Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm, Aurora kinaza in vitro của Derrone, Cây Vông nem Erythrina Orientalis L.Murr.

Kết hợp những kiến thức và thành tựu khoa học đó, đã có rất nhiều hợp chất được thử nghiệm nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư nhắm đến các yếu tố khác nhau tham

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NguyễnThịNhưTrang

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH AURORA KINAZA

IN VITRO CỦA DERRONE PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM

ERYTHRINA ORIENTALIS L MURR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HàNội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NguyễnThịNhưTrang

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH AURORA KINAZA

IN VITRO CỦA DERRONE PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM

ERYTHRINA ORIENTALIS L MURR

Chuyênngành:Sinhhọcthựcnghiệm Mãsố: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG

HàNội - 2013

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 NGUYÊN PHÂN 3

1.1.1 Pha phân chia nhân (mitosis) 3

1.1.2 Pha phân chia tế bào chất (cytokinesis) 4

1.1.3 Một số sự kiện quan trọng trong nguyên phân 5

3.2 AURORA KINAZA VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ 10

3.2.1 Aurora kinaza 10

3.2.2 Vai trò của Aurora kinaza trong sự hình thành ung thư 17

3.3 CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 19

3.3.1 VX680 - chất ức chế Aurora kinaza 19

3.3.2 Paclitaxel (Taxol) 21

3.3.3 Chế phẩm Derrone 22

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG 24

2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.3.1 Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào 27

2.3.2 Đánh giá độc tính của chế phẩm Derrone bằng phương pháp MTT 28 2.3.3 Thử độc tính của Derrone sử dụng phương pháp xCELLigence 31

2.3.4 Miễn dịch huỳnh quang 33

2.3.5 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry 35

2.3.6 Phân tích kết quả, xử lý số liệu 37

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ HOẠT HÓA VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO 38

3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO MCF-7, H1299, HELA VÀ HEK 293 38

3.2.1 Kết quả thử độc tính trên dòng MCF-7 bằng xCELLigence 39

3.2.2 Kết quả thử độc tính trên dòng H1299 bằng xCELLigence 43

3.2.3 Kết quả thử độc tính trên dòng HeLa bằng xCELLigence 46

3.2.4 Kết quả thử độc tính trên dòng HEK 293 bằng phương pháp MTT 49 3.3 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN CHU TRÌNH TẾ BÀO 51 3.3.1 Đánh giá ảnh hưởng của Derrone lên điểm kiểm soát thoi phân bào51 3.3.2 Ảnh hưởng của Derrone lên chu trình tế bào 54

3.4 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN SỰ BIỂU HIỆN H3PS10 ……….56

3.4.1 Đánh giá sự biểu hiện của H3PS10 dưới ảnh hưởng của Derrone bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang 57

3.4.2 Định lượng ảnh hưởng của Derrone lên H3PS10 bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy 60

3.5 THẢO LUẬN 61

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Sự biểu hiện quá mức hay khuếch đại gen Aurora kinaza ở nhiều loại ung thư khác nhau 18

Bảng 2: Các chất ức chế Aurora kinaza 20

Bảng 3: Đặc điểm, nguồn gốc và điều kiện nuôi cấy của các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 4: Máy móc và thiết bị sử dụng 25

Bảng 5: Dụng cụ và vật tư tiêu hao 26

Bảng 6: Hóa chất sử dụng trong đề tài 26

Bảng 7: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tương quan R2 của Derrone và VX-680 48

Bảng 8: Bảng thống kê tỷ lệ tế bào HeLa bám đĩa khi được ủ với VX-680 và chế phẩm Derrone 54

Bảng 9: Thang chuẩn đánh giá độ độc của chất thông qua giá trị IC50 62

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1: Mitosis và cytokinesis 4

Hình 2: Sự phosphoryl hóa H3 ở kỳ trung gian 6

Hình 3: Chức năng và hoạt động của Aurora B và PP1 trong việc phosphoryl hóa H3 tại Ser10 8

Hình 4: Cơ chế hoạt động của điểm kiểm soát phân bào 9

Hình 5: Cấu trúc của Aurora kinaza A, B và C 12

Hình 6: Sự phân bố của Aurora A và B trong nguyên phân 13

Hình 7: Aurora B điều hòa sự phân tách nhiễm sắc thể và kiểm soát thoi vô sắc 16

Hình 8: Cây Thông đỏ (Taxus brevifolia) và công thức cấu tạo Paclitaxel 21

Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L Murr và công thức cấu tạo Derrone 22

Hình 10: Nguyên lý hoạt động và các bước cơ bản của phương pháp MTT 29

Hình 11: Bố trí thí nghiệm trên đĩa nuôi cấy 96 giếng 30

Hình 12: Các thành phần chính và nguyên tắc hoạt động của hệ thống xCELLigence 31

Hình 13: Thành phần cấu tạo và hoạt động của hệ thống máy Flow Cytometry 35

Hình 14: Đồ thị biểu diễn trạng thái của MCF-7 dưới tác dụng của Derrone theo thời gian 39

Hình 15: Phân tích tốc độ chết của tế bào MCF-7 sau khi CI đạt giá trị cực đại ở mẫu ủ Derrone 40

Hình 16: Đồ thị biểu diễn trạng thái của MCF-7 dưới tác dụng của VX-680 theo thời gian 41

Hình 17: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng MCF-7 từ thời điểm 118 đến 148 giờ thí nghiệm 41

Hình 18: Đường cong đáp ứng liều của MCF-7 dưới sự tác động của Derrone ở 148 giờ 42

Hình 19: Đồ thị biểu diễn trạng thái của H1299 dưới tác dụng của Derrone theo thời gian 43

Hình 20: Đồ thị biểu diễn trạng thái của H1299 dưới tác dụng của VX-680 theo thời gian 43Hình 21: Phân tích tốc độ chết của tế bào MCF-7 sau khi CI đạt giá trị cực đại ở mẫu ủ Derrone nồng độ 5 và 10 μg/ml 45Hình 22: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng H1299 từ thời điểm

53 đến 76 giờ thí nghiệm 45Hình 23: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều dòng H1299 dưới tác động của Derrone tại thời điểm 76 giờ 46Hình 24: Đồ thị biểu diễn trạng thái của HeLa dưới tác dụng của Derrone theo thời gian 46Hình 25: Đồ thị biểu diễn trạng thái của HeLa dưới tác dụng của VX-680 theo thời gian 47Hình 26: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng HeLa từ thời điểm

40 đến 78 giờ thí nghiệm 47Hình 27: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều dòng HeLa dưới tác động của Derrone ở thời điểm 78 giờ 48Hình 28: Hình ảnh tế bào sau 48 giờ ủ với chế phẩm Derrone và Taxol 50Hình 29: Đường cong đáp ứng liều của HEK 293 với chất Derrone và Taxol 51Hình 30: Hình ảnh tế bào HeLa dưới sự tác động của Taxol, VX-680 và Derrone 52Hình 31: Hình ảnh tế bào MCF7 dưới sự tác động của Taxol, VX-680 và Derrone 53Hình 32: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của Derrone lên chu trình tế bào ở mẫu đối chứng và các mẫu ủ Derrone trong 8, 15 và 24 giờ 55Hình 33: Biểu đồ thể hiện giá trị FSC của tế bào ở mẫu đối chứng và các mẫu ủ Derrone trong 8, 15 và 24 giờ 56Hình 34: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của tế bào HeLa ở mẫu đối chứng sinh học 57Hình 35: So sánh biểu hiện của H3PS10 trên tế bào HeLa dưới tác động của thuốc 58Hình 36: So sánh biểu hiện của H3PS10 và Aurora B trên tế bào MCF-7 dưới tác động của VX-680, Derrone với đối chứng 59

Hình 37: Biểu đồ thể hiện cường độ tín hiệu H3PS10 của tế bào dưới tác động của Derrone 15μg/ml so với đối chứng Taxol trên dòng tế bào HeLa 60Hình 38: Dự đoán khả năng và vị trí liên kết của Derrone với Aurora B sử dụng phần mềm AutoDock Vina, so sánh với Luteolin và VX-680 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APC/C Anaphase-promoting Complex/Cylosome

ATP Adenosine Triphosphate

BTAK Breast Tumor Activated Kinaza

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

INCENP Inner Centromere Protein

LSM Laser Scanning Microscope

MAPK Mitogen – activated Protein Kinase

MCAK Mitotic Centromere – associated kinesin

MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl

tetrazolium bromide PBS Phosphate Buffered Saline

RPMI Roswell Park Memorial Institute

cơ chế phát sinh và xâm lấn của căn bệnh này cũng đang được quan tâm nghiên cứu

Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thư thu nhận và biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên đặc tính phức tạp về mặt tổ chức của bệnh, bao gồm: duy trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân lên gần như bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu và hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn Quá trình xảy ra xuyên suốt để tế bào bất thường hình thành khối u trong cơ thể chính là sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào, mà nguyên phân là giai đoạn thiết yếu Vì vậy để ngăn chặn ung thư, nguyên phân trở thành một đích tác động đầy tiềm năng Kết hợp những kiến thức và thành tựu khoa học đó, đã có rất nhiều hợp chất được thử nghiệm nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư nhắm đến các yếu tố khác nhau tham gia vào nguyên phân, trong đó các enzym kinaza điều khiển chu trình tế bào là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới trong những năm gần đây Ở Việt Nam, đây vẫn đang là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn những phát hiện mang tính đột phá

Vốn là một đất nước được thiên nhiên ưu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói chung

Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có khả năng chữa ung thư là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu

tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay

Phát triển cùng xu hướng, và nhằm góp phần đẩy mạnh hơn nữa việc nghiên cứu các chế phẩm có tiềm năng chữa ung thư, đặc biệt là các chế phẩm có khả năng tác động lên các enzym kinaza trong chu trình tế bào, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính Aurora kinaza in vitro của

Derrone phân lập từ cây Vông nem Erythrina orientalis L Murr” với các nhiệm

vụ chính như sau:

 Kiểm tra ảnh hưởng của Derrone lên sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D

 Nghiên cứu ảnh hưởng của Derrone lên chu trình tế bào

 Bước đầu nghiên cứu tác động của Derrone lên hoạt tính của Aurora kinaza thông qua kiểm tra khả năng ức chế sự phosphoryl hóa histon H3 ở vị trí Serine 10 (H3PS10)

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1 NGUYÊN PHÂN

Nguyên phân là giai đoạn quan trọng nhất trong chu trình tế bào Mặc dù đây

là giai đoạn chiếm thời gian ít nhất– chỉ khoảng 1 giờ ở tế bào đông vật có vú – tuy nhiên đó lại là giai đoạn có ảnh hưởng nhiều nhất đến số phận của tế bào.Kết quả của quá trình này là đảm bảo từ một tế bào mẹ tạo ra hai tế bào con giống hệt nhau

và giống hệt tế bào mẹ về vật chất di truyền Ở tế bào soma điển hình, quá trình nguyên phân được chia làm hai pha chính là pha phân chia nhân (mitosis) và phân chia tế bào chất (cytokinesis)

1.1.1 Pha phân chia nhân (mitosis)

Về cơ bản, pha phân chia nhân ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn phải đảm bảo được sự phân chia chính xác các nhiễm sắc tử chị em về hai tế bào con Những sự kiện chính của nguyên phân gồm có sự co đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi phân bào và sự liên kết của nhiễm sắc tử với các dây tơ vô sắc Các nhiễm sắc tử chị em sau đó sẽ phân chia về hai cực của thoi vô sắc và hình thành hai nhân con[8]

Quá trình phân chia nhân thông thường được chia làm bốn giai đoạn: kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase)(Hình 1)

Kỳ đầu khởi đầu bằng sự co đặc của nhiễm sắc thể Phân tử ADN mới được hình thành sau quá trình nhân đôi ở pha S vẫn còn đang tháo xoắn và quấn vào nhau, lúc này sẽ được gỡ rối và co đặc lại, hai nhiễm sắc tử chị em của cùng một nhiễm sắc thể sẽ dính nhau nhờ phức hệ protein sắp xếp quanh tâm động, tạo nên cấu trúc kinetochore, cũng là nơi gắn của sợi vô sắc trong kỳ đầu giữa Ngoài ra ở giai đoạn này, những thay đổi của các phân tử trong tế bào chất giúp kích thích hình thành thoi phân bào.Trung thể (đã được nhân đôi ở kỳ trung gian) phân tách ra và di chuyển về phía đối diện tạo thành hai cực của thoi phân bào.Trong kỳ đầu còn xảy

ra hiện tượng màng nhân biến mất, tuy nhiên hiện tượng này chỉ xảy ra ở tế bào động vật bậc cao Một số cơ thể đơn bào như nấm men, quá trình nguyên phân xảy

ra ở dạng kín khi màng nhân vẫn còn nguyên vẹn

Kết thúc kỳ đầu, tế bào bước vào kỳ đầu giữa (prometaphase), là thời kỳ chuyển tiếp giữa kỳ đầu và kỳ giữa.Lúc này, các sợi vô sắc ở hai phía của của thoi phân bào được gắn với kinetochore tương ứng ở hai phía của nhiễm sắc thể.Nhiễm sắc thể đang nằm lộn xộn trong tế bào được sắp xếp thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc ở kỳ giữa.Đây là giai đoạn hết sức quan trọng với sự tham gia của rất nhiều protein để đảm bảo sự sắp xếp và gắn chính xác của nhiễm sắc thể với thoi phân bào

Quá trình chuyển từ kỳ giữa sang kỳ sau được kích hoạt bởi sự phá vỡ liên kết giữa hai nhiễm sắc tử chị em, và sau đó là sự phân ly về hai cực thoi phân bào Nguyên phân kết thúc vào kỳ cuối, khi màng nhân con hình thành tạo thành hai nhân tách biệt, nhiễm sắc thể tháo xoắn [8]

Hình 1: Mitosis và cytokinesis [8]

1.1.2 Pha phân chia tế bào chất (cytokinesis)

Quá trình nguyên phân có được hoàn thành hay không hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình phân chia tế bào chất, tạo hai tế bào con.Quá trình này thường bắt đầu

ở cuối kỳ sau và được thúc đẩy do sự bất hoạt Cdk1 Ở động vật và nấm men, tế bào chất được phân chia bằng việc hình thành phức hệ vòng có khả năng co rút gồm sợi actin và myosin II bao xung quanh Rãnh phân cắt nằm ở đúng vị trí mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, được hình thành do hệ vòng sợi actin – myosin co lại và chia đôi tế bào chất Mối liên kết giữa hai tế bào sau đó được phá vỡ tạo hai tế bào con Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật phân chia bằng cách hình thành vách tế bào ở trung tâm của tế bào chất, từ từ lan ra cho đến khi chạm vào mặt ngoài của tế bào và cắt tế bào thành hai tế bào con

1.1.3 Một số sự kiện quan trọng trong nguyên phân

1.1.3.1 Sự phosphoryl hóa histon H3 ở vị trí Serine 10

Quá trình đóng xoắn vàtháo xoắn nhiễm sắc thể trong nguyên phân là những

sự kiện phức tạp với sự tham gia của nhiều loại protein điều khiển trong tế bào Nhiễm sắc thể co ngắn cực đạiở kỳ giữa, sau đó tháo xoắn để thực hiện sao chép, sửa chữa, tái tổ hợp và phiên mã ở pha S Để thực hiện được những hoạt động đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra rằng chính protein histon, cụ thể là sự phosphoryl hóa histon H3, là yếu tố quan trọng nhất Không chỉ vậy, sự phosphoryl hóa này còn là một dấu hiệu để nhận biết tế bào đang ở nguyên phân.Có bốn vị trí trên phân tử histon H3 được phosphoryl hóa là Thr3, Ser10, Thr11 và Ser28.Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung tìm hiểu về quá trình phosphoryl hóa H3 tại Ser10 (H3PS10), nhân tố đóng vai trò thiết yếu điều khiển quá trình đóng xoắn và mở xoắn nhiễm sắc thể

Quá trình H3PS10 xảy ra ở cả kỳ trung gian và trong nguyên phân, tuy nhiên mức độ và chức năng lại rất khác nhau.Ở kỳ trung gian, H3PS10 chủ yếu phụ thuộc vào sự cải biến sau dịch mã ở những axit amin xung quanh Ví dụ như trên Hình 2, H3PS10 tăng khi Lys9 hoặc Lys14 được acetyl hóa và giảm khi Lys9 được dimethyl hóa Trái ngược với ở nguyên phân và giảm phân, H3PS10 xảy ra ở kỳ trung gian không ảnh hưởng đến toàn bộ hệ gen mà chỉ liên quan đến những gen đơn lẻ và kích hoạt sao chép của gen đó

Hình 2: Sự phosphoryl hóa H3 ở kỳ trung gian[39]

Sự phosphoryl hóa H3ở vị trí Ser10 trong kỳ trung gian cũng có liên quan đến sự đóng xoắn của nhiễm sắc thể ở nguyên phân, cùng với đó, sự mở xoắn được thực hiện bởi quá trình đề phosphoryl hóa Vào cuối G2, sự phosphoryl hóa xảy ra ở vùng gần tâm động của nhiễm sắc thể, sau đó lan rộng ra toàn bộ nhiễm sắc thể và được hoàn thành ở kỳ đầu Đến kỳ sau và kỳ cuối, H3 được giải phosphoryl hóa [39] Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về vai trò thực sự của quá trình này, và liệu

tế bào có thể bước vào nguyên phân mà không có sự phosphoryl hóa H3 hay không? Van Hooser và cộng sự đã thực hiện vi tiêm một đoạn peptit mang trình tự Ser10 vào trong tế bào từ pha S để làm trung hòa các kinaza có khả năng phosphoryl hóa H3 trong pha G2/M Kết quả thu được là tế bào bị bắt giữ ở G2/M

mà không bước vào nguyên phân[55] Nghiên cứu này tuy không trực tiếp chứng minh được vai trò của H3PS10 trong pha chuyển G2 sang M, nhưng có thể khẳng định vai trò thiết yếu của các kinaza Đồng thời nghiên cứu cũng chứng minh rằng H3PS10 là cần thiết để khởi động quá trình đóng xoắn nhiễm sắc thể và duy trì cho đến kỳ giữa.Một số nghiên cứu khác ở cấp độ phân tử của Wei và cộng sự cũng có đồng quan điểm khi ông tiến hành gây đột biến thay thế vị trí Ser10 thành Alanin Kết quả là có sự biến đổi bất thường trong quá trình đóng xoắn và phân tách nhiễm sắc thể [56]

Quá trình phosphoryl hóa H3 tại Ser10 ở các loài khác nhau được điều hòa chặt chẽ bởi hoạt động của các enzymkinaza và phosphataza đặc hiệu để đảm bảo

sự đóng xoắn và tháo xoắn nhiễm sắc thể trong nguyên phân được thực hiện một cách nhịp nhàng và chính xác

2 Các kinaza tham gia phosphorylhóa H3 tại Ser10 trong nguyên phân

Cho đến nay, đã có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới nhằm tìm ra các kinaza chịu trách nhiệm phosphoryl hóa H3 ở Ser10 trong nguyên phân.Ở nấm men

Saccharomyces cerevisae chỉ có một loại kinaza duy nhất là Ipl1p thực hiện nhiệm

vụ này, hay ở Schizosaccharomyces pombe là Ark1 (Aurora kinase 1)[20, 38] Các

cơ thể đa bào như ruồi giấm và giun tròn có hai loại Aurora kinaza A và B, trong khi ở động vật có vú, Aurora C cũng có khả năng phosphoryl hóa H3 Ser10 trong quá trình hình thành phôi[54] Aurora A và B có khả năng phosphoryl hóa H3 Ser10

in vitro, tuy nhiên khi bất hoạt gen Aurora A không làm ảnh hưởng đến quá trình này ở giun tròn và ruồi giấm Vậy có thể Aurora A không liên quan trực tiếp đến H3PS10 Ở tế bào động vật có vú, các nhà khoa học đã quan sát thấy vị trí phân bố của Aurora B tương đồng với sự biểu hiện H3PS10, và chứng minh được rằng Aurora B khả năng tác động trực tiếp lên quá trình phosphoryl hóa Sự biểu hiện H3PS10 giảm mạnh khi ức chế Aurora B bằng Hesperadin hay ZM447439 Ngoài

ra, sự biểu hiện quá mức của các kinaza ức chế Aurora B trong tế bào cũng làm giảm H3PS10, dẫn đến những biến đổi bất thường trong quá trình đóng xoắn nhiễm sắc thể[15]

Sau Aurora B, MacCallum và cộng sự đã tìm ra một protein thuộc họ kinaza

có khả năng phosphoryl hóa H3 tại Ser10 ở nấm sợi Aspergillus nidulans, được đặt

tên là NIMA (never in mitosis) Sự định vị của NIMA trên nhiễm sắc thể ở giai đoạn đầu của nguyên phân tương đồng với vị trí H3 được phosphoryl hóa, và sự bất hoạt NIMA làm tế bào không thể bước vào nguyên phân [9].Ở tế bào động vật có

vú cũng có một số protein có chức năng tương tự NIMA được gọi là Neks (NIMA – related kinases), điển hình là Nercc1.Một kinaza khác là VRK1 (vacinia-related kinase 1) ở người cũng có vị trí phân bố trong nguyên phân tương đồng với H3PS10 khi quan sát trên tế bào HeLa Biểu hiện H3PS10 cũng giảm mạnh khi thực hiện loại bỏ gen VRK1 trong tế bào

3 Quá trình đề phosphoryl hóa của H3 tại Ser10

Hình 3: Chức năng (A) và hoạt động (B) của Aurora B và PP1 trong việc phosphoryl

hóa H3 tại Ser10[39]

Hoạt động phosphoryl hóa H3 được cân bằng bởi quá trình đề phosphoryl hóa bởi các phosphataza đặc hiệu, cụ thể ở đây là PP1 (protein phosphatase 1).Trong quá trình nghiên cứu tìm ra Ipl1p trên nấm men, các nhà khoa học cũng chứng minh vai trò của Glc7p, là một PP1 có tác dụng đối lập với Ipl1p.Trong quá trình nguyên phân ở tế bào động vật có vú, cả Aurora B và PP1 đều có liên quan và tương tác với nhiễm sắc thể, cụ thể là với H3 ở Ser10.PP1 không chỉ đề phosphoryl hóa Ser10 mà nó còn có khả năng đề phosphoryl hóa và làm bất hoạt chính Aurora

B, thậm trí cả Aurora A ở điều kiện in vitro (Hình 3-A)[39].Vì vậy trong phân bào, PP1 kết hợp với Aurora B tạo thành phức, điều hòa biểu hiện của H3PS10 Khi bước vào nguyên phân (từ kỳ đầu đến kỳ giữa), nồng độ H3PS10 tăng dần cùng với hoạt động của Aurora B, PP1 bị ức chế bởi Cdc2 [15] Đến đầu kỳ sau, Aurora B tách khỏi nhiễm sắc thể, cùng với đó là sự kích hoạt của PP1 dẫn đến biểu hiện H3P10 giảm dần (Hình 3-B)

3.1.1.1 Điểm kiểm soát thoi phân bào (mitotic spindle checkpoint)

Điểm kiểm soát thoi phân bào là một ví trí hết sức quan trọng, nó giúp tế bào dừng lại ở kỳ giữa để kiểm tra, đảm bảo rằng tất cả các sợi vô sắc được gắn chính xác với nhiễm sắc thể, hình thành cấu trúc thoi phân bào hoàn chỉnh trước khi bước vào kỳ sau.Khi các nhiễm sắc tử chị em bắt đầu gắn với các sợi vô sắc của thoi phân bào, không phải tất cả xảy ra hoàn toàn đối xứng nhau ở hai cựcvà trong cùng thời

gian.Bất kỳ một sai sót nào cũng làm cho tế bào bị dừng lại.Ngoài việc gắn đúng vị trí, tế bào còn phải đảm bảo được độ căng giữa sợi vô sắc với kinetochore trên nhiễm sắc thể.Đây cũng chính là tín hiệu cơ bản kích hoạt trạm kiểm soát thoi phân bào

Hình 4: Cơ chế hoạt động của điểm kiểm soát phân bào [13]

Điểm kiểm soát quan trọng này hoạt động bằng cách ức chế phức hệ thúc đẩy kỳ sau APC/C, ngăn cản không cho tế bào bước vào kỳ sau APC/C là một enzymnối có chức năng đánh dấu một sốyếu tố điều hòa chu trình tế bào để chúng

bị các tiêu thể 26S nhận diện và phân giảibằng quá trình ubiquitin hóa Các protein tham gia kiểm soát thoi phân bào gồm có Mad1, Mad2, BubR1, Bub1, Bub3 mà Mps1 Hệ thống protein này ức chế hoạt động của Cdc20, yếu tố gắn đặc hiệu với APC/C Khi tất cả các kinetochore đã được gắn chính xác, Cdc20 được giải phóng

ra, đi đến gắn và kích hoạt APC/C, trạm kiểm soát đóng lại, tế bào bước vào kỳ sau Các protein trong điểm kiểm soát phân bào chủ yếu đóng vai trò nhận biết tín hiệu,

một số điều hòa hoạt động của APC/C hay làm nhiệm vụ đóng cửa trạm kiểm soát Trong số đó, securin đóng vai trò chủ chốt.Securin là một protein ức chế separase, enzym có nhiệm vụ phân hủy phân tử kết nối hai nhiễm sắc tử chị em Khi securin gắn với phức hệ APC/C ở dạng hoạt động sẽ kích thích tín hiệu phân hủy và giải phóng separase, từ đó đẩy nhiễm sắc thể về hai cực tế bào (Hình 4) [13]

3.1.1.2 Hiện tượng “mitotic slippage”

Mitotic slippage, còn được biết đến như một quá trình đáp ứng điểm kiểm soát, là hiệntượng tế bào thoát khỏi nguyên phân để trốn tránh quá trình apoptosis khi tế bào bị dừng lại trong thời gian dài.Ở tế bào người, mitotic slippage thường liên quan đến sự phân hủy cyclin B

Khi có tín hiệu bất thường trong quá trình gắn sợi vô sắc với nhiễm sắc thể, kinetochore sẽ giải phóng Mad2.Mad2 gắn vào Cdc20, làm tách phân tử này ra khỏi phức hệ APC/C Lúc này APC/C bị bất hoạt và ngăn cản phân hủy securin.Quá trình này giúp giữ tế bào lại để sửa chữa sai hỏng APC/C hoạt động trở lại khi liên kết được với Nek2A, sẽ ức chế hoạt động của phức hệ cyclin B/Cdk1 bằng cách phân cắt cyclin B[51] Điều này giúp tế bào thoát khỏi nguyên phân với tình trạng thoi phân bào bị sai hỏng Một ý kiến khác cũng được đề xuất, đó là sự khuyết thiếu trong hoạt động của CPC ở tâm động cũng có thể dẫn đến sự thoát khỏi nguyên phân sớm khi không có sự tham gia của Mad2 và Bub1 [50]

3.2 AURORA KINAZAVÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ

3.2.1 Aurora kinaza

Quá trình phân chia tế bào là một trong những dấu hiệu đặc trưng của cơ thể,

và được kiểm soát chặt chẽ bởi rất nhiều loại protein.Trong mạng lưới protein điều hòa đó, Aurora kinaza là một thành phần quan trọng, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phân bào.Chúng liên quan đến việc điều hoà hoạt động của một số điểm kiểm soát, sự sắp xếp của các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa và sự định hướng các nhiễm sắc thể khi phân ly về hai cực.Hoạt động của Aurora kinaza được điều hoà rất chính xác, chủ yếu là bởi quá trình phosphoryl hoá và phân huỷ Sự mất kiểm soát trong

điều hoà hoạt động của Aurora kinaza có thể dẫn đến bất thường trong nguyên phân, ảnh hưởng đến sự bền vững di truyền, làm mất chức năng của trung tử trong hình thành thoi vô sắc, sự sắp xếp của nhiễm sắc thể bị rối loạn, và ảnh hưởng đến quá trình phân chia tế bào chất[12] Sự điều hoà tăng trong cả mức độ biểu hiện và hoạt động của Aurora kinaza được tìm thấy trong rất nhiều loại ung thư ở người Các Aurora kinaza được đặc biệt chú ý từ khi chúng được xác định là các gen gây ung thư thực sự

Aurora kinaza là enzym thuộc họ kinaza serine/threonin, có tính bảo thủ cao

ở các loài sinh vật.Aurora kinaza đầu tiên được tìm thấy là ở Drosophila [12] Bởi

những đột biến của enzym này gây sai hỏng trong quá trình phân tách của trung thể, làm ảnh hưởng đến quá trình hình thành hai cực của thoi vô sắc, vì vậy nó được gọi

là Aurora (có nghĩa là Bắc Cực).Sau đó, các enzym có cấu trúc đồng đẳng cũng đã

được tìm thấy ở những loài khác nhau.Saccharomyces cerevisae cũng có một loại

Aurora kinaza là Ipl1, ở giun tròn[43, 44], Drosophila[14], và Xenopus [3, 42], có hai loại Aurora kinaza là A và B Đặc biệt, hệ gen của động vật có vú chứa các gen

mã cho đầy đủ ba loại Aurora kinaza là A, B và C Từ những sự khác biệt này có thể nhận thấy cấu trúc của các loại Aurora có sự rẽ nhánh khi tiến hóa Hơn nữa, từ cây phát sinh chủng loại cũng cho thấy rằng họ Aurora ở động vật có xương sống

có liên quan đến nhau và xuất phát từ cùng một tổ tiên chung Aurora A bắt nguồn

từ sự rẽ nhánh giữa động vật máu lạnh và lớp thú, trong khi đó Aurora B và C có thể được suy đoán là hình thành từ một gen chung Aurora B/C ở động vật máu lạnh[5]

3.2.1.1 Cấu trúc Aurora kinaza

Enzym Aurora chia làm ba loại là Aurora A, B và C, có kích thước phân tử khác nhau từ 309 – 403, và giữa các loài cũng có sự khác nhau về cấu trúc Ví dụ,

độ tương đồng về cấu trúc enzym Aurora A giữa người và động vật gặm nhấm là82%, của Aurora B là 84% và Aurora C là 78%[4] Các cấu trúc chung của Aurora gồm một vùng đầu N dài 39-129, một vùng thực hiện chức năng phosphoryl hóa và vùng đầu C ngắn có kích thước 15-20 axit amin (Hình 3) Đầu N của Aurora

A-C có trình tự bảo thủ kém, đây là vùng quyết định sự tương tác giữa protein – protein.Vùng KEN motif bảo thủ được tìm thấy ở Aurora A và B, có chiều dài khoảng 11-18 axit amin Vùng KEN này hoạt động như một tín hiệu nhận biết phụ thuộc Cdh1 (Cdh1-dependant) kích thích hoạt động APC/C Ở người, cấu trúc đầu

C của Aurora B có độ tương đồng với Aurora A và C lần lượt là 73% và 53%, thể hiện tính bảo thủ cao So sánh cấu trúc tinh thể, người ta cũng nhận thấy Aurora B

và C có quan hệ khá gần gũi với nhau[4]

Các loại Aurora kinazacó một số biến đổi trong trình tự axit amin của chúng

và điều này rất quan trọng cho sự tương tác của chúng với các cơ chất đặc biệt.Ngoài ra, sự biến đổi này cũng quy định sự phân bố khác nhau bên trong tế bào

Vị trí hoạt động gắn ATP trong tất cả các Aurora kinazađược cấu tạo bởi 26 tiểu phần giống nhau, và 3 biến thể là Leu215, Thr217, R220 đặc hiệu với Aurora A Aurora A, B và C có cùng trình tự nhận dạng ở vị trí hoạt động của chúng[26]

Hình 5: Cấu trúc của Aurora kinaza A, B và C [4]

3.2.1.2 Vị trí phân bố

Mặc dù có rất nhiều điểm tương đồng về thành phần và cấu trúc, nhưng Aurora kinaza lại phân bố rất khác nhau trong tế bào Aurora A phân bố quanh trung thể, bắt đầu xuất hiện ở vị trí trung thể nhân đôi từ cuối pha S đến đầu G2.Từ

kỳ giữa đến kỳ sau, Aurora A tập trung ở các sợi vô sắc, gần phía hai cực của thoi

phân bào (Hình 6) Sự biểu hiện của Aurora A đạt đỉnh ở G2/M, sau đó giảm khi tế bào thoát khỏi nguyên phân và đi vào G1 trong chu trình tiếp theo

Sự biểu hiện Aurora B cũng đạt đỉnh ở G2/M, và hoạt động mạnh mẽ nhất khi tế bào chuyển từ kỳ giữa sang kỳ sau Aurora Bluôn duy trì trong nhân và di chuyển đến tâm động từ kì đầu đến kì giữa.Khi bắt đầu kỳ sau, Aurora B thay đổi vị trí dần dần đến tập trung lại tại thể giữa của tế bào ở kỳ sau, cho đến khi phân chia

tế bào chất kết thúc(Hình 6).Hơn nữa, Aurora B là một thành viên của phức hệ protein hành khách (CPC – Chromosomal passenger complex) cùng với INCENP, Survivin và Borealin.Phức hệ này liên kết chặt chẽ với nhau, tồn tại vàđặc trƣng bởi

sự thay đổi vị trí trong nguyên phân, di chuyển chính xác từ vị trí này sang vị trí khác tại những thời điểm cụ thể

Hình 6: Sự phân bố của Aurora A và B trong nguyên phân [23, 31]

Aurora A (màu đỏ); Aurora B (màu xanh lá cây); ADN (màu xanh dương)

a-Kỳ trung gian; b-Kỳ đầu; c-Kỳ giữa; d-Kỳ sau; e-Cytokinesis

Hiện nay vẫn chƣa có nhiều công bố về sự phân bố cũng nhƣ chức năng của Aurora C.Aurora C phần lớn biểu hiện trong tinh hoàn, khi tế bào giảm phân tạo tinh trùng vàhoạt động cùng với INCENP trong tinh bào.Ngoài ra Aurora C còn

biểu hiện với nồng độ thấp ở một số mô khác trong cơ thể.Những nghiên cứu ban đầu cho rằng Aurora C bắt đầu biểu hiện và tập trung ở trung thể từ kỳ sauvà duy trì

ở đó cho đến khi tế bào chất phân chia [25] Tuy nhiên, gần đây người ta phát hiện thấy sự phân bố của Aurora C trong phân bào giống với Aurora B, như là một thành viên của CPC[28] Sự biểu hiện này liên quan chặt chẽ đến hoạt động chức năng của Aurora C, cho thấy vai trò quan trọng của nó trong chu trình tế bào

3.2.1.3 Chức năng của Aurorakinaza

Do sự phân bố của các loại Aurora kinaza trong tế bào khác nhau nên chức năng của chúng cũng thể hiện rất khác nhau trong nguyên phân

 Aurora A

- Điều hoà quá trình sắp xếp của thoi phân bào: ở G2, Aurora ban đầu phân bố

ở xung quanh vùng hình thành trung thể, giúp hình thành và phát triển của trung thể Cuối G2, Aurora A ở trạng thái hoạt động sẽ lôi kéo các protein nguyên liệu cho quá trình phát triển của trung thể như γ-tubulin, phức hệ TACC/MAP215, centrosomin, đồng thời đảm bảo sự sắp xếp thoi phân bào diễn ra chính xác[12]

- Điều hoà quá trình phân tách trung thể ở pha chuyển G2-M[16]

- Liên quan đến điểm kiểm soát G2/M: Aurora A phosphoryl hóa CDC25B, một enzym phosphataza đóng vai trò hoạt hóa phức hệ Cdk1-cyclin B1, thúc đẩy tế bào đi vào nguyên phân Sự ức chế Aurora A bởi các ARNi sẽ làm tế bào bị bắt giữ ở G2-M và gây apoptosis [6]

 Aurora B

Aurora B cùng với các thành viên của CPC tham gia kiểm soát nhiều hoạt động trong phân chia nhân và phân chia tế bào chất.Phức hệ này giúp sửa chữa sai sót trong việc liên kết giữa kinetochore và sợi vô sắc, đảm bảo sự phân tách hai nhiễm sắc tửmột cách chính xác, thúc đẩy sự co ngắn của sợi vô sắc ở kỳ sau và tham gia vào cytokinesis

 Aurora B điều hoà quá trình đóng xoắnnhiễm sắc thể

Chức năng này được thể hiện khi Aurora B phosphoryl hoá histon H3 ở vị trí Serine 10, Serine 28 (H3PS10 và H3PS28),và trong nhiều loại CENP-A ở vị trí Ser7.H3PS10 hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng để kiểm tra hoạt tính Aurora B trong ống nghiệm (kinase assay), và là một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu tìm ra các chất ức chế hoạt động của Aurora kinaza.Ngoài

ra, H3PS10 ở tế bào động vật có liên quan đến sự di chuyển của họ protein HP-1 đến vị trí chấtnhiễm sắc trong quá trình hình thành và sắp xếp vùng dị nhiễm sắc[19]

 Aurora B điều hòa sự phân tách nhiễm sắc thể

Sau khi màng nhân biến mất ở kỳ đầu, sợi vô sắc phát triển từ hai cực sẽ liên kết với kinetochore của hai nhiễm sắc tử chị em, hình thành thoi phân bào Sai sót trong quá trình này như hiện tượng merotelic (một số sợi vô sắc ở một trong hai nhiễm sắc tử xuất phát từ cùng một cực với nhiễm sắc tử kia) hay syntelic (cả hai nhiễm sắc tử chị em của một cặp nhiễm sắc thể cùng đính với sợi vô sắc từ một cực) xảy ra khá thường xuyên Tế bào cần được sửa chữa mới có thể tiếp tục đi đến kỳ sau.Ở đây, Aurora B thực hiện hai chức năng chính là sửa chữa, giữ vững và kiểm soát thoi vô sắc

- Sửa chữa và giữ vững: Aurora B được hoạt hóa mạnh khi có sự liên kết bất thường của các nhiễm sắc tử với sợi thoi vô sắc Khi Aurora B hoạt hóa, nó

sẽ phosphoryl hóa một số protein thành phần của kinetochore tham gia vào quá trình sửa chữa sự đính sai của các nhiễm sắc thể Mặt khác, trong điều kiện bình thường, khi các nhiễm sắc thể đều liên kết chính xác với các vi ống của thoi vô sắc, Aurora B góp phần làm bền các mối liên kết thông qua sự phosphoryl hóa MCAK (mitotic centromere-associated kinesin) để ức chế sự depolymer hóa của các sợi vô sắc (Hình 7 – A)[12]

Hình 7: Aurora B điều hòa sự phân tách nhiễm sắc thể (A) và kiểm soát thoi vô sắc

(B)[12]

- Kiểm soát thoi vô sắc: các protein có chức năng kiểm tra sẽ di chuyển đến vị trí các kinetochore nếu nó không được gắn với dây vô sắc, từ đó ức chế hoạt động của APC/C, ngăn cản tế bào đi vào kỳ sau Ở đây, chính Aurora B đảm nhiệm chức năng thu hút các protein kiểm tra đi đến kinetochore (Hình 7 – B) [12]

 Điều hòa quá trình phân chia tế bào chất

Aurora B đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phân chia tế bào chất.Ở giun tròn, ức chế Aurora B sẽ gây ra hiện tượng đa bội do tế bào chất không được phân chia trong giai đoạn phôi Aurora B kết hợp với Rho, một nhân tố điều hòa điển hình trong phân chia tế bào chất, điều khiển quá trình cytokinesis.Đồng thời, Aurora

B cũng kích hoạt Rho bằng cách biến đổi MgcRacGAP để tạo thành RhoGAP, đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoàn thành phân chia

 Aurora C

Aurora C có liên quan đến quá trình sinh tinh và sinh trứng ở động vật có vú Một số công bố cho rằng nó còn có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của tế bào ở tất cả các mô khi biểu hiện ở nồng độ thấp [58] Đặc biệt, Aurora C được tìm thấy là có khả năng đồng kết tủa miễn dịch với Aurora B Điều này chứng tỏ Aurora C có thể tương tác với INCENP và Survivin để hoạt động

chức năng, đồng thời cũng có khả năng phosphoryl hóa histon H3 giống Aurora B Một nghiên cứu gần đây cho thấy Aurora C có thể đảm nhận nhiệm vụ hoạt động của Aurora B trong nguyên phân khi vắng mặt kinaza này [46]

3.2.2 Vai trò của Aurora kinaza trong sự hình thành ung thư

Aurora thể hiện vai trò vô cùng quan trong trong nguyên phân Vì vậy sự biểu hiện bất thường của chúng có thể dẫn tới sự chuyển dạng tế bào, gây ung thư

Ở một số mô, cơ quan trong cơ thể, sự biểu hiện quá mức của Aurora kinaza dẫn đến sự bất ổn di truyền, gây đa bội làm số lượng ADN tăng lên do nhiễm sắc thể được nhân đôi và phân tách nhưng quá trình cytokinesis không xảy ra được Nhiều nghiên cứu cho thấy gen Aurora A còn được biết đến như một gen gây ung thư[26]

3.2.2.1 Aurora A

Gen Aurora A nằm ở vị trí 20q13.2,ban đầu được đặt tên là BTAK (Breast Tumor Activated Kinase) do sự biểu hiện quá mức mARN của chúng đóng vai trò thiết yếu trong hình thành khối u ung thư vú ở người Một số nghiên cứu cho thấy

sự biểu hiện quá mức này có thể làm chuyển dạng NIH-3T3 và rat1, gây khối u trên chuột nude.Từ đó, Aurora trở thành một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng Zhou cùng đồng nghiệp đã chứng minh sự khuếch đại gen Aurora A trong nhiều loại ung thư khác nhau (Bảng 1)

Cơ chế hoạt động của Aurora A liên quan đến ung thư hiện nay cũng được tập trung nghiên cứu Meraldi và cộng sự đã chứng minh rằng sự khuếch đại gen Aurora A làm cản trở sự hoạt động của điểm kiểm soát thoi phân bào, do đó tế bào không hoàn thành cytokinesis và hình thành dạng tứ bội [33] Ngoài ra, Aurora A còn cần thiết cho sự chuyển dạng tế bào Trong tế bào phôi ếch, Aurora A thể hiện chức năng tăng cường sự dịch mã của Mos, là một gen gây ung thư, hoặc hoạt động cùng với tín hiệu Ras để kích hoạt con đường MAPK (Mitogen-activated protein kinase)

Bảng 1: Sự biểu hiện quá mức hay khuếch đại gen Aurorakinaza ở nhiều loại

ung thư khác nhau [40, 47,48]

Ung thư buồng trứng 2774; SK-OV3 Ung thư ruột kết HCT116; HT29; SW480 Ung thư tuyến tụy DU145; PC3

Bạch cầu ác tính HL60; K562

Ung thư cổ tử cung SW756

Ung thư biểu mô tuyến giáp ARO; Cal 62; KAT-4

Ung thư cổ tử cung HeLa

Sự biểu hiện bất thường của Aurora còn có liên quan chặt chẽ với hoạt động của p53 trong quá trình hình thành khối u Aurora A phosphoryl hóa p53, điều khiển sự bền vững của protein này Ngược lại, p53 tác động đến GAdd45a, mà phân

tử này lại tương tác và ức chế Aurora A Ngoài ra, một số nghiên cứu còn cho thấy p53 có thể trực tiếp ức chế Aurora A bằng cách bám vào vùng xúc tác Vậy sự ảnh hưởng của Aurora A khi biểu hiện quá mức đến việc hình thành thể tứ bội, hay sự khuếch đại nhiễm sắc thể là phụ thuộc vào trạng thái của p53 trong tế bào [54]

3.2.2.2 Aurora B

Gen Aurora B nằm ở vị trí 17p13.1 trên nhiễm sắc thể Nhiều báo cáo cho thấy sự biểu hiện bất thường của Aurora B cũng góp phần hình thành khối u[26] Điều này là dễ hiểu do chức năng vô cùng quan trọng của nó trong nguyên phân Vì vậy gen Aurora B cũng được coi là một gen gây ung thư Nghiên cứu trên dòng tế

bào buồng trứng chuột chuyển dạng CHO (Chinese hamster ovary) cho thấy rằng biểu hiện quá mức Aurora B gây tế bào dị bội và tăng khả năng xâm lấn và phát triển của khối u thực nghiệm[36] Katayama và các đồng nghiệp là những người đầu tiên chứng minh được sự biểu hiện quá mức Aurora B trong ung thư ruột kết Phát hiện này đã thu hút sự tập trung nghiên cứu của các nhà khoa học Hiện nay, sự biểu hiện Aurora B bất thường cũng được tìm thấy ở nhiều loại ung thư như ung thư vòm họng, ung thư phổi không tế bào nhỏ (Bảng 1)

3.2.2.3 Aurora C

Gen Aurora C nằm ở vị trí 19q13.43, một vùng thường xảy ra đột biến đảo hoặc mất đoạn trong một số loại ung thư nhất định [58] Aurora C cũng được coi là một gen gây khối u do sự biểu hiện quá mức của Aurora C được tìm thấy ở một số loại ung thư như ung thư gan, ung thư vú và ung thư cổ tử cung Một nghiên cứu gần đây của Jabbar Khan và cộng sự trên dòng tế bào NIH-3T3 đã chứng minh rằng

sự biểu hiện quá mức Aurora C gây ra sự khuếch đại trung thể, đa nhân và chuyển dạng tế bào Ngoài ra sự biểu bất thường của Aurora C còn thúc đẩy quá trình hình thành khối u khi thí nghiệm trên chuột nude [24]

3.3 CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

3.3.1 VX680 - chất ức chế Aurorakinaza

Trong số hơn 500 loại enzymkinaza đã được xác định trong tế bào, Aurora kinaza được coi như một đích đến vô cùng quan trọng trong điều trị ung thư bởi chức năng quan trọng của nó trong phân bào Cơ chế tác động của các chất ức chế Aurora chủ yếu theo hai hướng là ngăn cản tương tác protein-protein giữa Aurora

và cơ chất hoặc ức chế hoạt tính của enzym thông qua cạnh tranh vị trí liên kết xúc tác ATP Theo đó, các nhà khoa học đã công bố ba chất ức chế Aurora kinaza điển hình đầu tiên, đó là ZM447439[18], Hesperadin[10] và VX680[17] Ba chất này đều gây ra kiểu hình tế bào giống nhau khi xử lý trên tế bào in vitro.Đặc biệt, chúng đều ức chế sự phosphoryl hóa H3 ở serin 10, từ đó ức chế phân bào, xảy ra hiện tượng mitotic slippage.Ngoài ra gần đây, nhiều nghiên cứu đã tìm ra một số chất ức

chế Aurora kinaza như MLN8054, PHA-739358, MLN8237 và AZD1152, hiện đang trong pha I và II của nghiên cứu[22] Đặc điểm của ZM447439, Hesperadin, VX680 được trình bày trong Bảng 2 [23]

- Ức chế H3PS10 ở 100nM

18 và 4,6nM (*)

(*) Ki: hằng số ức chế (inhibition constants)

VX680, cũng được biết đến là MK-0457, là phân tử thuộc nhóm 4,6 amino pyrimidine có công thức phân tử là C23H28N8OS, khối lượng phân tử là 464,59 g/mol VX680 được phát triển dưới sự kết hợp giữa hai hãng dược phẩm Vertex và Merk Cơ chế tác động của VX680 là có ái lực cạnh tranh với vị trí liên kết ATP nằm trên cả ba loại Aurora kinaza mà không có cấu trúc tương tự trên các loại enzymkinaza khác[22] Theo đó, trong nhiều công bố cho thấy VX-680 có khả

di-năng ức chế cả ba loại Aurora A, B và C Trong nguyên phân, kiểu hình tế bào xuất hiện sau khi điều trị với VX-680 cho thấy nó chủ yếuức chế Aurora B làm ngăn cản

sự phosphoryl hóa H3, gây đa bội hóa và đưa tế bào đến apoptosis Sự tác động lên Aurora A thể hiện ở việc thoi vô sắc có sự bất thường về số cực[22].Cơ chế ảnh hưởng lên Aurora C vẫn chưa được xác định rõ

Hiện nay, VX-680 đang được nghiên cứu phát triển và thử nghiệm trên người.Pha I được tiến hành vào năm 2004, và đến năm 2007, pha II được thực hiện, cho kết quả rất khả quan

3.3.2 Paclitaxel (Taxol)

Hình 8: Cây Thông đỏ (Taxus brevifolia) và công thức cấu tạo Paclitaxel

http://waynesword.palomar.edu/montph9.htm http://en.wikipedia.org/wiki/File:Taxol.svg

Paclitaxel (C47H51NO14 có khối lượng phân tử M = 853,906 g/mol) lần đầu tiên được đề xuất với tên gọi là Caltuvocus – cây Thủy tùng – từ thời La Mã cổ đại Một số bài thuốc dân gian cũng sử dụng các dịch chiết này như một chất độc hoặc thuốc chữa bệnh.Nghiên cứu độc tính của Paclitaxel lên tế bào bắt đầu từ năm 1962,

và đến năm 1967, thành công trong việc tách chiết chất này từ vỏ cây Thông đỏ

(Taxus brevifolia), đặt tên là Taxol.Tuy nhiên đến năm 1979, cơ chế tác dụng của

Taxol mới được khám phá Horwits và cộng sự đã công bố các phát hiện của họ về tương tác giữa Paclitaxel với các vi ống, đó là khả năng thúc đẩy quá trình hình thành vi ống bằng cách bám và làm bền vi ống, ngăn sự giải trùng hợp sợi vô sắc ở

kỳ sau, và làm tế bào bị dừng lại ở kỳ giữa của nguyên phân Tế bào sau đó được kích hoạt để đi theo con đường apoptosis Các thử nghiệm lâm sàng với Paclitaxel

bắt đầu từ năm 1984 và cho đến nay, Paclitaxel đang được sử dụng để điều trị ung thư phổi, ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư chuyển dạng Kaposi sarcoma

Với những hiệu quả Paclitaxel mang lại trên bệnh nhân ung thư, hiện nay ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đang tập trung nghiên cứu các phương pháp chiết xuất hợp chất này từ cây Thông đỏ Tuy nhiên nguy cơ tuyệt chủng của loài cây này đang được cảnh báo, vì vậy với sự phát triển của khoa học công nghệ, nhiều cơ quan, viện nghiên cứu đã phát triển các phương pháp khác để sản xuất Taxol như nuôi cấy mô tế bào, hoặc từ nấm nội sinh thực vật, đồng thời phát triển dự án trồng cây Thông đỏ ở Việt Nam

3.3.3 Chế phẩm Derrone

Chế phẩm Derrone do Viện Dược Liệu bào chế và cung cấp, đạt tiêu chuẩn

cơ sở, sử dụng cho Dược lý thực nghiệm Chế phẩm cung cấp có dạng tinh thể màu vàng nhạt, nguyên chất

Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L Murr và công thức cấu tạo Derrone

Indonesia và Philippin Vỏ, lá và rễ của cây Vông nem là một vị thuốc dân gian của Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới với nhiều tác dụng hiệu quả như an thần, chữa mất ngủ, hạ huyết áp, co bóp cơ, trừ phong thấp và kháng khuẩn

Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano)isoflavone) có công thức hóa học là C20H16O5, M = 336,1 g/mol, lần đầu tiên được phân lập vào năm 1980, tuy nhiên những nghiên cứu về hợp chất này chưa được quan tâm nhiều Năm 2012, Hayet Edziri và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh tác động kháng khuẩn của Derrone Theo nghiên cứu này, Derrone có khả năng kháng vi khuẩn chủng

Pseudomonasaeruginosa và Escherichia coli với nồng độ trong khoảng từ 7,81 –

15,62 µg/ml Ngoài ra, Derrone cũng thể hiện tính kháng nấm mạnh với các loài

thuộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL Đặc biệt, khi nghiên cứu trên tế bào động

vật, Derrone cũng thể hiện độc tính với dòng ung thư gan Hep-G2 (IC50 = 30 µg/ml)

và dòng tế bào ung thư vú KPL4 (IC50= 17,8 µg/ml) (R2>0,9)[1, 11] Một nghiên cứu khác cho thấy, Derrone còn có tác dụng ức chế hoạt động của DGAT (diacylglycerol acyltransferase) với chỉ số IC50 là 15,1 µg/ml, ứng dụng trong điều trị tiểu đường loại 2 [35] Mặc dù vậy, cơ chế chuyên sâu về tác động của Derrone lên tế bào vẫn chưa được biết rõ

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG

- Các dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7, H1299 và dòng tế bào thận phôiHEK 293 do Nhóm nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm – Bộ môn Sinh học Tế bào – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp (Bảng 3)

Bảng 3: Đặc điểm, nguồn gốc và điều kiện nuôi cấy của các dòng tế bào sử

dụng trong nghiên cứu

Loại tế bào Ung thư cổ tử

cung Ung thư vú

Ung thư phổi không tế bào nhỏ

Tế bào phôi thận

Mô Biểu mô tuyến Biểu mô tuyến Biểu mô -

- Chất 14 – Derrone do Nhóm nghiên cứu của TS Phương Thiện Thương, Viện Dược liệu Trung ương cung cấp, tinh thể dạng bột màu vàng tinh nguyên chất

Hệ thống máy xCELLigence RTCA ACEA Biosciences Hoa Kỳ

Kính hiển vi huỳnh quang Axio Plan 2 Carl Zeiss Đức

Kính hiển vi laser quét LSM 510 Carl Zeiss Đức

Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40

CFL

Microplate Reader Model 680 Bio – Rad Nhật Bản

Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê ở Bảng 5

Bảng 5: Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao

Đĩa nuôi cấy tế bào 35, 100mm Corning Hoa Kỳ

Hóa chất sử dụng trong đề tài đƣợc liệt kê trong Bảng 6

Bảng 6: Hóa chất sử dụng trong đề tài

CellTiter 96® Non-Radioactive Cell

FBS Invitrogen Hoa Kỳ

Taxol (Paclitaxel) Ebewe Pharma Australia

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào

- Tế bào được bảo quản trong Nitơ lỏng hoặc tủ -80oC, lấy ra đem rã đông bằng bể ổn nhiệt 37oC và đưa ngay vào tủ vô trùng

- Đưa dung dịch chứa tế bào vào trong ống ly tâm đã có chứa 2ml môi trường nuôi cấy, ly tâm 1300 rpm trong 5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

- Hòa cặn tế bào trong 5 – 7ml môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo thành dạng dung dịch huyền phù tế bào rồi cho vào đĩa Petri và ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 Kiểm tra tế bào hàng ngày,khi tế bào chiếm 70 – 80% bề mặt đĩa, tiến hành cấy chuyển tế bào sang đĩa nuôi cấy mới

- Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy: loại bỏ môi trường nuôi cấy và rửa tế bào bằng PBS Sau đó ủ tế bào với dung dịch Trypsin 1X trong 5 phút ở 37o

C, 5%

CO2 Trung hòa Trypsin bằng cách pha loãng với môi trường nuôi cấy, hút dịch và đem ly tâm ở 1300 rpm trong 5 phút

- Kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm Blue Trypan tỷ lệ 1:1 trong 3 – 5 phút rồi đếm số lượng bằng buồng đếm tế bào Nếu tỷ lệ chết < 10% tổng số tế bào thì tế bào được xem là đủ khỏe mạnh dùng để cấy chuyển tiếp tục hoặc dùng cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo

2.3.2 Đánh giá độc tính của chế phẩm Derrone bằng phương pháp MTT

 Đối tượng

- Dòng tế bào thận phôi HEK 293

- Chế phẩm Derrone với dải nồng độ 80 – 40 – 20 – 10 – 5 μg/ml

- Đối chứng Taxol với dải nồng độ 30 – 3 – 0,3 – 0,03 và 0,003µg/ml

 Nguyên lý

Chúng tôi sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay của hãng Promega (gọi tắt là phương pháp MTT) Phương pháp MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) hiện nay được sử dụng rất phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự khử hợp chất MTT màu vàng thành dạng tinh thể formazan màu tímtrong tế bào sống[32] Nồng độ formazan hình thành được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 500-600nm.Quá trình khử xảy ra dưới sự xúc tác của enzym trong

ty thể trong tế bào sống, theo đó hàm lượng của chất tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng

tế bào sống tham gia phản ứng

Phương pháp MTT có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bước thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thường sử dụng kiểm tra độc tính để sàng lọc thuốc với số lượng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau Kết quả thu được cho ra giá trị IC50 (nồng độ thuốc mà tại đó tế bào bị ức chế tăng sinh 50%), từ

đó đánh giá được độ độc của thuốc cần nghiên cứu

Hình 10: Nguyên lý hoạt động (trái) và các bước cơ bản (phải) của phương pháp MTT

http://www.dojindo.eu.com/store/p/782-DURALiQ-MTT-Stable-Solution.aspx

Kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay được cung cấp bởi Promega gồm hai dung dịch là dung dịch nhuộm (Dye Solution) và hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng (Solubilization Solution/Stop Mix)

 Quy trình thí nghiệm

- Nạp tế bào: tiến hành nạp tế bào vào trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng (được bố trí nhưHình 11) với nồng độ 8000 tế bào/180µl môi trường nuôi cấy, sau đó ủ trong 37oC, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24 giờ trước khi tiến hành thử thuốc

- Ủ với thuốc thử: Do chế phẩm là chất khó tan dung môi nên chúng tôi tiến hành pha thuốc trong dung môi có bổ sung DMSO sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO trong mỗi giếng tế bào là 0,15% Sau đó ủ tế bào ở mỗi giếng với 20µl thuốc thử đã pha Gõ nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong 48 giờ ở trong tủ ấm 37oC, 5% CO2

Hình 11: Bố trí thí nghiệm trên đĩa nuôi cấy 96 giếng

(M): Giếng được nạp môi trường nuôi cấy; (MT): Giếng nạp môi trường nuôi cấy và tế bào; (V H ): Giếng nạp môi trường nuôi cấy, tế bào và dung môi pha mẫu dùng làm đối chứng

- Hút bỏ 100μl môi trường ở mỗi giếng và bổ sung vào 15μl dung dịch nhuộm

Gõ nhẹ đĩa và ủ trong 4 giờ ở 37oC Ở bước này, dung dịch cần được bọc kín

- Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định được % tỷ số tăng sinh (A) của

tế bào, từ đó đánh giá được độ độc đối với tế bào của chế phẩm A được tính theo công thức:

A(%) = V T

H x 100(1)

V H : giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi pha thuốc T: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc

Nếu A = 50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây chết 50% tế bào, ký hiệu

là IC50 Đây là giá trị để đánh giá độc tính của thuốc đối với tế bào Phương pháp tính toán giá tri IC50 được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit

2.3.3 Thử độc tính của Derrone sử dụng phương pháp xCELLigence

 Nguyên lý

Trước đây, việc đo khả năng tăng sinh hay sự chết của tế bào dưới tác động của thuốc thử chỉ thể hiện được ở một thời điểm nhất định Một công nghệ mới đã được phát triển do Roche Applied Science kết hợp với ACEA Biosciences, cho phép kiểm tra tế bào theo thời gian, sử dụng đĩa nuôi cấy tế bào chuyên dụng Hệ thống máy xCELLigence có thể đo và định lượng khả năng bám đáy đĩa, sự sinh trưởng, cũng như sự chết của tế bào, hay bất kỳ một sự thay đổi nào về tính chất, từ

đó đưa ra đồ thị biểu diễn chỉ số tế bào (CI – cell index) theo thời gian[45]

Hình 12: Các thành phần chính (trái) và nguyên tắc hoạt động (phải) của hệ thống

xCELLigence

Thiết bị trung tâm của hệ thống xCELLigence là mạng lưới cảm biến điện gắn ở dưới đáy của đĩa 96 giếng (E-plate 96) Việc đo điện trở của những điện cực cảm biến này cho phép phát hiện và theo dõi những thay đổi của tế bào trên điện cực đó Khả năng sống, số lượng, hình thái và độ bám dính của tế bào, tất cả đều ảnh hưởng đến điện trở của điện cực.Ngoài ra, giá trị điện trở còn phụ thuộc vào