Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng mẫu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty the, được lấy từ bệnh viện Nhi Trvng ươn[r]
(1)NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY CHUỐI TIÊU TRÊN CHUỘT ĐÁI THÁO ĐƯƠNG TYP THỰC NGHIỆM
Nguyễn Thị Đông (Thạc sĩ, trường Cao đẳng Dược TW H ải Dương) Vu Thị Minh Thu (Dược sỹ, trường Cao đẳng Dược TW H ài Dương) Phùng Thanh Hương (PGS.TS trườna Đại học Dược Hà Nộií ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) biết đến loại thực phẩm vị thuốc [1] Nhiều phận chuối tiêu nghiên cứu chứng minh tác dụng chữa bệnh [4], [7] Năm 2014 nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành nghiên cứu tác dụng dịch ép thân chuối tiêu chuột nhắt trắng tăng glucose máu streptozocin Kết cho thấy dịch ép toàn phần thân chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu mơ hình chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm dùng streptozocin liều 150mg/kg chế tác dụng dịch ép toàn phần thân chuối tiêu cỏ xu
hướng tương tự thuốc đối chứng dương
metformin Tuy nhiên, với mơ hình đái tháo đường gây streptozocin với liều 150mg/kg chi gây tượng tăng glucose máu thực nghiệm, chưa rõ loại đái tháo đường typ íyp Với tỷ ỉệ người mắc bệnh đái ỉháo đường týp 2 khoảng 80% tồng số bệnh nhân mắc bệnh đái ỉháo đường [5], Việc tìm cốc dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường typ cần thiết Xuất phát từ !ý đó, đề tài thực với mục tiêu:
Đành giá tác dụng dịch ép thân chuối tiêu trên mồ hình chuột cổng gây đái thảo đường typ thực nghiệm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN u
1 Đổi tữợng nghiên cứu
1.1 Nguyên liệu nghiên cứu
Thân chuối tiễu thu hái sau trồng 6 tháng, thời gian thu hái quanh năm xã Giang Sơn, huyện Gia Bình tình Bắc Ninh Mâu Trần Văn n - Trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa học Musa paradisiaca L họ Chuổi Musaceae
1.2 Động vật thí nghiệm
Chuột cong trắng, giống đực, chủng Wistar, khỏe mạnh, trọng lượng 80 ± 20g, khỏe mạnh, học viện Quân Y cung C ấ p Chuột chia lổ ngẫu nhiên 6-8
con/lô, nuôi điều kiện nhiệt độ 24±1oC, ánh sáng tự nhiên, nuôi thức ăn theo công thức nhat định, uống nước tự
1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
streptozocin (MP Biochemicals), G!ucose-6 -phosphat (Fiuka biochemie Gmbh 9471), Mảy đo glucose máu Accu-Check Active kít tương ứng (Roche), kit định lượng cholesterol tồn phần, trigỉycerid (Teco-Diagnostics), kit định lượng insuíin chuột cống Ultrasensitive Rat ELỈSẢ (Crystal Chem), metformin (Merch-Lipa Santa)
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Chiết xuất dược liệu
Thân chuối đứợc ép lấy nước, cất quay íoại
nước, sấy 400C áp xuất giảm, thu láy cắn toàn phần, hiệu xuất cắn thu 1,6% cắ n pha thành hỗn dịch dung dịch NaCMC 0,5% với tỷ lệ 50 mg cắn/mL đề thử tren chuột Mâu thử đứực gọi hỗn dịch thử Chuột uống Hỗn dịch với liều ĩỏml/kg chùột
2.2 Bố trí thí nghiệm
- Gây mơ hình đáỉ tháo đựờng (ĐTĐ) typ chuột cong trắng thí nghiệm kết hợp chế độ ăn giàu chất béo tiem streptozocin (STZ) liều tháp (50mg/kg chuột) theo phương pháp Srinivasan triển khai Việt Nam [2], Những chuột ĐTĐ typ có nồng độ glucose máu 11 mmol/L iựá chọn cho việc thử tác dụng cùa hỗn dịch thử
- Thí nghiệm đánh giá ảnh hường hỗn dịch thử chuột ĐTĐ typ thực nghiêm:
Bố trí thí nghiệm với lô chuột:
+ Lô 1: (n=8): chuột ĐTĐ typ thực nghiệm cho uống dùng môi pha hỗn dịch thử
+ Lô 2: (n—8): chuột ĐTĐ íỵp thực nghiệm cho uống hon dịch thừ với liều 500mg cắn/kg
+ Lô 3: (n=8): chuột ĐTĐ typ thực nghiệm cho uống cho uống metformin với liều 120mg/kg
+ Lô 4: (n=8): chuột binh thường cho uống dung môi pha hỗn dịch thử Trong thời gian thi nghiệm, chuột !ô 1,2, tiểp tục cho ăn thức ăn gỉau chấỉ béo (chứa 60% cãlo lipid), chuột lô cho ăn thức ăn tổng hợp Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, chuột íơ đếu cho uống nước tự Cho chuột uống mẫu thử tương ứng liên tục 15 ngày Sau 15 ngày, cho chuột nhịn đói
10 giờ, cân chuột, lẩy máu toàn phần từ tĩnh mạch đuôi chuột đề (Tinh lượng glucose máu, lấy máu íy tâm thu huyết để định lượng insulin, trigíycerid (TG) cholesterol tồn phần (TC) Sau mổ chuột lấy gan, xác định hoạt độ enzym G6Pase, lẫy tụy kiểm tra đại thể vi thể tụy tất ca lô chuột
2.3 Các phương pháp định lượng
Định iượng glucose máu phương pháp glucose oxidase (GOD) với máy đo glucose máu tự động que thư Accu-Check Active; Định lượng cholesterol toàn phần trigiycerid huyết phương pháp enzym với kit Teco-Diagnostỉcs; Định lượng insulin huyết phương pháp Sandwich Elisa với kit Ultrasensitive Rat ELISA (Crystal Chem)
Xác định hoạt độ G6Pase gan chuột theo phương pháp mơ tả lha Pari [6]
2.4 X ét nghiệm mô bệnh học
Bệnh phẩm tươi có bế dày mm bào quản formol sau cố định dung dịch Bouin, chuyển đúc parafirt, tiếp tục cắt thành
(2)những tiêu có bề dày [im nhuộm theo phương pháp hematoxylin-eosin (HE) thường quy Nhân tế bào bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng Các tiêu đọc kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần để đánh giá tổn thương với phương pháp mù đơn (người đọc ký hiệu iô chuột thực nghiệm) Kỹ thuạt vi ỉhắ thực môn Giải phẫu bệnh trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương
2.5 X lý số liệu
Dữ liệu lưu trữ, phân tích phần mềm SPSS 16.0 biểu diễn dạng giá trị trung bình ± sai sổ chuẩn (Xỉb ± SE) tỷ !ẹ % Sự khác biệt coi có ý nghĩa ỉhống kê khí p < 0,05
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ’
1 Tác dụng cùa hỗn dịch thử nồng độ glucose máu cua chuột ĐTĐ typ 2
Sự thay đổi nồng độ glucose máu lô chuộỉ sau 15 điều trị íhể bảng 1
Bảng Nồng độ glucose máu chuột cống ĐTĐ o ^ ^ , ì c — Â i , , , Ẳ „ S Ì U '
Lơ Mẫu thử Giucose máu (mmoI/L) Ngàv Ngày 16 Lô chứng âm
<n=8)
Dung môi pha hỗn
dịch íhử 18,95 + 1,98
18,75 ± 1,79 Lơ thử (rì—8) Hỗn dịch thư
(500mg/kg)
19,07 ±
2,01 14,02 ± 1,12a Lô chứng
dương <n—8) (Metformin120mg/kg) 19,18 ± 1,81
9,01 ± 1,03b Lơ chuột bình
thường (n=8)
Dung pha hồn
dịch thử 5,88 ± 0,71c
5,69 ± Ó,72c a: p<0,05 so với lồ chứng âm; b: p<0,01 so với íơ chứng âm; c: p<0,001 so với !ô chứng âm
Nhận xét: So với lô chuột bình thường, chuột đái tháo đường typ 2 có glucose máu cao rõ rệt (p <0,001) Lô chuột uống hỗn dịch thử có gỉucose máu giảm có ý nghĩa so với lô chứng âm (p<0,05), iô uống metformin có glucose nìáu giam rõ rệt (p<0,01)
2 Tác dụng hỗn dịch thừ tình trạng lipid máu chuột ĐTĐ typ 2
Ảnh hưởng hỗn dịch thử lipid máu chuộí ĐTĐ typ đánh giá thơng qua nồng độ triglycerid cholesterol toàn phần huyết the bảng 2
Bảng Nong độ triglyceriđ cholesterol toàn phần huyết chuọt ĐTĐ typ sau 15 ngày I m A i I J > U n i
Lơ Mẫu thử Lìpid máu Ímmoi/L) Cholesterol Triqlyrecid Lô chứng
âm 1 (n=8) Dung môi pha hỗn dịch thử 8,25 ± 0,74
10,09 ± 1,23 Lơ íhử (n=8} Hỗn dịch thứ
(500mq/kg) 5,0 ±0,46*
4,75 ± 0,51** Lô chứng
dương 3(n-8)
Metformin
(120mg/kg) 4,76 ± 0,5*
4,27 ± 0,37** Lơ chuột bình
thường (n=8)
Dung môi pha
hỗn dịch thử 3,27 ±0,31 1,28 ±0,24
so vởi bỉnh thường (p < 0,01) Sau 15 ngày điều trị, lô !ô có nồng độ cholesterol tồn phần giảm cách có ý nghĩa (p<0,05), nòng độ triglycerid giảm rõ rệt (p <0,01)7
3 Tác dụng hỗn dịch thừ nồng độ insulin huyết chuọt ĐTĐ typ 2
Để làm rõ chế tác dụng’ thân chuối tiêu điều trị ĐTĐ typ có phải thơng qua tiết insulin hay không? Tiến hành định lượng nồng độ insulin huyết ỉơ chuột thí nghiệm Kết quả thể bảng 3.
Bảng Nồng độ insulin huyết chuột
Lô Mẫu thử Nống độ insulin huvết (nq/ml) Lô chứng âm
(n=8)
Dung môi pha hổn
dịch thử 1,42 ±0,16 Lô thử (n-8) Hỗn dịch thư
(5Q0mq/kq) 1,35 ± 0,12 Lô chứng dương
3 (n-8) (Metformin120mg/kq) 1,38 ± 0,15 Lơ chuột bình
thường (n=8) Dung mơi pha hỗn dich thử 0.78 ± 0,02* (*): p < 0,05 so với lô
Nhận xét: Các lô chuột ĐTĐ typ có nồng độ insulin huyết cao chuột bình thừơng (p<0,05) Sau 15 ngày điều trị, nồng độ insulin huyết !ô iơ có giảm khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lơ 1
4 Tác dụng hỗn dịch thử ỉrên hoạt độ G6Pase gan chuột ĐTĐ tỳp 2
Việc đánh giá ảnh hưởng cua thân chuối tiêu hoạt độ G6Pase gan nhăm góp phần iàm sáng tỏ chế tác dụng cùa dược liệu Kết thề bảng
Bảng Hoạt độ enzym G6Pase gan chuột
Lô Mầu thử
Hoạt độ riêng enzym G6Pase (ỊjgPi/phút/mg
protein)
% Hoạt độ enzym
Mức độ ức chế so với
iô chứng
âm Lô 1:(Lô
chứng âm), n-8
Dung môi pha hỗn dịch thử
3,01 ±0,29
152,02%
Lô :(Lơ thử), rì=8
Hổn dịch thử (500mq/kq)
2,20 ± 0,19a 111,11% 40,92% Lô 3: (Lô
chứng dương),
n=8
Metformin (120mg/kg)
2,03 ± 0,37a
103% 49,02%
Lô 4: (Chuột
binh thường),
n=8
Dung môi pha hỗn
dịch thử 1,98 ± Q,21a 100%
(*): p < 0,01 so với lô 1; (**): p < 0,001 so với lổ 1
Nhận xét: Kết thể bảng cho thấy nồng độ lipid máu cac lô chuọt ĐTĐ typ tăng cao
a: p < 0,01 so với lố chứng âm
Nhận xét: Kết bảng cho thấy chuột ĐTĐ typ 2, hoạt độ G6Pase gan tăng 152,02% so với chuột binh thường Sau 15 ngày uổng mẫu thử, hoạt độ riêng G6Pase gan lô !ô (uống hỗn dịch thử
(3)và metformin) giảm có ỹ nghĩa so với ỉơ 1 (p<0,01)
5 Tác dụng hôn dịch thừ tình trạng mơ
tụ y chuột ĐTĐ typ
Đánh g iấ ả n h hương cùa mẫu thử đến tình trạng mơ íụy chuột, Tiến hành kiềm tra đại thể vi thể, kết thí ■ ' h 1
c d
Hình Hình ảnh vi học tụy chuột lô (a); lô (b); lô 3 (c) lô (dj (Nhuộm HE X 400 lân)
Nhận xét: Kết cho thầy ỉô chứng âm (lô 1), mật độ tiểu đảo tụy giảm, đảo tụy biến dạng giảm kích thước, tế bào tiểu đảo tụy teo lại, có dấu hiệu thối hóa hốc Trong đó, lơ iơ 3, mật độ tiểu đảo tụy ft so với bình thường, đảo tụy giảm kích thước so với iơ khơng có dáu hiệu tổn thương, thối hóa hốc
BÀN LUẬN
Mơ hình ĐTĐ typ áp dụng nghiên cứu thể rối loạn chuyền hóa tương íự nhứ đặc điểm bệnh học thường gặp bẹnh nhân ĐTĐ typ nồng độ glucose máu, triglycerid, cholesterol toàn phần nồng độ insulin huyễt tằng cao so với chuột bình thường, ăn chế độ ăn bình thường Do đó, mơ hình thực nghiệm ỉương Ổổi thích hợp dùng để đánh giá tác dụng tlm hiểu chề tác dụng thuốc điều trị ĐTĐ typ
[33-Trên chuột ĐTĐ typ thực nghiêm, hỗn dịch thử thể tác dụng giảm nồng độ glucose máu cách có ý nghĩa so với lô chứng âm (p<0,05) Tác dụng kèm với tác dụng làm giảm rõ rệí nồng độ cholesterol tồn phần (p<Ĩ,01) triglycerid huyet (p<0,001)
Có nhiều chế khác giải thích cho tác dụng làm giảm glucose máu lúc đói thuốc ĐTĐ typ Để tìm hiểu chế tác dụng cùa thân chuối tiêu, trước hết, đểnh giá ảnh hưởng hỗn dịch thử nong độ insulin huyết cùa íơ chuột thí nghiệm Kết cho thay, khơng có khác biệt nồng độ insulin huyết lồ chứng âm va lô uống hỗn dịch thử Kết tương tự thu từ iô chứng dương metformin Như vậy, giống metformin, tác dụng làm giảm
glucose máu thân chuối tiêu không thông qua chế kích thích giải phóng insulin tuyen tụyT Cơ chế tác dụng thân chuối tiêu làm giảm kháng insulin có khà điều hịa q trình chuyển hóa tương tự insulin Từ suy luận đó, để tiếp íục tìm hiểu chế tác dụng thân chuối tiêu chúno đánh giá ảnh hiPỞng r.na hỗn riịnh thủ’ hoạt độ G6Pase gan lô chuột thí nghiệm
G6Pase enzym xức tác cho phản ứng cuổi đường tân tạo đường, giai phóng glucose tự vào máu, G6Pase COI enzym chủ chốt, định tốc độ q trình tân tạo đường, gián tiếp ảnh hưởng đen nồng độ glucose huyết Nhiễu nghiên cửu chứng minh, bệnh nhân ĐTĐ động vật ĐTĐ thực nghiệm, suy giảm khả điểu hịa chuyển hóa cua insulin, hoạt độ G6Pase tăng cao, dẫn đến tăng tổng hợp glucose, tăng glucose máu Do vậy, ức che G6Pase chế iàm giảm glucose máu phát nhiều dược liệu đích tiềm ihiểt kế thuốc điều trị ĐTĐ Trong thí nghiệm chúng tơi, hoạt độ G6Pasẽ lô chuột ĐTĐ typ không điều trị tăng 152,02% so với chuột binh thường, 2 lô uổng hỗn dịch thử uổng metformin, hoạt độ G6Pase giảm cách cổ ý nghĩa với p < 0,01 sau đọt điều trị Metformin từ iâú đa chứng minh có tác dụng ửc chế tân tạo đường thông qua ức chế G6Pase Đâỵ lần có cồng bố tác dụng ức chế G6Pase thân chuoi tiêu Tuy nhiên, tác dụng ức chế cốc hoạt chất hỗn dịch thử trực tiếp tác động lên enzym G6Pase gián tiếp thông qua tac dụng iam tăng nhạy cảm mơ đích với insulin, hormon nội sinh có tác dụng ức chế tân tạo đường
Đề tiếp tục làm sáng tỏ chế tác dụng thân chuối tiểu, tiến hành đánh giá ảnh hường cùa hỗn dịch thừ tình trạng đại thể vi thể tụy Kểt hình cho íhấy lơ ĐTĐ typ không điều trị, xuất dấu hiệu rõ ràng suy giảm số lượng thối hóa tiểu đảo tụy Hiện tượng kèm với nòng độ insulin huyết tăng cao chứng tỏ tế bào beta tiều đảo tụy phải làm việc q mức để giải phóng íưựng lơn insulin nhằm đáp ứng với tình trạng glucose mau cao, dẫn đến xu hứớng suy kiệt tiếu đảo tụy 2 lô điều trị (iô iô 3), tiểu đảo tụy giảm số lượng, kích thước so với binh thương khơng cịn dấu hiệu tổn thương lơ Điều chứng tỏ có hồi phục định tế bào beta sau trị Việc so sánh với thuốc đối chứng metformin cho phép nhận định sơ tốc dụng hình ảnh vi học tiều đảo íụy chuột khơng phải tác động trực tiếp lên tiểu đảo tụy mẳ gián tiếp thông qua cải thiện tinh trạng khang insulin, làm giảm gánh nặng cho tụy, giúp tụy có kha íự phục hồi Tuy nhiên, để có kết luận xác, cần cỏ thêm thực nghiệm in vivo in vitro để chứng minh chế làm giảm kháng insulin cùa thân chùoi tiêu
(4)KẾT LUẬN
- Trên chuộí cống ĐTĐ typ thực nghiệm, thân chuối tiêu có tác dụng làm giam nồng độ glucose máu,
cholesterol toàn phần, ỉriglycerid huyết thanh, ức chế
hoạt độ G6Pase gan không làm thay đổl đáng kề nồng độ insulin huyết Lơ chuột điều trị hỗn dịch thử có dấu hiệu hồi phục tiểu đảo tụy
- Dự đoán chế tác dụng thân chuối tiêu là: ức chế tân tạo đường thơng qua ức chế G6Pase có thề làm tăng nhạy cảm mơ đích với insulin, cải thiện tinh trạng kháng insulin ĐTĐ typ
2
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt nam, Nhà xuất Y học, Tr.467,468
2 Nguyễn Thị Đông (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết địch chiết phân đoạn chloroform thâii Ý dĩ động vật thực nghiệm", Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Trung ỉâm thơng íin thư viện trường Đại học dược Hà Nội, Tr.20-40
3 Đỗ Thị Nậuyệt Quế (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyễt cua rễ cay choc mau Nam (salasia cochinchinensis L., Celasíraceae) thực nghiệm", Luận án ỉiến sĩ dược học, Trung tâm Thư viện Quốc gia, Viện Dược iiệu, tr.7, 28 -32
4 Enechi c Odo c E Agosi p o (2014), "Anti- oxidant vitamins, phytochemicals and proximate composition of the ethanol extract of the leaves of Musa paradisiaca", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 8(18), pp 464-468
5 IDF (2013), Diabes Aiias, International diabetes federation, pp 7-15, 27
6 Latha M Pari L (2003), "Antihyperglycemic effect of Cassia auricuiata in experimental diabetes and its effect on key metabolic enzymes invoved in cacrbohydraie metabolism", Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 30, pp 38-43
7 Virginia D, Kappei !, H Luisa (2013), "Beneficial effects of banana leaves (Musa xparadisiaca) on glucose homeostasis: multiple sites of action", Revista Brasileira de Farmacognosia, 23(4), pp 706-715
NGHIÊN c ứ u PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘJ CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẠT c VỚI SỢI c
KHÔNG ĐỀU - MERRF Ở NGỮỜI VIỆT NAM
Người ỉhực hiên: Bùi Thị Khánh Khoa Y học s - Trường Cao đắng Y tế Thái Bình Người hướng dẫn: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Phịng thí nghiệm trọng điểm Protein - Enzyme, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Ha Nội TÓM TÁT
Đặt vẩn đề: MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) hội chứng động kinh giật với sợi không đều, gây nên đột biến gen MT-TK DNA ty thề.
Mục tiêu: Sàng lọc phát đột biến MERRF bệnh nhân nghi mắc bệnh não ty thể Việt Nam, xây dựng phương pháp định lượng đột biến MERRF.
Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc đột biến thuộc hội chứng MERRF mẫu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân nghi mắc bệnh não ty the, lấy từ bệnh viện Nhi Trvng ương với phương pháp PCR- RFLP, real-time PCR giải trình tự đoạn gen nghi ngờ mang đột biến nghiên cứu.
Kết quả: Không phát trường hợp mang đột biến 312 bệnh nhân lấy mẫu nghiên cứu, thiết kế thành cồng mẫu dị Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu methyl thiết lập điều kiện đề phân tích định lượng đột biến A8344G cửa hội chứng MERRF real-time PCR Kết nghiên cứu tái khẳng định bằng ỹià i trình tự vùng gert quan tâm cho kết âm tính cho đột biến A8344G, T8356C, G8363A.
Kết luận: Tuy không phát đột biển, chúng tồi hy vọng với phương pháp sàng lọc định lượng thiết lập cồng cụ hữu ích cho nghiên cứu sau đọt biến này.
Từ khóa: MERRF, động kính giật cơ, sợi khơng đều. SUMMARY
Background: MERRF - syndrome myoclonic epilepsy with ragged-red fibres, affecting the nervous system and skeletal muscles as well as other systems o f the body, caused by mutations in (he genes MT-TK o f mitochondrial DNA Screening and quantitative some mutations o f myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - MERRF in Việt Nam patients.
Materials and method: We conduct mutation screening o f MERRF syndrome peripheral blood form o f 312 patients with suspected brain mitochondrial myopathy, was taken from the Central Pediatrics Hospital by PCR- RFLP, real-time PCR and sequencing nucleic acid fragments suspected mutated gene research.
Results: Do not detected any cases o f mutation A8344G, T8356C, G8363A under MERRF syndrome in 312 patients studied, by PCR-RFLP Designing successful Taqman probes by bridge methyl nucleotides to detect and quantify the degree o f heterogeneity o f mutations A8344G under syndrome by real-time PCR MERRF Develop