Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên Tr-ơng Văn Hạnh Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội - 2013 Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên Tr-ơng Văn Hạnh Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Chuyên ngành: Di truyền học Mà sè: 62 42 70 01 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh học Ng-ời h-ớng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Đình Đạt PGS.TS Hồ Đình Trung Hà Nội - 2013 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết luận án trung thực ch-a đ-ợc công bố công trình tài liệu Tác giả Tr-ơng Văn Hạnh Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Đình Đạt, PGS.TS Hồ Đình Trung đà tận tình h-ớng dẫn, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi vô biết ơn cố PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh, Thầy đà h-ớng dẫn giúp đỡ năm đầu học tập nghiên cứu sinh thực đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn LÃnh đạo Viện Sốt rét-KST-CTTƯ đà tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ vật chất, thời gian tinh thần trình thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền, thầy cô Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học, thầy cô Ban giám hiệu Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên đà tận tình giúp đỡ trình học tập Tr-ờng Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Khoa Sinh học Phân tử cán Khoa/Phòng Viện Sốt rét-KST-CTTƯ, cán Trung tâm phòng chống sốt rét tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế đà giúp đỡ, ủng hộ động viên trình học tập thực đề tài phòng thí nghiệm nh- địa điểm nghiên cứu Cảm ơn gia đình thân yêu bạn bè đà động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tr-ơng Văn Hạnh Mục Lục Mở Đầu Ch-ơng 1- Tổng quan tài liệu 1.1 BÖnh sèt rÐt 1.2 Các loài ký sinh trùng gây bệnh sèt rÐt ë ng-êi 1.2.1 Thành phần loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ë ng-êi 1.2.2 Chu kú ph¸t triĨn cđa ký sinh trïng sèt rÐt 1.3 Muỗi truyền bệnh sốt rét 1.4 Tình hình sốt rét giới ViÖt Nam 1.4.1 Tình hình sốt rét giới 1.4.2 T×nh h×nh sèt rÐt t¹i ViƯt Nam 10 1.4.3 Đặc điểm điều kiện tự nhiên, kinh tế xà hội tình hình sốt rét tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-êng S¬n, ViƯt Nam 12 1.5 Mét số kỹ thuật sử dụng chẩn đoán, phân biệt loµi KSTSR 15 1.5.1 Kü tht xÐt nghiƯm lam m¸u nhuém giemsa 15 1.5.2 Kỹ thuật chẩn đoán nhanh que thử (Rapid diagnostic test) 16 1.5.3 Kü thuËt PCR chÈn đoán, phân biệt bốn loài ký sinh trùng sốt rét 16 1.6 Nghiên cứu tính đa hình di truyền cña ký sinh trïng sèt rÐt 19 1.6.1 §a h×nh di trun cđa P falciparum 19 1.6.2 Đa hình di truyền P vivax 25 1.7 Ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc 28 1.7.1 Định nghĩa phân loại ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc 28 1.7.2 Mét sè lo¹i thc sư dụng điều trị bệnh sốt rét 29 1.7.3 Tình hình KSTSR kháng thuốc giới Việt Nam 31 1.7.4 Cơ chế tác động thuốc sốt rét KSTSR 35 1.7.5 §ét biÕn gen P falciparum liên quan đến kháng thuốc sốt rét 38 i 1.7.6 Một số kết nghiên cứu phân tích đột biến gen P falciparum kháng thuốc sèt rÐt 41 Ch-ơng - Đối t-ợng, vật liệu Và ph-ơng pháp nghiên cứu 43 2.1 Đối t-ợng nghiên cứu 43 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 43 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 43 2.2.2 Thêi gian nghiªn cøu 43 2.3 VËt liƯu nghiªn cøu 43 2.3.1 Dơng vµ hãa chÊt cho kü tht xÐt nghiƯm lam m¸u 43 2.3.2 Thiết bị hóa chất tách chiết ADN 43 2.3.3 ThiÕt bÞ, dơng cụ hóa chất để tiến hành phản ứng PCR 44 2.3.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất cho điện di phân tích kết PCR 45 2.4 Ph-ơng pháp nghiên cứu 45 2.4.1 ThiÕt kÕ nghiªn cøu 45 2.4.2 MÉu nghiªn cøu 45 2.4.3 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 47 2.4.4 Cách đánh giá kết qu¶ 58 2.4.5 Công thức tính số phân tích số liệu nghiên cứu 60 Ch-ơng - Kết thảo Luận 62 3.1 Thành phần, cấu loài KSTSR tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 62 3.1.1 Kết xác định thành phần, cấu loài KSTSR kỹ thuật xÐt nghiƯm lam m¸u nhm giemsa 62 3.1.2 Kết xác định thành phần, cấu loài KSTSR kỹ thuật PCR 64 ii 3.2 Tính đa hình di truyền quần thể P falciparum khu vực Bắc Tr-êng S¬n, ViƯt Nam 71 3.2.1 Tính đa hình di truyền cña P falciparum theo locus msp1 71 3.2.2 Tính đa hình di truyền P falciparum theo locus msp2 79 3.2.3 Tính đa hình di trun cđa P falciparum theo locus glurp 86 3.3 Tính đa hình di truyền P vivax khu vực Bắc Tr-ờng sơn, Việt Nam 89 3.3.1 Tính đa hình di truyền P vivax theo locus Pvcs 89 3.3.2 TÝnh ®a h×nh di trun theo locus Pvmsp1 93 3.4 Đặc điểm KSTSR kháng thuốc tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn Việt Nam 97 3.4.1 Tû lƯ ®ét biÕn cđa P falciparum kháng thuốc pyrimethamin 97 3.4.2 Tỷ lệ đột biÕn cđa P falciparum kh¸ng thc sulfadoxin 101 3.4.3 Tỷ lệ đột biến P falciparum kháng thuốc chloroquin 106 KếT LUậN Và KIếN NGHị 112 KÕt luËn 112 KiÕn nghÞ 113 Danh mục công trình khoa học liên quan đến Néi dung luËn ¸n 114 Tài liệu tham khảo 115 Phô lôc 138 iii Danh mơc b¶ng B¶ng 1.1 Tình hình sốt rét khu vực Tây Thái Bình D-ơng năm 2008 11 Bảng 1.2 Tình hình sốt rét theo khu vực Việt Nam năm 2006 2010 12 Bảng 1.3 Tình hình sốt rét khu vực Bắc Tr-ờng Sơn năm 2008 2011 15 Bảng 1.4 Thành phần tên số thuèc sèt rÐt 30 B¶ng 1.5 Thời gian KSTSR P falciparum kháng với loại thuốc sốt rét 33 Bảng 1.6 Đột biến điểm gen dhfr P falciparum liên quan đến kháng pyrimethamin 38 Bảng 1.7 Mối liên quan đột biến điểm gen dhfr đáp ứng với pyrimethamin in vitro cđa mét sè chđng, ph©n lËp chn 39 Bảng 1.8 Đột biến điểm gen dhps P falciparum liên quan đến kháng sulfadoxin 40 Bảng 1.9 Mối liên quan đột biến điểm gen dhps đáp ứng với sulfadoxin in vitro cđa mét sè chđng, ph©n lËp chn 40 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi nhân kiểu gen P falciparum 50 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi xác định kiểu gen nhạy đột biến vị trí đột biến gen dhfr 54 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi xác định kiểu gen nhạy đột biến vị trí đột biến gen dhps 56 B¶ng 3.1 Tû lƯ ng-ời dân mắc sốt rét tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 62 Bảng 3.2 Kết xác định tỷ lệ nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loài KSTSR kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 63 Bảng 3.3 Cơ cấu loài KSTSR khu vực Bắc Tr-ờng Sơn kü tht xÐt nghiƯm lam m¸u nhm giemsa 64 B¶ng 3.4 Tû lệ phát bệnh nhân nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loµi KSTSR theo kü thuËt PCR 65 B¶ng 3.5 So sánh tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn nhiễm phối hợp khu iv vực Bắc Tr-ờng Sơn Việt Nam 67 Bảng 3.6 Cơ cấu loài KSTSR khu vực Bắc Tr-ờng Sơn theo kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa vµ PCR 69 Bảng 3.7 Tỷ lệ phân bố kiểu gen cđa P falciparum theo locus msp1 71 B¶ng 3.8 Tỷ lệ mẫu nhiễm đơn nhiễm phối hợp kiểu gen theo locus msp1 72 Bảng 3.9 Tần suất xuất hiƯn cđa c¸c alen ë kiĨu gen K1 73 Bảng 3.10 Tần suất xuất alen kiểu gen MAD20 75 Bảng 3.11 Tỷ lệ phân bố kiểu gen P falciparum theo locus msp2 79 Bảng 3.12 Tần suất xt hiƯn cđa c¸c alen ë kiĨu gen FC 81 Bảng 3.13 Tần suất xuất cđa c¸c alen ë kiĨu gen IC 83 Bảng 3.14 Số l-ợng tần suất alen theo locus glurp 86 B¶ng 3.15 Số l-ợng tần suất alen P vivax theo locus Pvcs 90 B¶ng 3.16 Tû lƯ kiểu gen nhiễm đơn, nhiễm phối hợp theo locus Pvcs 91 Bảng 3.17 Tần suất c¸c alen cđa P vivax theo locus Pvmsp1 95 B¶ng 3.18 Kết phân tích đột biến gen dhfr P falciparum 98 B¶ng 3.19 Tû lƯ mÉu bệnh nhân nhạy, kháng với pyrimethamin 98 Bảng 3.20 Tỷ lệ P falciparum mang kiểu gen nhạy đột biến kháng pyrimethamin quần thể 99 B¶ng 3.21 Sè l-ợng đột biến điểm mức độ đáp ứng với pyrimethamin 100 Bảng 3.22 Kết phân tích đột biến gen dhps 102 Bảng 3.23 Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhạy, kháng với sulfadoxin 103 B¶ng 3.24 Tû lƯ P falciparum mang kiểu gen nhạy đột biến kháng với thuốc sulfadoxin qn thĨ 109 Bảng 3.25 Số l-ợng đột biến điểm mức độ đáp ứng với sulfadoxin 105 Bảng 3.26 Kết phân tích đột biến điểm 76 gen Pfcrt 106 B¶ng 3.27 Tû lƯ mÉu bƯnh nhân nhạy, kháng với thuốc chloroquin 107 Bảng 3.28 Tỷ lệ P falciparum mang kiểu gen nhạy, kiểu gen đột biến kháng với thuốc chloroquin quần thể 107 v Danh môc hình Hình 1.1 Chu trình phát triển ký sinh trïng sèt rÐt H×nh 1.2 Bản đồ quốc gia vùng lÃnh thổ có lan truyền sốt rét năm 2012 10 Hình 1.3 Bản đồ địa hình khu vực Bắc Tr-ờng Sơn 13 Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc locus msp1 P falciparum 19 Hình 1.5 Sơ đồ cấu tróc locus msp2 cđa P falciparum 20 Hình 1.6 Sơ đồ mô tả cấu trúc locus Pvcs cña P vivax 26 Hình 1.7 Sơ đồ mô tả cấu trúc locus Pvmsp1 cđa P vivax 26 H×nh 1.8 Tác động pyrimethamin sulfadoxin lên enzym dihydrofolate reductase dihydropteroate synthase chu trình sinh tổng hợp axit folic 36 Hình 1.9 (A,B) Cơ chế tác động chloroquin lysosome KST 37 Hình 2.1 Sơ đồ kỹ thuật PCR lồng chẩn đoán, phân biệt loài KSTSR 49 Hình 2.2 Sơ đồ kỹ thuật PCR xác định kiểu gen P falciparum 51 Hình 3.1 ảnh in di sn phẩm PCR mẫu bệnh nh©n nhiễm đơn P falciparum P vivax 66 Hình 3.2 ảnh điện di sn phm PCR mu bnh nhân nhim phối hợp 2, loµi KSTSR 66 Hình 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn nhiễm phối hợp theo kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa PCR 67 Hình 3.4 Biểu đồ cấu loài KSTSR khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 68 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn phân bố kiểu gen theo locus msp1 .72 Hình 3.6 Biểu đồ tần suất xuất alen kiểu gen K1 74 Hình 3.7 ảnh điện di s¶n phÈm PCR mét sè mÉu nhiƠm kiĨu gen K1 74 Hình 3.8 Biểu đồ tần suất xuất cđa c¸c alen ë kiĨu gen MAD20 76 vi ... Văn Hạnh Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Chuyên ngành: Di truyền. .. (Rapid diagnostic test) 16 1.5.3 Kỹ thuật PCR chẩn đoán, phân biƯt loµi ký sinh trïng sèt rÐt 16 1.6 Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét 19 1.6.1 Đa hình di trun cđa P falciparum. .. loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ng-ời 1.2.1 Thành phần loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ng-ời 1.2.2 Chu kú ph¸t triĨn cđa ký sinh trïng sèt rÐt 1.3 Muỗi truyền bệnh sốt rét