Nghiên cứu sự đa hình di truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống saphia trắng

Ngày nay, chọn giống đột biến bằng phương pháp chiếu xạ là một ứng dụng của kỹ thuật hạt nhân trong nông nghiệp, đã được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo nâng cao chất lượng các giống

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hoa cúc (chrysanthemum sp) là loại hoa cắt cành phổ biến được trồng

rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Hà Lan.v.v… Ở Việt Nam cây hoa cúc cũng được trồng lâu và được coi là một trong những cây “tứ quý” (Tùng, Trúc, Cúc, Mai) tượng trưng cho bốn mùa Hoa cúc là một loại hoa đa dạng về màu sắc, hình dáng và kích thước Màu hoa có từ trắng, vàng, hồng, cam, tím, đỏ.v.v… Dáng hoa được phân chia làm 13 loại từ hình cầu, hình nhện, hình Rosette Ngoài những ưu điểm về màu sắc và kiểu dáng, hoa cúc còn có một đặc điểm nữa là dễ trồng, hoa lâu tàn, và sử dụng được ở cả hai dạng hoặc cắt cành hoặc hoa chậu nên hoa cúc rất được ưa chuộng

Hoa cúc không chỉ có giá trị về trang trí, làm đẹp cho cuộc sống mà nó còn có giá trị trong y dược Ở Trung Quốc một loại cúc nổi tiếng có tên gọi là Hangbai với hoa nhỏ như đồng xu, màu trắng ngà được sử dụng như một dược phẩm và theo ngành y học cổ truyền thì tắm với nước hoa cúc Hangbai

sẽ chữa được bệnh dị ứng da, uống trà hoa cúc thường xuyên làm giảm bệnh nhức đầu và làm mắt sáng hơn

Ở Việt Nam hoa cúc cũng được trồng từ lâu đời và rất được coi trọng Hoa cúc xuất hiện ở khắp các nơi như vườn hoa, công viên, trong phòng khách, bàn làm việc, trong các cuộc thăm viếng Không những thế hoa cúc còn đem lại những lợi nhuận kinh tế đáng kể cho người nông dân Việt Nam

có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi có thể trồng được rất nhiều loại hoa và cây cảnh Hiện nay diện tích trồng hoa cây cảnh của nước ta trên 15.000 ha và diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa cây cảnh trên cả nước Nhiều chủng loại hoa cúc đã được trồng phổ biến khắp nước ta, vùng sản xuất chính là Hà Nội, Hải Phòng, Sa Pa, thành phố Hồ Chí

Minh và Lâm Đồng, trong đó Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc trồng và nhân giống của hầu hết các loại cúc Vùng hoa công nghệ cao Đà Lạt, hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa chủ đạo, hoa cúc có 40 loại khác nhau, chia thành ba nhóm lớn là cúc đại đoá, cúc giống nhỏ và cúc tia có muỗng

Tuy nhiên, việc sản xuất hoa cúc ở Việt Nam còn gặp rất nhiều hạn chế

về diện tích canh tác cũng như năng suất và chất lượng hoa Các giống hoa cúc có giá trị thương mại ở Việt Nam chủ yếu là các giống được nhập nội, rất

đa dạng phong phú về chủng loại và màu sắc Bên cạnh đó các giống hoa do được trồng tràn lan, theo kinh nghiệm của nông dân mà không có tác động của chọn lọc và phục hồi giống dẫn đến năng suất chất lượng hoa chưa cao Đặc biệt, là việc nhân giống và chọn tạo giống do nông dân tự làm là chủ yếu nên dẫn đến các giống hoa dần bị thoái hoá, chất lượng cây giống thấp và dễ

bị sâu bệnh Hơn nữa, việc đa dạng hóa màu sắc và kiểu dáng hoa luôn là nhu cầu của các nhà chọn giống

Ngày nay, chọn giống đột biến bằng phương pháp chiếu xạ là một ứng dụng của kỹ thuật hạt nhân trong nông nghiệp, đã được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo nâng cao chất lượng các giống cây trồng và phát triển các giống cây mới với các đặc điểm sinh học được cải tiến Bằng phương pháp chiếu xạ bởi các tia proton, ion beam.v.v… kết hợp với kỹ thuật nhân giống

in vitro đã tạo ra các giống cây trồng mới trong thời gian ngắn và hiệu quả

hơn so với các phương pháp chọn tạo giống truyền thống Chọn giống đột biến đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến các giống hoa cây cảnh nói chungvà hoa cúc nói riêng Nhận dạng và xác định đặc tính các giống cây trồng rất quan trọng đối với các nhà vườn để bảo hộ bản quyền cho các nhà chọn giống thực vật Trước đây, các giống cây mới được xác định dựa trên các đặc tính nông sinh học Gần đây các kỹ thuật sinh học phân tử phát triển

giúp cho việc đánh giá đa dạng di truyền của các giống cây trồng được dễ dàng thuận lợi, chính xác hơn

Vì lý do thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“ Nghiên cứu sự đa hình di truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng

phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống Saphia trắng”

2 Mục đích nghiên cứu của đề tài

Đánh giá đa hình di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các dòng cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống saphia trắng

3 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái của các dòng cúc sau khi chiếu xạ: mô tả, đánh giá, phân tích đa dạng di truyền về các đặc điểm hình thái như thân, lá, hoa, thời gian sinh trưởng và ra hoa.v.v…

- Chọn lọc các thể đột biến ưu tú, nhân dòng đột biến, đánh giá sự ổn định di truyền của các dòng hoa cúc vi nhân giống tạo ra ngay sau khi chiếu

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Hiểu biết về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các dòng hoa cúc đột biến được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến là cơ sở để tuyển chọn những dòng/giống ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới

- Các marker nhận biết chính xác một số dòng/giống có triển vọng sử dụng để xác định đúng giống phục vụ công tác nhân giống, kiểm soát cây con giống ở giai đoạn sớm Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc xây dựng quy trình chọn tạo giống mới bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cúc

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại và đặc điểm của cây hoa cúc

Nguồn gốc: hoa cúc có xuất xứ từ Trung Quốc, khoảng 500 năm trước

CN Khổng Tử đã đề cập đến việc trồng hoa cúc Ở Nhật Bản đến thế kỷ VIII mới thấy xuất hiện hoa cúc Đến thế kỷ XVII hoa cúc mới được du nhập vào châu

Âu và cho đến nay hoa cúc đã được trồng rộng rãi trên khắp thế giới Ở Việt Nam hoa cúc cũng đã được trồng từ lâu, các giống hoa cúc hiện nay được trồng ở Việt Nam thường có xuất xứ từ Trung Quốc, Nhật Bản và châu Âu

Cây hoa cúc có tên khoa học là: Chrysanthemum do nhà thực vật học người Thụy Điển Carl Linnes đặt tên vào năm 1973 Chrysanthemum bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp: Chrysos có nghĩa là vàng (gold) và Anthemom có nghĩa

là bông hoa Theo hệ thống phân loại thực vật cây hoa cúc hai lá mầm

(Dicotyledoneae), phân lớp hoa cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae), phân họ hoa cúc (Asteroidae) và chi hoa cúc (Chrysanthemum)

(Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1988 [3] Theo Nguyễn Quang Thạch và Đặng Văn Đông (2002) [5] đã dựa vào các cách sau để phân loại hoa cúc ở Việt Nam:

Dựa vào hình dạng hoa để phân biệt cúc đơn hay cúc kép

Cúc đơn: thường là dạng hoa nhỏ đường kính hoa từ 2 - 5 cm, chỉ có

từ 1 - 3 hàng cánh ở vòng ngoài cùng còn vòng trong là cánh hoa rất nhỏ thường được gọi là cồi hoa

Cúc kép: hoa có đường kính từ 5 - 15 cm, có nhiều cánh xếp từng vòng sít nhau, có loại cánh dài cong, có loại cánh ngắn

Dựa vào hình thức nhân giống: dựa vào hình thức nhân giống vô tính như giâm cành, tỉa chồi hoặc nhân giống bằng phương pháp hữu tính như gieo hạt

Dựa vào thời vụ trồng: dựa vào đặc tính chịu nhiệt của hoa cúc để phân loại và thường phân ra làm hai loại đó là cúc đông và cúc hè Cúc đông là cây

có nguồn gốc ôn đới, có tính chịu lạnh và trồng chủ yếu vào mùa đông Cúc

hè là giống chịu nhiệt độ cao trồng được vào mùa hè

Cây hoa cúc thuộc dạng thân thảo, nhỏ, có nhiều đốt, giòn, có khảnăng phân cành mạnh, cây dạng đứng hoặc dạng bò Kích thước cây thân cao hay thấp, đốt dài hay ngắn còn tuỳ thuộc vào giống Cây có thể cao từ 30 – 80

cm thậm chí có thể cao đến 2 m Rễ của cây hoa cúc thuộc loại rễ chùm, rễ ít ăn sâu mà phát triển theo chiều ngang Lá của cây hoa cúc có dạng xẻ thuỳ, có răng cưa, lá đơn mọc so le nhau, mặt dưới lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn và có gân hình mạng lưới Phiến lá to hay nhỏ, dày, mỏng, xanh đậm hay nhạt, là tuỳ thuộc vào từng giống khác nhau Hoa cúc thuộc loại hoa lưỡng tính hoặc đơn tính có nhiều màu sắc khác nhau, đường kính hoa khoảng từ 1,5 - 25 cm Hình dạng cánh hoa ngắn hay dài, cong hay thẳng, hoa đơn hay kép là do các giống Hoa cúc có 4 đến 5 nhị đực dính vào nhau bao quanh vòi nhụy mảnh hình chỉ chẻ đôi

1.2 Giá trị sử dụng của cây hoa cúc

Hoa cúc là một trong những loài hoa cắt cành phổ biến nhất và được thương mại hoá nhiều thứ hai trên thị trường hoa thế giới chỉ sau hoa hồng (Sudhir Kumar & cs., 2006) [11] Hoa cúc là một loại hoa đa dạng về màu sắc, hình dáng và kích thước Màu hoa có từ trắng, vàng, hồng, cam, tím, đỏ.v.v… Cỡ hoa có loại nhỏ khoảng từ 1 cm cho đến loại lớn có kích thước lên tới 25 cm, đặc biệt giống hoa cúc Pennine Ace có dạng cánh dài hình muỗng

có màu hồng pha trắng rất đẹp

Hiện nay hoa cúc rất được phổ biến tại Mỹ và được xem như là

“Nữ Hoàng” của các loài hoa mùa thu, người ta thường tặng hoa cúc cho nhau trong những cuộc thăm viếng

Ở Trung Quốc hoa cúc cũng có một vai trò quan trọng, điển hình là các hình ảnh về hoa cúc có rất nhiều trong các bức tranh tứ quý hoặc trên các bình, chậu gốm sứ có từ thời xưa Giống cúc Chu - Hsien đã được đặt tên cho một thành phố Ở Việt Nam hoa cúc cũng được trồng từ lâu đời và rất được coi trọng Không những thế hoa cúc còn đem lại những lợi nhuận kinh tế đáng kể cho người nông dân Kim ngạch xuất khẩu hoa cúc quý 3 năm 2008 của Việt Nam đã đạt hơn 1.400 nghìn USD [13]

1.3 Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới

Hoa cúc là một trong những loài hoa hàng năm phổ biến nhất trên thế giới, do đặc điểm của hoa cúc có thể điều khiển được sự ra hoa của cây nên người ta có thể tạo ra nguồn sản phẩm liên tục và ổn định quanh năm Chính vì thế mà ở Bắc Mĩ, Tây Âu và Nhật Bản hoa cúc đang đứng ở vị trí thương mại thứ hai sau cây hoa hồng Quốc gia xuất khẩu hoa cúc dẫn đầu là Hà Lan, phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nước trên thế giới với diện tích trồng hoacúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Ở châu Á, Nhật Bản cũng đang là nước dẫn đầu về xuất khẩu hoa cúc, mỗi năm Nhật Bản sản xuất được khoảng 200 triệu cành phục vụ cho tiêu dùng nội địa và xuất khẩu Ở Trung Quốc, theo hiệp hội sản xuất hoa sản lượng hoa cúc năm 2007 đạt hơn 35 triệu bông Diện tích trồng hoa cúc phát triển ở Quảng Đông, Thượng Hải và Bắc Kinh bao gồm các giống ra hoa vào mùa hè, mùa thu, đông sớm và xuân muộn, màu được ưa chuộng nhất là màu vàng, kế đến là màu trắng, đỏ

1.3.2 Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam

Việt Nam có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi có thể trồng được rất nhiều loại hoa và cây cảnh Hiện nay diện tích trồng hoa cây cảnh của nước ta trên 15.000 ha và diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích

trồng hoa cây cảnh trên cả nước Nhiều chủng loại hoa cúc đã được trồng phổ biến khắp nước ta, vùng sản xuất chính là Hà Nội, Hải Phòng, Sa Pa, thành phố Hồ Chí Minh và Lâm Đồng, trong đó Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc trồng và nhân giống của hầu hết các loại cúc Vùng hoa công nghệ cao Đà Lạt, hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa chủ đạo, hoa cúc có 40 loại khác nhau, chia thành ba nhóm lớn là cúc đại đoá, cúc giống nhỏ và cúc tia có muỗng

Thành phố Hồ Chí Minh là thị trường tiêu thụ hoa lớn ở Việt Nam, tuy nhiên các vùng chuyên canh hoa ở thành phố như quận Gò Vấp, Thủ Đức, Củ Chi.v.v… chỉ cung cấp được một phần nhỏ Hiện nay thành phố vẫn phải nhập một số lượng lớn hoa cắt trong đó có hoa cúc từ Hà nội, Hà Lan, Đài Loan và Singapo

Theo đánh giá của các chuyên gia ngành hoa của Nhật Bản và Tây Âu thì Việt Nam hiện đang có cơ cấu hoa phù hợp với thị hiếu của các thị trường hoa cao cấp trên thế giới Tuy nhiên để đáp ứng được yêu cầu về chất lượng mẫu

mã và an toàn thực vật cao của thị trường này các nhà sản xuất hoa của Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư và phát triển một cách thích hợp đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống và nhân giống cũng như là các biện pháp canh tác, công nghệ đóng gói bảo quản để nâng cao năng suất và chất lượng hoa

1.4 Khái quát về các nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng

1.4.1 Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn giống cây trồng

Chọn tạo giống cây trồng là một ngành khoa học cải tiến di truyền của thực vật vì lợi ích của loài người (Poehlman & Sleper, 1995) [10] Để tạo ra nguồn biến dị mới với các tính trạng mong muốn các nhà chọn tạo giống phải

áp dụng nhiều biện pháp khác nhau như chọn lọc, lai giống, tạo đột biến, gây

đa bội thể và gần đây nhất là áp dụng công nghệ sinh học trong chọn giống

Chọn lọc là phương pháp cơ bản của chọn giống Tuy nhiên, phương pháp chọn lọc chỉ đưa lại kết quả khi quần thể ban đầu đa dạng về kiểu gen Kết quả của các phương pháp chọn lọc chỉ là thừa hưởng những kho tàng biến dị có sẵn trong tự nhiên chứ không phải là tạo ra được những biến dị mới

Bằng các biện pháp lai tạo và gây đa bội thể thực nghiệm người ta đã làm phong phú thêm nguồn biến dị trong tự nhiên Một hiệu ứng đặc biệt nhận được trong lai giống là ưu thế lai biểu hiện ở thế hệ F1 Tuy nhiên ở cây trồng

do đặc điểm cấu trúc hoa và hệ thống sinh sản của chúng gây cản trở cho việc

áp dụng tạo giống ưu thế lai (bất hợp lai, F1 không có khả năng sống, F1 bất dục, sự suy nhược của con lai) Bằng các phương pháp này ta cũng chỉ mới sử dụng một số ít gen trong hệ thống gen của một cơ thể thực vật quá trình chọn lọc

và lai tạo cũng phải trải qua một khoảng thời gian khá dài

Đột biến là cơ sở của tiến hoá hình thành nên các giống cây trồng vật nuôi mới Đột biến là một con đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng sự biến dị trong cơ thể sinh vật, nó là sự biến đổi bất thường về vật chất di truyền dẫn đến sự biến đổi một hoặc nhiều tính trạng và có thể được di truyền cho thế

hệ sau Đột biến gồm hai loại đột biến tự phát và đột biến nhân tạo

- Đột biến tự phát là dạng đột biến xảy ra một cách ngẫu nhiên trong

tự nhiên do những biến đổi thời tiết, khí hậu do những thay đổi về yếu tố địa lý Trong tự nhiên những biến đổi đột ngột do những biến động thời tiết khí hậu, địa lý làm cho sinh vật mới thích nghi hơn với điều kiện sống qua quá trình tiến hoá hàng trăm, thậm trí hàng nghìn năm những giống cây trồng, vật nuôi mới này hình thành những đặc tính khác biệt so với giống cũ Đột biến

tự phát xảy ra trong tự nhiện có tần số rất thấp thường 10-9 nghĩa là khoảng 10 triệu cá thể mới xuất hiện một cá thể bị đột biến và không phải đột biến nào cũng có ý nghĩa cho con người

- Đột biến nhân tạo: là đột biến xảy ra do các tác nhân (vật lý hoặc hoá

học) gây đột biến được thực hiện bởi con người vì mục đích chọn giống Nhờ việc sử dụng của các tác nhân gây đột biến người ta có thể tạo được các giống mới trong một khoảng thời gian ngắn và trong một phạm vi thí nghiệm hẹp Gây đột biến là một phương pháp để bổ sung nguồn gen trong chọn giống cây trồng

1.4.2 Cơ sở di truyền của đột biến

- Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ lúc nào và ở bất kỳ tế bào nào Các tác động lên kiểu hình có thể là những biến đổi nhỏ nhất mà chỉ có thể phát hiện bằng các phương pháp phân tích phân tử đến những biến đổi lớn dẫn đến thay đổi những quá trình cơ bản của tế bào dẫn đến có thể làm chết tế bào hoặc cả cơ thể

Đột biến có thể phân chia theo nhiều cách khác nhau Ở các sinh vật đa bào, sự phân biệt quan trọng dựa trên các dạng tế bào đầu tiên xảy ra đột biến Những đột biến xuất hiện ở các tế bào hình thành giao tử được gọi là đột biến gen nhân (germ - line mutations) Những đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng được gọi là đột biến tế bào sinh dưỡng (somatic mutations) hay còn gọi là đột biến soma Đột biến soma có thể tạo ra một sinh vật vừa có các mô tế bào đột biến vừa có các mô bình thường Hiện tượng này còn được gọi là đột biến khảm Đột biến tế bào sinh dưỡng có thể không được di truyền cho thế hệ sau Đối với cây nhân giống vô tính thì tuỳ vào vị trí và phần trăm của mô sinh dưỡng người ta có thể phân lập được hai hoặc ba loại đột biến khác nhau Ở các loài thực vật bậc cao các đột biến soma có thể được nhân giống vô tính do đó vẫn có thể giữ lại được các đột biến này [7]

Dựa vào sự thay đổi cấu trúc di truyền đột biến được phân thành hai loại

đó là đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen Đột biến nhiễm sắc thể (NST) là

sự biến đổi về cấu trúc hoặc số lượng nhiễm sắc thể Đột biến có thể xảy ra ở một cặp NST nào đó hoặc ở toàn bộ các cặp NST Loại đột biến này phát sinh

có thể là do các tác nhân của ngoại cảnh (do chất phóng xạ, hoá chất, sự biến

đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối loạn của quá trình trao đổi chất của nội bào dẫn đến sự phân ly không bình thường của các cặp NST

Đột biến gen là những biến đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử ADN Sự biến đổi về cấu trúc phân tử của gen có thể dẫn tới biến đổi cấu trúc của một loại protein do gen đó

mã hoá và cuối cùng dẫn đến biến đổi ở kiểu hình Ngoài những đột biến gen xảy ra trên ADN của NST còn xảy ra đột biến ADN của các bào quan như ty thể, lạp thể có thể gây ra những biến dị di truyền theo dòng mẹ

1.4.3 Các tác nhân gây đột biến

Trong tự nhiên đột biến luôn xảy ra nhưng lại xảy ra với tần số thấp, chỉ ở mức 1/10.000.000 đến 1/10.000 Do vậy, việc tạo đột biến nhân tạo tỏ

ra có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống Các tác nhân được sử dụng trong tạo đột biến nhân tạo: tác nhân vật lý (phóng xạ ion hóa, phóng xạ không ion hóa), sốc nhiệt, tác nhân hóa học Tác nhân vật

lý hoặc hóa học tác động vào tế bào làm biến đổi cấu trúc hoặc ion hóa phân

tử ADN hoặc protein, chất vô cơ, nước làm thay đổi phản ứng sinh lý, hóa sinh trong tế bào, thay đổi cấu trúc và thành phần hóa học của ADN gây đột biến gen và hệ quả của nó có thể là sai khác kiểu hình

+ Tác nhân hóa học:

Số lượng các chất hóa học gây đột biến là rất nhiều và số lượng các chất như vậy được phát hiện ngày càng nhiều Tuy nhiên, trong thực tiễn, công tác chọn tạo giống đột biến ở cây trồng chỉ một số ít được sử dụng và tỏ

ra hữu ích, hầu hết trong số đó thuộc về nhóm alkyl hóa, như là: ethyl methane sulhonate (EMS), diethyl sulfate (DES).v.v…

Nhóm chất oxy hóa khử như: HNO3, H2O2, aldehyde và một số muối kim loại nặng xâm nhập vào làm thay đổi nhóm NH2 trong nucleotide, trong protein và tế bào

Nhóm chất kháng sinh (antibiotics) như là azaserine, mitomycin C, streptonigrin và actinomycin D đã được nhận thấy là có tính chất làm đứt gẫy nhiễm sắc thể, nhưng tính hữu dụng của chúng bị hạn chế

Do có những loại hoá chất chỉ phản ứng với một loại nucleotide xác định, người ta hy vọng có thể gây đột biến theo ý muốn Tùy vào đối tượng nghiên cứu và mục tiêu mong muốn, có nhiều phương thức xử lý hóa chất để làm phát sinh các thể đột biến Người ta tạo ra các đột biến và các thể đa bội bằng cách ngâm các vật liệu ban đầu như hạt khô hay hạt nảy mầm Trong một thời gian nhất định trong dung dịch hoá chất với nồng độ thích hợp hoặc tiêm dung dịch vào bầu nhụy, quấn bông tẩm dung dịch hoá chất vào đỉnh sinh trưởng

+ Tác nhân vật lý:

Các tác nhân vật lý có thể tác động làm thay đổi cấu trúc ADN, nhiễm sắc thể một cách hiệu quả so với các nhân tố hóa học là điều đã được chứng minh thông qua lịch sử chọn tạo giống đột biến Các tác nhân vật lý ấy bao

gồm:

Gây sốc nhiệt: sự tăng hoặc giảm nhiệt độ môi trường một cách đột ngột có khả năng gây đột biến là vì nó làm cho tế bào không khởi động kịp các cơ chế đáp ứng, gây chấn thương trong bộ máy di truyền hoặc làm tổn thương thoi vô sắc, gây rối loạn sự phân bào Sốc nhiệt thường gây đột biến

số lượng nhiễm sắc thể

Tác nhân gây đột biến vật lý là những dạng tia phóng xạ Có rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn gống lựa chọn Bên cạnh tia cực tím một số các tia phóng xạ ion hoá như tia X, tia gamma, hạt alpha, beta, hạt proton, neutron, ion beam có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế

bào Những tổn thương sinh học do phóng xạ gây ra được hình thành qua hai con đường:

- Phóng xạ tác động trực tiếp xảy ra ở phân tử ADN và gây ra đột biến gen

- Phóng xạ tác động gián tiếp, nó được các các phân tử khác trong tế bào hấp thụ, sau đó các năng lượng này hoặc các sản phẩm của nó được truyền vào ADN dẫn đến biến đổi về cấu trúc ADN

1.5 Các phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền trên đối tượng cây hoa cúc

1.5.1 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái

Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền thống được nhà phân loại học đầu tiên là Larmark sử dụng Phương pháp này bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể là:

- Đặc điểm của hoa: màu sắc, số lượng hoa trên bông, số lượng bông trên thân, cách sắp xếp của cánh hoa, kích thước, mùi hương của hoa, thời gian ra hoa, thời gian hoa tồn tại

- Đặc điểm của lá: màu sắc, số lượng của lá trung bình của một cây, chiều dài và chiều rộng của lá, hình dáng của lá, cấu tạo lá

- Đặc điểm của bộ rễ: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài và đường kính)

- Đặc điểm của thân: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài và đường kính)

1.5.2 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử

Bên cạnh phương pháp sử dụng hình thái để phân tích đa dạng di truyền, ngày nay sinh học phân tử đã cung cấp các công cụ hỗ trợ đắc lực là các kỹ thuật phân tử như: PCR - RAPD, SSR Trong đó, kỹ thuật RAPD được sử dụng phổ biến khắp thế giới và cả ở Việt Nam

Kỹ thuật RAPD do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991

* Nguyên lý

Sử dụng một số mồi ngẫu nhiên nhất định (thường sử dụng từ 10 - 40 mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN của các mẫu nghiên cứu Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn thì sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR nhân được các đoạn khác biệt nhau Mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligonucleotid gồm khoảng 10 nucleotid [8]

* Các bước thực hiện

- Tách chiết và tinh sạch ADN bộ gen của các mẫu nghiên cứu, và thực hiện phản ứng PCR nhân các đoạn ADN với các mồi đã lựa chọn (trong cùng điều kiện giống nhau)

- Xác định hệ số đồng dạng di truyền hoặc mức độ khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu bằng các phần mềm phân tích sinh học thông dụng hoặc tính theo các biểu thức khác nhau bởi các nghiên cứu của các nhà khoa học Có thể tính hệ số đồng dạng di truyền theo biểu thức của Nei & Li (1979):

2Nij Sij=

Ni+Nj

Trong đó: Ni là số băng của giống i

Nj là số băng của giống j

Ni + Nj : Tổng số băng xuất hiện

Ưu điểm của kỹ thuật RAPD là thực hiện nhanh, dễ làm, ít tốn kém Cho nên kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng phổ biến trong việc nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các giống tương đối gần nhau về mặt di truyền RAPD được ứng dụng cho nhiều nghiên cứu về hệ gen thực vật như được

dùng để định vị các gen kháng bệnh và kháng côn trùng, phối hợp với kỹ

thuật RFLP lập bảng đồ gen lúa, định vị gen kháng bệnh ruồi gall midge trên

nhiễm sắc thể số 4 ở lúa RAPD còn được dùng phổ biến để nghiên cứu tính

đa dạng di truyền ở các loại thực vật

Tuy nhiên, chỉ thị RADP có một số hạn chế đó là các phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ và chất lượng của ADN khuôn, nồng độ của MgCl2, tỉ lệ giữa mồi và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp, nguồn enzyme taq polymerase Tuy nhiên những hạn chế này có thể được khắc phục bởi việc tối ưu hoá các thông

số đã nêu trên Một hạn chế khác của chỉ thị RAPD đó là RADP có tính trội do

đó những gen nào điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong quá trình điện di

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng: Đối tượng nghiên cứu là các mẫu cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến nguồn tia gamma, tia proton, tia X, từ giống Saphia trắng

Chủng giống Saphia trắng mang các đặc điểm:

+ Có chiều cao trung bình 105 – 120 cm

+ Cây mang khoảng 7 - 11 cụm hoa có kích thước khi nở khoảng 6 – 8

cm

+ Thời gian ra hoa sau khi trồng: 85 – 100 ngày sau khi trồng, phụ thuộc vào điều kiện chiếu sáng, cây có thể trồng quanh năm để lấy hoa

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

+ Vật liệu: cây con được tái sinh in vitro từ hạt nhân tạo qua chiếu xạ

tia Gamma, X và Proton beam Từ 1 mẫu cây giống ban đầu, thông qua quá

trình nhân giống in vitro để tạo các cây con trong ống nghiệm Một phần các

cây này (100 cây con) đã được bố trí trồng khảo sát trên đồng ruộng, kết quả

là không có thể đột biến nào về kiểu hình được ghi nhận trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng Phần còn lại (1.000 cây con) được tách lấy phần đỉnh sinh

trưởng làm “phôi” hạt nhân tạo theo phương pháp tạo hạt nhân tạo Vật liệu không qua chiếu xạ làm đối chứng là 200 hạt

Các vật liệu qua chiếu xạ nêu trên được cho nảy mầm, tái sinh cây và

nhân giống trở lại trong điều kiện in vitro để có được cây con từ hạt nhân tạo

qua chiếu xạ còn sống Tỷ lệ sống của cây tái sinh từ hạt nhân tạo qua chiếu

xạ nhìn chung giảm tuyến tính theo liều chiếu và tương đương với kết quả thí

nghiệm về xác định LD50 (kết quả không được trình bày trong khóa luận) Số lượng cây tạo ra được sử dụng làm vật liệu cho trồng thử nghiệm đồng ruộng

và sàng lọc đột biến là 100 cây con/liều chiếu/loại bức xạ cùng với 100 cây đối chứng

2.1.3.2 Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết:

Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết: các hoá chất tách chiết ADN,

hoá chất làm PCR, hoá chất chạy gel agarose

* Hoá chất tách chiết ADN:

- Nước cất hai lần, đã khử ion

* Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR - RAPD

- Đệm PCR 1X (Buffer) của hãng Quiagen hoặc Invitrogen

- MgCl2 của hãng Fermentas

- dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP hoặc dUTP) của hãng Sigma

- Taq polymerase của hãng Fermentas

- Nước khử ion, 20 mồi RAPD của hãng Bioneer (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Tên và trình tự nucleotid của 20 mồi RAPD sử dụng trong nghiên

cứu

ST

T

Tên mồi Trình tự nucleotid STT Tên mồi Trình tự nucleotid

2 OPA18 AGGTGACCGT 12 OPN10 ACAACTGGGG

* Hoá chất chạy điện di:

Điện di gel agarose gồm các hoá chất: TAE 1X hoặc TBE 1X, chất nhuộm Bromophenol blue (hoặc Xylene cyanol hoặc hỗn hợp cả 2 chất này), Ethidium bromide, agarose

* Các thiết bị:

- Máy PCR của hãng Eppendorf

- Bộ chụp ảnh gel High Perfor mance (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf 58 10 - R và 2K15, Sigma)

- Máy điện di BIO - RAD GT (Anh)

- Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker)

- Nồi hấp thanh trùng (05 MB1 - 160T - 3 - Nga)

- Cân điện tử Sartorious (Đức)

- Tủ sấy (Memmert)

- Lò vi sóng

- Micropipet, ống Eppendorf, bình tam giác.v.v

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm, ruộng thí nghiệm của Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp

2.1.5 Thời gian nghiên cứu

- Tháng 06/2010 nhận đề tài;

- Tháng 06/2010 - tháng 04/2011 viết đề cương và thực hiện đề tài;

- Tháng 05/2011 viết luận văn và báo cáo đề tài

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp mô tả hình thái

- Nhận dạng, mô tả tại chỗ những đặc điểm nổi bật; giám định, xác định tên các giống, loài theo phương pháp so sánh hình thái vào các tài liệu tham khảo và kế thừa các nghiên cứu có trước

- Xác định nguồn gốc và đánh dấu phân biệt nguồn gốc của từng mẫu giống từ đó tiến hành mẫu giống quan sát, mô tả đánh giá đặc điểm hình thái, chụp ảnh mẫu theo kí hiệu riêng của từng mẫu Phương pháp mô tả hình thái (theo phương pháp mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái của Pellegrino và cs , 2005): sử dụng kính hiển vi chuyên dụng hoặc mắt thường quan sát, từ đó mô

tả hình thái, màu sắc của lá, hoa, thân, dùng thước đo chiều dài, chiều rộng của lá, chiều cao cây, kích thước hoa, theo dõi thời điểm ra hoa và độ bền hoa của từng mẫu giống

2.2.2 Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR-RAPD

Sơ đồ tóm tắt:

2.2.2.1 Phương phỏp tỏch chiết ADN

Phương phỏp tỏch chiết ADN tổng số dựa theo phương phỏp của P Obara - Okeyo & Kako (1998) cú cải tiến Quy trỡnh tỏch chiết như sau:

- Nghiền 0,3g mẫu lỏ cỳc trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ thành dạng bột mịn, cho vào ống eppendoff 2ml

- Bổ sung 800ml đệm chiết CTAB cú nhiệt độ 60oC và 60ml dung dịch SDS 10% vào mẫu rồi cho vào mỏy vortex đảo đều

- Ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 65oC trong 30 phỳt, lấy ra để nguội

ở nhiệt độ phũng

Mẫu ADN tinh sạch

PCR-RAPD

Điện di tra sản phẩm RAPD

Phõn tớch số liệu RAPD

Tỏch chiết ADN Mẫu lỏ cỳc

Kết luận tớnh đa dạng di truyền ở mức độ phõn tử của 20 mẫu cỳc nghiờn cứu

- Bổ sung chloroform với tỉ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu sau đó đảo đều

- Ly tâm 11.500 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 15 phút Hút dịch nổi phía trên sang ống eppendoff mới, bỏ cặn

- Bổ sung 2µl RNase (nồng độ 10µg/ml) vào dung dịch thu được, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 1giờ

- Bổ sung 2 - propanol với tỉ lệ 1:1 về thể tích để thu tủa ADN Ly tâm 11.500 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 10 phút để thu tủa

- Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa kết tủa ADN bằng ethanol 70% rồi làm khô ADN ở nhiệt độ phòng

- Hoà tan ADN bằng đệm TE Kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN bằng cách điện di 5µl dung dịch ADN trên gel agarose 1% với thang nồng

độ ADN chuẩn là 25µg

2.2.2.2 Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Muốn khuếch đại một đoạn gen nào đó bằng kỹ thuật PCR cần phải thiết lập một phản ứng gồm: ADN khuôn, dNTPs đã được hoạt hoá, enzym Taq - polymerase chịu nhiệt, mồi Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR - RAPD Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR - RAPD bao gồm: ADN mẫu 25ng, dung dịch đệm PCR 1X, MgCl2 2mM, dNTP 10µM, Taq polymerase 1U, mồi RAPD 1µM và bổ sung H2O để tổng thể tích phản ứng là 15µl Chu trình nhiệt phản ứng PCR như sau:

Sau khi kết thúc, sản phẩm phản ứng PCR được bảo quản ở 40C cho đến khi tiến hành điện di

2.2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose:

- Điều kiện điện di: sản phẩm của các phản ứng RAPD được điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V, cường độ 3A trong thời gian 30 - 60 phút

Cách tiến hành:

- Cân 0,4 gam agarose cho vào bình tam giác

- Lấy 40 ml dung dịch TAE 1X cho vào bình tam giác trên

- Đun trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn

- Để nguội (khoảng 65oC), bổ sung 2,5 l EtBr

- Đặt lược vào khay, đổ gel vào để nguội đến khi gel đông lại thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5 - 1 cm

- Tra mẫu: mẫu nhuộm với Xanhmetylen (loading dye), tra vào giếng; Maker 1kb được tra vào giếng đầu hoặc giữa bản gel để có thể xác định kích thước các băng

Bước Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ

- Chạy điện di: sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn Đặt 100V - 3A Thời gian chạy khoảng 30 - 60 phút

- Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr

- Chụp ảnh gel

2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu

Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Microsoft Office Exel 2003 Các băng RAPD được ghi nhận sự có mặt hoặc vắng mặt của chúng trên gel agarose, các băng xuất hiện được chấm là 1

và các băng không xuất hiện được chấm là 0 Các số liệu này được xử lý theo chương trình Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System computer program vesion 2.01 (NTSYS – pc 2.01) (F.J Rohlf., 2000) để xác định hệ số tương đồng di truyền và xây dựng cây phân loại

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát, ghi nhận đặc điểm của giống gốc

Giống gốc Chrysanthemum morifolium Ramat thuộc chủng giống

White Artfarm không xử lý tia xạ được sử dụng làm nguồn mẫu đối chứng, sau thời gian trồng thử nghiệm trên đồng ruộng đã khảo sát và ghi nhận được các đặc điểm sau:

- Giống gốc có chiều cao thân cây trung bình 112,67 cm (trong đó: cây thấp nhất 108 cm, cây cao nhất 117 cm)

- Hoa tròn đều và có màu trắng, các cánh hoa xếp xen kẽ khoảng từ 3 đến 4 lớp, phần trung tâm hoa là những cánh nhỏ xếp sít nhau và có màu vàng xanh

- Thời gian ra hoa sau khi trồng cây con ra ruộng: 90,6 ngày, cây ra hoa muộn nhất 93 ngày, cây ra hoa sớm nhất: 88 ngày

- Số lượng hoa trung bình 8,33 hoa/cây, số lượng cụm hoa nhiều nhất trên một cây là 11 cụm, số lượng cụm hoa ít nhất trên một cây là 7 cụm

- Kích thước cụm hoa trung bình khi nở: 6,87 cm và dao động khá nhiều, trong đó cụm hoa bé nhất có kích thước 5,8 cm và cụm hoa lớn nhất

là 8,7 cm

- Thân cây có màu xanh

- Tỷ lệ sống của cây thuộc lô thí nghiệm là 99/100 cá thể

- Trong quá trình bố trí thí nghiệm không xuất hiện thể đột biến tự nhiên nào ở lô thí nghiệm đối chứng