Chế biến thực phẩm

Quy trình sản xuất lạp xưởng tại xí nghiệp Chế biến thực phẩm Nam Phong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRẦN QUÂN ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  APPLICATION OF STANDARDIZIED CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong những năm học vừa qua. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận sự giúp rất nhiều từ các thầy cô và các anh chị công tác ở Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Trong đó tôi xin chân thành cảm ơn: - TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vƣớng mắc trong quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - ThS. Ngô Xuân Tuyến là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn về phƣơng pháp nghiên cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn tôi về mặt thao tác trong phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập. - Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi đồng hành trên suốt chặng đƣờng đại học. Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên Đặng Trần Quân v TÓM TẮT Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β-1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID50 của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở liều thấp (101,5SID50) và liều cao (104SID50) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3 nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các vi dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp. vii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng . ix Danh sách các hình . x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Nội dung 1 1.3 Mục tiêu 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú . 3 2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú 5 2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng . 5 2.2.2 Tác nhân gây bệnh 5 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý . 6 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền 6 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với bệnh đốm trắng . 7 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch . 7 2.3.2 Vaccin . 10 2.3.3 Vitamin . 11 2.3.4 Fucoidan . 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm . 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn . 13 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 14 2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch . 15 2.5.1 Nguyên lý . 15 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU 16 3.1 Thời gian và địa điểm . 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu . 16 3.2.1 Vật liệu sinh học . 16 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất . 16 3.2.2.1 Dụng cụ . 16 3.2.2.2 Hoa chất 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus . 19 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú 19 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC 19 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC . 19 3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20 3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc . 20 3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 viii 3.4 Bố trí thí nghiệm . 21 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn . 21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) . 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 23 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm đối với WSSV 24 4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp (101,5SID50/ml) 24 4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao (101,5SID50/ml) 28 4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm ở từng phƣơng thức quản lý 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận . 35 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO …37 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSD: White spot disease. WSSV: White spot syndrome Virus. WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry. proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa). VP28: envelope protein (28 kDa). DNA: Deoxiribonucleotide acid. RNA: Ribonucleotide acid. MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius. IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus. PCR: Polymerase chain reaction. PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride. SID50/ml: Shrimp infectious dose 50% enpoint x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau . 20 Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm . 23 Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi . 23 Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24 Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp 25 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26 Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều cao 28 Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao 30 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở các thời điểm thu mẫu ở liều cao…… ………………………………………30 Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm……………………………………………… 32 Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33 [...]... nhiên, để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tôm thƣơng phẩm thì cần có những công trình nghiên cứu nhằm đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của tất cả các phƣơng đánh thức này 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm: 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn: WSSV nhiễm trên một vài loài tôm nuôi và gây ra thiệt hại nghiêm trọng do tỷ lệ tôm chết có thể đến 100% trong... cứu sự biến động các thành phần của hệ đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu nhƣ số lƣợng và khả năng thực bào của tế bào máu, hoạt tính enzyme phenoloxidase, superoxide dismutase, nồng độ ion superoxide Nhận thấy rằng ở các nghiệm thức bổ sung 2, 10 và 20 g/kg thức ăn, sau khi cảm nhiễm, các thành phần trên biến đổi theo chiều hƣớng suy giảm nhƣng phục hồi và đạt cực đại một vài ngày sau đó Sự biến đổi... quan lympho Khả năng loại thải vi sinh vật của các loại tế bào máu khác nhau cũng khác nhau Semi-granulocyte có chỉ số thực bào cao nhất so với các lọai tế bào khác Granulocyte và hyalinocyte có chỉ số thực bào thấp nhất Ở tôm cũng nhƣ hầu hết các loài giáp xác khác tồn tại những cơ chế để phát hiện sự xâm nhập của các tác nhân lạ từ bên ngoài (vi khuẩn, nấm) thông qua sự nhận diện những thành phần... thể là việc sử dụng các chất kích thích tăng cƣờng hệ miễn dịch của tôm Đi từ cơ sở thực tiễn đó, đƣợc sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn... quan trọng trong dinh dƣỡng và sự thiếu hụt lâu dài các dƣỡng thƣờng bị mất đi trong quá trình chế biến thức ăn cho động vật thủy sản Do đó chất này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các triệu chứng bệnh cho động vật (Lê Thanh Hùng, 2000) Hầu hết các vitamin có vai trò nhƣ một co-enzyme hay các tác nhân bổ trợ các enzyme thực hiện các phản ứng sinh hoá trong cơ thể sinh vật Vitamin C (acid ascorbic) cũng không ngoại... cơ thể, vào máu chúng sẽ gặp những cơ chế phòng vệ bẩm sinh bao gồm các đáp ứng miễn dịch tế bào và thể dịch Đầu tiên, hệ thống hoạt hoá prophenoloxidase (proPO) đƣợc kích hoạt dẫn đến sự tổng hợp melanin và tạo ra các yếu tố liên quan đến các phản ứng miễn dịch khác nhƣ peroxinectin Tiếp đến, các tế bào máu tham gia vào việc dọn dẹp các mầm bệnh bằng các cơ chế thực bào vi sinh vật hay bẫy chúng trong... miệng đƣợc xem là quan trọng nhất trong điều kiện tự nhiên và nuôi thƣơng phẩm Tuy nhiên, những phƣơng pháp này tồn tại một hạn chế rất lớn là lƣợng virus gây nhiễm cho mỗi tôm thì không đƣợc biết Hơn nữa phƣơng thức này thì không đảm bảo đƣợc mỗi tôm đều nhận đƣợc một lƣợng virus nhƣ nhau Theo Bonilla và ctv (2005) mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn sử dụng một dịch huyền phù virus đã đƣợc chuẩn độ để... tiêm PBS vẫn khỏe đến cuối đợt thí nghiệm Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp Nghiệm thức Thời điểm xuất hiện đỏ thân (giờ) Thời điểm xuất Thời điểm tôm hiện đốm bị chết (giờ) trắng (giờ) β-1,3/1,6-glucan 27 44 83 5 Vitamin C 33 49 68 6 Đối chứng 24 33 49 7 Tổng số tôm chết Kết quả phân tích tại phòng thí nghiệm về tỷ lệ và cƣờng độ cảm... nhiệt độ, độ mặn và pH Vidal (2001) đã xác định đƣợc 8 mối liên hệ giữa bệnh đốm trắng và nhiệt độ của nƣớc Nghiên cứu này chỉ ra rằng với nhiệt độ 25oC, khả năng 100% tôm chết do bệnh đốm trắng; nếu nhiệt độ tăng lên 32oC thì tỷ lệ chết của tôm chỉ khoảng 20% Kết quả này đƣợc giải thích là do nhiệt độ của nƣớc tăng lên làm giảm khả năng tái tạo của WSSV Song song đó, việc bổ sung vào khẩu phần ăn của... muramylpeptide) Các sản phẩm β-1,3-glucan từ vi khuẩn (Curdlan) và nấm sợi (Krestin, Lentinen, Schizophyllan…) Các β-1,3/1,6-glucan từ thành tế bào nấm men bánh mì (MacroGard, Betafectin) Các cấu trúc Carbohydrate (glycan) từ các nguồn sinh học khác nhƣ tảo biển Các peptide từ các dịch chiết của động vật hay từ quá trình thủy phân enzyme các protein từ cá Các nucleotide Các sản phẩm tổng hợp (Bestatin, . quá trình thực tập. - Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. ............................................................................................. 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm ........................... 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ...........................