêu học trò – Một người bạn đường tận tâm hành trình tìm tri thức, người hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em thật biết ơn trân trọng lịng Cơ Xin cảm ơn bạn lớp CH2008 giúp đỡ, quan tâm chia sẻ lúc khó khăn phải chịu đựng tính khí thất thường tơi suốt thời gian học tập làm luận văn tốt nghiệp Con xin cảm ơn Bố Mẹ khuyến khích học tiếp ln quan tâm, ủng hộ q trình học Cảm ơn Dũng Bình – hai em trai chị, chị tự hào hai em nhìn vào hai em để chị phấn đấu Và người giúp cho lời cảm ơn thêm trọn vẹn: cảm ơn “béo” – người truyền cho “8” tự tin, niềm lạc quan sống, bên ủng hộ “8” TÓM TẮT Cellulose vi khuẩn (BC) biết đến loại chất mang kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật Đã có nhiều loại vi sinh vật khác sử dụng để cố định chất mang BC Trong đề tài nghiên cứu này, với mục tiêu khảo sát phương pháp cố định vi sinh vật chất mang BC, lựa chọn đối tượng cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae Thông qua việc cố định nấm men chất mang BC ba phương pháp bẫy hấp phụ, nhốt chủ động, cố định phức chất mang BC-A xác định ưu nhược điểm phương pháp Từ ứng dụng vào tình cụ thể, tùy điều kiện cố định đối tượng cố định để lựa chọn phương pháp tối thích Trong phương pháp bẫy – hấp phụ chế phẩm BC với kích thước 2cm x 2cm, chế độ lắc 200 vịng/phút thời gian ủ ngày cố định lượng lớn tế bào nấm men với mật độ 6,889x106 tế bào/cm3 Trong phương pháp nhốt chủ động, BC sau xử lý có dạng hình trịn với Ø = 11cm, bề dày 2mm cố định 1,434x107 tế bào/cm3 cao gấp lần so với phương pháp bẫy hấp phụ Phương pháp cố định phức chất mang BC-A sử dụng chất mang có kích thước 2cm x 2cm, mật độ tế bào đem cố định 109 tế bào/ml, chế độ lắc 200 vòng/phút 30 phút hấp phụ thời gian ủ ngày cho mật độ nấm men cố định là: 8,130 tế bào/cm3; đồng thời chế phẩm sử dụng khảo sát khả tái sử dụng thông qua trình lên men rượu Hiệu sử dụng chế phẩm Saccharomyces cerevisiae N28 cố định chất mang BC phương pháp bẫy hấp phụ nhốt chủ động (số lần tái sử dụng) đạt 7-8 lần, chế phẩm cố định phức chất mang BC-A số lần tái sử dụng lên đến 12 lần mà đảm bảo hoạt tính sinh học nấm men Abstract The present, Bacterial cellulose (BC) is known as a new materials in the immobilizing bacterial cell technology There have been many different types of microorganisms used for immobilization on carriers BC In this research, with the aim of the survey methods of immobilizing microorganisms on carriers BC, we select a immobilizing object is the yeast Saccharomyces cerevisiae Through immobilize yeast carrier on BC by three methods: adsorption trap, active confinement and immobilize on complex substances BC-A we have indetified advantages and disadvantages of each method From then applied to specific situations depending on the conditions immobilized and immobilized objects to choose the most appropriate method In trap – absorb method, BC preparation with size 2cm x 2cm, agitator at 200 cycle/min, and incubation time in days had immobilized a huge amount of yeasts with density 6,889x106 cells/cm3 In active confinement method, BC after treatment had circle shape with diameter was 11 cm, and the thickness was 2mm This BC had immobilized 1,434x107 cells/cm3 to double adsorption trap method In complex substances BC-A method, the same size 2cm x 2cm, with density seed 109 cells/ml, agitator at 200 cycle/min, and incubation time in days had immobilized a huge amount of yeasts with density 8,130x106 cells/cm3; also, this preparation was used for testing the fluctuation of the alcoholic fermentation The effect of using Saccharomyces cerevisiae N28 preparation for immobilizing the BC carrier in the fermentative process by trap absorb and active confinement method could be up to 7-8 times, while immobilizing production on complex substances BC-A could be up to 12 times and still keep the biology properties of the yeast MỤC LỤC Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược Acetobacter xylinum, Bacterial Cellulose Saccharomyces cerevisiae 2.1.1 Sơ lược vi khuẩn Acetobacter xylinum 2.1.2.Các đặc điểm cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose–BC) 2.2 Tổng quan phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 17 2.2.1 Khái niệm: 17 2.2.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 17 2.2.3.Ưu nhược điểm tế bào cố định so với tế bào tự 20 2.2.4.Chất mang cố định tế bào 22 2.2.5.Điều kiện cố định tế bào vi sinh vật 23 2.2.6.Tính chất chất mang BC 24 2.2.7.Các nghiên cứu cố định vi sinh vật 25 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 VẬT LIỆU 29 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 32 3.2.2 Khảo sát giống A xylinum 32 3.2.3 Phương pháp giữ giống nhân giống 33 3.2.4 Phương pháp thu nhận BC 34 3.2.6 Phương pháp xử lý cellulose vi khuẩn tươi thu hoạch 34 3.2.7 Phương pháp xác định mật độ tế bào cố định chất mang BC 35 3.2.8 Phương pháp hóa lý 36 3.2.9 Khảo sát phương pháp điều kiện cố định S cerevisiae chất mang cellulose vi khuẩn 38 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 4.1 Một số đặc điểm sinh học chủng Acetobacter xylinum S cerevisiae sử dụng đề tài 43 4.2 Xử lý BC trước cố định nấm men lên chất mang 45 4.3 Khảo sát trình cố định chất mang BC phương pháp bẫy - hấp phụ 46 4.4 Cố định tế bào nấm men S cerevisiae N28 lên chất mang BC phương pháp nhốt chủ động 52 4.5 Cố định tế bào nấm men S cerevisiae N28 lên phức chất mang BC-A 53 4.6 Kiểm tra khả tái sử dụng chế phẩm cố định 56 Chương – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 69 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 71 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 75 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Acetobacter xylinum…………………………………………………… Hình 2.2 Chuỗi ,1-4 glucan cấu tạo cellulose………………………………… Hình2.3 Cellulose vi khuẩn……………………………………………………… Hình2.4 Cellulose thực vật .5 Hình 2.5 Cấu trúc BC điều kiện ni cấy bề mặt ………… ……….6 Hình 2.6 Cấu trúc BC điều kiện nuôi cấy bề sâu Hình 2.7 Con đường sinh tổng hợp Acetobacter xylinum Hình 2.8 Mơ hình đơn giản hóa đường sinh tổng hợp cellulose .9 Hình 2.9 Sự tổng hợp vi sợi Acetobacter xylinum 10 Hình 2.10.Nấm men Saccharomyces cerevisiae 15 Hình 2.11.Các phương pháp cố định tế bào 17 Hình 3.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 32 Hình 3.2 Sơ đồ thu nhận BC .34 Hình 3.3 Sơ đồ xử lý BC 35 Hình 4.1 Hình ảnh vi thể A xylinum BC16 43 Hình 4.2 Hình ảnh đại thể A xylinum mơi trường đặc 44 Hình 4.3 Màng BC môi trường lỏng .44 Hình 4.4 Hình ảnh vi thể S cerevisiae (x1000 lần) 45 Hình 4.5 Hình ảnh đại thể nấm men S cerevisiae mơi trường đặc (10-3) 45 Hình 4.6a Màng BC trước xử lý…………… ………… …………………46 Hình 4.6b Màng BC sau xử lý………………………….………… …… …46 Hình 4.7 BC trước sau cố định phương pháp bẫy hấp phụ………………… ……………………………………………………………….46 Hình 4.8 Kết chụp SEM mẫu chất mang BC sau trình lên men sử dụng chất mang cố định phương pháp hấp phụ-ủ, thời gian ủ ngày……………………………………………………………………………….51 Hình 4.9 BC trước sau cố định phương pháp nhốt 52 Hình 4.10 BC trước sau cố định phức chất mang BCA………………… 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số vi khuẩn có khả tổng hợp cellulose Bảng 2.2 Thành phần nước dừa già 11 Bảng 2.3 Một số phát minh Bacterial cellulose .11 Bảng 4.1 Mật độ tế bào nấm men cố định chất mang BC1, BC2 BC3 qua chế độ khuấy đảo 30 phút đầu hấp phụ……………………………47 Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men cố định chất mang BC (Đơn vị tính: Số tế bào x 106/cm3) 50 Bảng 4.3 Hiệu suất cố định nấm men chất mang BC phương pháp nhốt chủ động ( Đơn vị tính: %) 53 Bảng 4.4 Kết thu sau tiến hành cố định nấm men phức chất mang BC-A với mật độ tế bào đem cố định 108, 109, 1010, 1011 54 Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A (Đơn vị tính: Số tế bào x 106/cm3) .56 Bảng 4.6 Một số tiêu hóa lý lên men rượu sử dụng chế phẩm BC1 (chế phẩm BC bẫy-hấp phụ) 57 Bảng 4.7 Một số tiêu hóa lý lên men rượu sử dụng chế phẩm BC2 (chế phẩm BC màng) .59 Bảng 4.8 Một số tiêu hóa lý lên men rượu sử dụng chế phẩm BC3 (chế phẩm BC-A) (lần đến lần 12) 60 Bảng 4.9 So sánh cố định nấm men phương pháp bẫy hấp phụ, phương pháp nhốt chủ động phương pháp cố định phức chất mang BC-A 61 Bảng 4.10 So sánh chất mang kỹ thuật cố định tế bào nấm men .65 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Mật độ vi khuẩn cố định BC với kích thước khác qua chế độ khuấy đảo khác .48 Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men 50 Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng mật độ tế bào huyền phù giống đến mật độ tế bào cố định chất mang .55 - 73 - 38 Hestrin, S., Ascher, M., and Mager, J., 1947, Synthesis of cellulose by resting cell of Acetobacter xylinum Nature, Vol 159, p 64 – 65 39 Howell, K S., Bartowsky, E J., Fleet, G H and Henschke, P A 2004, Microsatellite PCR profiling of Saccharomyces cerevisiae strains during wine fermentation, Letters in Applied Microbiology, Vol 38, 315–320 40 Ishikawa, Stuchuda A., Yoshinaga T., Relationship between sulfagunidine resistance and increased cellulose production in A xylinum BPR3001E, Biopolymer Research Co, Ltd, ksp R&D, Japan 41 Iwata T., Indrarti L., Azuma J., 1998, Affinity of hemicellulose for cellulose proñuce by Acetobater xylinum, Cellulose, Vol 5, 215-228 42 Jaroslava Pátková, Daniela Šmogrovicová, Zoltán Domén & Petra Bafrncová, 2000, Very high gravity wort fermentation by immobilised yeast, Biotechnology Letters 22: 1173–1177 43 Joachim Klein and Holger Ziehr., 1990, Immobilization of microbial cells by adsorption, journal of biotechnology, volume 16, issues 1-2, p 1-15 44 Klibanov A M., 1983, Immobilized enzyme and cells as practical catalyst, Science, Vol 219, p 722-727 45 Krisch, J and Szajaùni, B , 1997, Ethanol and acetic acid tolerance in free and immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter aceti, Biotechnology Letters, Vol 19, No 6, 525–528 46 Mallios, P., Kourkoutas, Y., Iconomopoulou, M., Koutinas, A A., Psarianos, C., Marchant, R.and Banat, I M., 2004, Low-temperature wine-making using yeast immobilized on pear pieces Journal Agriculture and Food Chemistry 84: 1615– 1623 47 Malacrino, P., Tosi, E., Caramia, G., Prisco, R and Zapparoli, G , 2005, The vinification of partially dried grapes: a comparative fermentation study of Saccharomyces cerevisiae strains under high sugar stress, Letters in Applied Microbiology, Vol 40, 466–472 - 74 - 48 Mallouchos, A., Komaitisa, M., Koutinasb, A., Kanellakib M Wine, 2003, fermentations by immobilized and free cells at different temperatures Effect of immobilization and temperature on volatile by-products, Food Chemistry, Vol.80, 109–113 49 Martins R F et al., 2003, Integrated immobilized cell reactor–adsorption system for –cyclodextrin production: a model studying using polyvinyl alcohol– cryogel entrapped Bacillus agaradhaerens cells, Biotechnology letters, Kluwer Academic Publishers, vol 25, p.1537 – 1543 50 Melzoch, Y., Rychtera, M , 1994, Effect of immobilization upon the properties and behaviour of Saccharomyces cerevisiae cells, Journal of Biotechnology, Vol 32, 59-65 51 Masahiro Samejima, Jungi Sugiyama, Kijohiko Igarashi, Karl-Eril L Eriksson, 1998, Enjymatic hydrolysis of bacterial cellulose Carbohydrate Research 305 52 Nikolaos Agouridis, Nikolaos Kopsahelis, Stavros Plessas, Athanasios A Koutinas and Maria Kanellaki, 2008, Oenococcus oeni cells immobilized on delignified cellulosic material for malolactic fermentation of wine, Bioresource technology, volum 99, issue 18, 9017–9020 53 Offiical methods of analysis of AOAC international, 1996 54 Plessis, H.W., Steger, C.L.C., Toit, M and Lambrechts, M.G , 2002, The occurrence of malolactic fermentation in brandy base wine and its influence on brandy quality, Journal of Applied Microbiology, Vol.92, 1005–1013 55 Szalka C.J., 2000, Malolactic Fermentation, African Journal of Biotechnology, Vol.5, 162-169 56 Schramm, M., and Hestrin, S., 1954, Factors Affecting production of Cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum Joural of General Microbiology, 11, p 123-129 57 Tahara N., Tabuchi, Watanabe K., Yano H., Morinaga Y., Yoshinaga F., Degree of polymerization of cellulose from Acetobacter xylinum BPR2001 decreased by - 75 - cellulose produce by the train, Bio-Polymer Research Co., Ltd., KSP R&D Business- Park Bldg, 3-2-1, Sakato, Takatsu, Japan 58 Toda K., Asakura T., Entani E., Kawamura Y., 1997, Cellulose production by acetic acid resistant Acetobacter xylinum Journal of Fermentation & Bioengineering 85 (3), p 228-231 59 Yoshinaga F, Tonuochi N, Watanabe K, 1997, Research progress in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its application as a new industrial material, Biosci Biotechnol Biochem, Vol 61, 219-224 60 Wada, M., Kato, J and Chibata, I 1980, Continuous Production of Ethanol Using Immobilized Growing Yeast Cells, European J Appl Microbiol Biotechnol, Vol.10, 275-287 61 Wojciech Czaja, Alina Krystynowicz, Stanislaw Bielecki and R Malcolm Brown, Jr 2006, Microbial cellulose—the natural power to heal wounds ScienceDirect-Biomaterial, Vol 27, Issue 2, p 145-151, January 2006 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 62 http://www.botany.utexas.edu/lab/research_appl/pospaper.htm 63 http://www.res.titech.ac.jp/~junkan/english/cellulose/index.html 64 http://vi.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces 65 http://www.freepatentsonline.com/5070019.html - 76 - MỤC LỤC Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược Acetobacter xylinum, Bacterial Cellulose Saccharomyces cerevisiae 2.1.1 Sơ lược vi khuẩn Acetobacter xylinum 2.1.2.Các đặc điểm cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose–BC) 2.2 Tổng quan phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 17 2.2.1 Khái niệm: 17 2.2.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 17 2.2.3.Ưu nhược điểm tế bào cố định so với tế bào tự 20 2.2.4.Chất mang cố định tế bào 22 2.2.5.Điều kiện cố định tế bào vi sinh vật 23 2.2.6.Tính chất chất mang BC 24 2.2.7.Các nghiên cứu cố định vi sinh vật 25 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 VẬT LIỆU 29 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 32 3.2.2 Khảo sát giống A xylinum 32 3.2.3 Phương pháp giữ giống nhân giống 33 3.2.4 Phương pháp thu nhận BC 34 3.2.6 Phương pháp xử lý cellulose vi khuẩn tươi thu hoạch 34 3.2.7 Phương pháp xác định mật độ tế bào cố định chất mang BC 35 3.2.8 Phương pháp hóa lý 36 3.2.9 Khảo sát phương pháp điều kiện cố định S cerevisiae chất mang cellulose vi khuẩn 38 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 - 77 - 4.1 Một số đặc điểm sinh học chủng Acetobacter xylinum S cerevisiae sử dụng đề tài 43 4.2 Xử lý BC trước cố định nấm men lên chất mang 45 4.3 Khảo sát trình cố định chất mang BC phương pháp bẫy - hấp phụ 46 4.4 Cố định tế bào nấm men S cerevisiae N28 lên chất mang BC phương pháp nhốt chủ động 52 4.5 Cố định tế bào nấm men S cerevisiae N28 lên phức chất mang BC-A 53 4.6 Kiểm tra khả tái sử dụng chế phẩm cố định 56 Chương – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 69 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 71 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 75 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Acetobacter xylinum…………………………………………………… Hình 2.2 Chuỗi ,1-4 glucan cấu tạo cellulose………………………………… Hình2.3 Cellulose vi khuẩn……………………………………………………… Hình2.4 Cellulose thực vật .5 Hình 2.5 Cấu trúc BC điều kiện nuôi cấy bề mặt ………… ……….6 Hình 2.6 Cấu trúc BC điều kiện nuôi cấy bề sâu Hình 2.7 Con đường sinh tổng hợp Acetobacter xylinum Hình 2.8 Mơ hình đơn giản hóa đường sinh tổng hợp cellulose .9 Hình 2.9 Sự tổng hợp vi sợi Acetobacter xylinum 10 Hình 2.10.Nấm men Saccharomyces cerevisiae 15 Hình 2.11.Các phương pháp cố định tế bào 17 - 78 - Hình 3.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 32 Hình 3.2 Sơ đồ thu nhận BC .34 Hình 3.3 Sơ đồ xử lý BC 35 Hình 4.1 Hình ảnh vi thể A xylinum BC16 43 Hình 4.2 Hình ảnh đại thể A xylinum mơi trường đặc 44 Hình 4.3 Màng BC môi trường lỏng .44 Hình 4.4 Hình ảnh vi thể S cerevisiae (x1000 lần) 45 Hình 4.5 Hình ảnh đại thể nấm men S cerevisiae môi trường đặc (10-3) 45 Hình 4.6a Màng BC trước xử lý…………… ………… …………………46 Hình 4.6b Màng BC sau xử lý………………………….………… …… …46 Hình 4.7 BC trước sau cố định phương pháp bẫy hấp phụ………………… ……………………………………………………………….46 Hình 4.8 Kết chụp SEM mẫu chất mang BC sau trình lên men sử dụng chất mang cố định phương pháp hấp phụ-ủ, thời gian ủ ngày……………………………………………………………………………….51 Hình 4.9 BC trước sau cố định phương pháp nhốt 52 Hình 4.10 BC trước sau cố định phức chất mang BCA………………… 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số vi khuẩn có khả tổng hợp cellulose Bảng 2.2 Thành phần nước dừa già 11 Bảng 2.3 Một số phát minh Bacterial cellulose .11 Bảng 4.1 Mật độ tế bào nấm men cố định chất mang BC1, BC2 BC3 qua chế độ khuấy đảo 30 phút đầu hấp phụ……………………………47 Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men cố định chất mang BC (Đơn vị tính: Số tế bào x 106/cm3) 50 Bảng 4.3 Hiệu suất cố định nấm men chất mang BC phương pháp nhốt chủ động ( Đơn vị tính: %) 53 - 79 - Bảng 4.4 Kết thu sau tiến hành cố định nấm men phức chất mang BC-A với mật độ tế bào đem cố định 108, 109, 1010, 1011 54 Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A (Đơn vị tính: Số tế bào x 106/cm3) .55 Bảng 4.6 Một số tiêu hóa lý lên men rượu sử dụng chế phẩm BC1 (chế phẩm BC bẫy-hấp phụ) 57 Bảng 4.7 Một số tiêu hóa lý lên men rượu sử dụng chế phẩm BC2 (chế phẩm BC màng) .59 Bảng 4.8 Một số tiêu hóa lý lên men rượu sử dụng chế phẩm BC3 (chế phẩm BC-A) (lần đến lần 12) 60 Bảng 4.9 So sánh cố định nấm men phương pháp bẫy hấp phụ, phương pháp nhốt chủ động phương pháp cố định phức chất mang BC-A 61 Bảng 4.10 So sánh chất mang kỹ thuật cố định tế bào nấm men .65 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Mật độ vi khuẩn cố định BC với kích thước khác qua chế độ khuấy đảo khác .48 Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men 50 Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng mật độ tế bào huyền phù giống đến mật độ tế bào cố định chất mang .54 PHỤ LỤC Hình Nhân giống cấp A xylinum Hình BC lên men sau ngày Hình Thu hoạch BC lên men sau ngày Hình BC kích thuớc 2cm x 1cm, 2cm x 2cm, 2cm x 3cm trước cố định phương pháp bẫy – hấp phụ Hình Chế phẩm nấm men cố định chất mang BC với kích thước 2cm x 1cm, 2cm x 2cm, 2cm x 3cm Hình BC lên men sau ngày sử dụng cho phương pháp nhốt chủ động Hình BC sử dụng phương pháp nhốt chủ động có độ dày 2mm Hình Hệ thống máy hút chân khơng sử dụng phương pháp nhốt chủ động Bảng Một số loại chất mang kỹ thuật cố định tế bào Dạng vật liệu Chất mang điển hình Vơ tự nhiên Cát, kizelghur, kaolin, bentonit, than hoạt tính, … Vơ tổng hợp Silicat, silicagel, thủy tinh (sợi, hạt, bản…), oxyde hydroxyde titan, nhôm, sắt … Hữu tự nhiên Chitin, chitosan, cellulose, dextran, collagen, … Polymer tổng hợp DEAE – cellulose, CM – cellulose, cellofan, DEAE – sephadex, polyetylen, polypropylen, polyvinyl alcohol, polyvinyl chloride, polysterol, dẫn xuất acid poly acrylic, … Dạng hỗn hợp Polyetylen – albumin, polyetylen – collagen, cellulose – polyetylenimin, polysterol – albumin, … Bảng Ưu – nhược điểm số loại chất mang Nhóm chất mang Ưu điểm Nhược điểm Polymer tổng hợp Bền học, độ trương cao Giá thành cao, khơng (polyacrylamide, có khả cố định tế bào tốt tương hợp sinh học có polyvinyl alcohol ) nguy hủy hoại mơi trường Polymer sinh học Là sản phẩm tự nhiên, phong Kém bền lý, độ trương (alginate, chitosan) phú, rẻ tiền, dễ kiếm, có khả thấp, khơng đồng phân hủy sinh học Chất mang vô Độ bền lý cao, khả Không tương hợp sinh (than hoạt silicagel) tính, tái sử dụng tốt, phong phú, rẻ học tiền, trơ mặt hóa học [51] DUONG CHUAN y = 17.343x + 0.2334 R2 = 0.9973 MAT DO (10 7/ml) OD 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Hình Đồ thị đường chuẩn nấm men Saccharomyces serevisiae Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định chất mang BC1, BC2 BC3 qua chế độ khuấy đảo 30 phút đầu hấp phụ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) Kích thước BC Chế độ khuấy đảo BC1(2cmx3cm) BC2(2cmx2cm) BC3(2cmx1cm) A B C A B C A B C 1,250 1,100 0,950 3,300 1,100 1,750 1,720 1,800 3.178 1,757 2,200 1,700 1,600 5,500 1,833 1,140 1,265 1,180 3,580 1,195 1,760 1,785 1,810 5,355 1,785 1,760 1,960 2,075 5,795 1.932 1,190 1,160 1,400 3,750 1,250 1,750 1,900 1,930 5,580 1,860 1,950 2,025 2,040 6,015 2,005 Số lần lặp lại Tổng Trung bình Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A ngày ủ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) 108 109 1010 1011 1,950 3,650 4,550 4,250 2,050 4,300 4,450 4,600 1,850 4,250 4,150 4,450 Trung bình 1,950 4,067 4,383 4,433 Mật độ tế bào Lần lặp lại Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A sau ngày ủ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) 108 109 1010 1011 5,950 5,500 5,750 6,100 4,250 6,491 6,000 5,300 4,550 5,400 5,200 4,850 Trung bình 4,900 5,797 5,650 5,417 Mật độ tế bào Lần lặp lại Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A sau ngày ủ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) 108 109 1010 1011 6,450 8,700 6,125 4,550 6,600 7,500 6,250 5,075 7,425 8,175 7,875 7,525 Trung bình 6,825 8,130 6,750 5,705 Mật độ tế bào Lần lặp lại Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A sau ngày ủ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) 108 109 1010 1011 5,400 7,500 6,375 6,075 5,925 7,875 5,775 5,287 6,825 7,800 6,075 5,288 Trung bình 6,150 7,224 6,051 5,549 Mật độ tế bào Lần lặp lại Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A sau ngày ủ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) 108 109 1010 1011 5,700 6,375 5,100 5,600 5,850 7,050 6,075 5,512 6,450 7,275 6,075 4,377 Trung bình 5,925 6,900 5,751 5,163 Mật độ tế bào Lần lặp lại Bảng Mật độ tế bào nấm men cố định phức chất mang BC-A sau ngày ủ (Đơn vị tính: số tế bào x 106/cm3) 108 109 1010 1011 4,800 6,450 5,547 5,338 4,875 5,625 5,025 4,200 5,400 6,450 5,925 4,375 Trung bình 5,025 6,174 5,499 4,638 Mật độ tế bào Lần lặp lại Bảng 10 Xử lý số liệu sử dụng phần mềm STATGRAPHIC ANOVA Table Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 117126.0 14640.7 17.40 0.0000 Within groups 15142.7 18 841.259 Total (Corr.) 132269.0 26 Multiple Range Tests -Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -Col_1 220.0 X Col_4 238.667 X Col_7 250.0 X Col_2 351.333 X Col_5 353.0 X Col_3 366.667 X Col_8 372.0 X Col_6 386.333 X Col_9 401.0 X ... TÀI: Khảo sát phương pháp cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae chất mang cellulose vi khuẩn 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 lên chất mang cellulose vi khuẩn. .. 2.2.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật Có nhiều phương pháp khác để cố định tế bào: Hình 2.11 Các phương pháp cố định tế bào [44] - 18 - a) Cố định bề mặt chất mang Nguyên tắc: chất phương. .. với mục tiêu khảo sát phương pháp cố định vi sinh vật chất mang BC, lựa chọn đối tượng cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae Thông qua vi? ??c cố định nấm men chất mang BC ba phương pháp bẫy hấp