Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

Đã điều tra tình trạng nhiễm nấm gây bệnh trên một số cây trổng phổ biến ở nước ta, phân lâp và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh kháng nấm nghi[r]

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

NGHIÊN CỨU XẠ KHUÂN SINH CHẤT KHÁNG SINH KHÁNG NAM

GÂY BỆNH THỰC VẬT ỏ VIỆT NAM

MÃ SỐ : QG - 02 -12

Chủ trì đề t i :

P G S T S K i ề u H ữ u Ả n h

Tên để tài:

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN s i n h c h ấ t k h n g s i n h

KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VIỆT NAM

Mả sô : QG - 02 -1 2

Chủ tri để tài : Kiều H ữ u Ả nh

H ọc h àm , học vị, c h u y ê n m ôn : PGS.TS vi sinh v ậ t học

C c v ụ : C h ủ nh iệm Bộ m ôn

Đ n v ị cô n g t c : K hoa Sinh, Đ H K H T N

Địa c h ỉ:

S ố n h 64, ng õ 29 /4 Kim Mã, Q Ba Đ ình, Số đ iện t h o i : 8430883 Đ n v ị p h ố i h ợ p : - Bộ m ôn Bệnh N ông dư ợ c, T rư n g Đ ại

học N ô n g n g h iệp I, H N ội

BÁO CÁO TÓM TẮT a Tên đề t i :

Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm gây bệnh thực vật Việt Nam Mã s ố : QG-02-12

b Chủ trì đề t i : PGS.TS Kiều Hữu Ảnh c Danh sách người tham gia :

Họ tên Học hàm,

học vị Đơn vị, ca quan

Phạm Văn Ty PGS.TS Tnrờng Đại học Khoa học tự nhiên

Bùi Thị Việt Hà Th.s Trường Đại học Khoa học tự nhiên

Nguyễn Thanh Huyền Th.s Trường Đại học Khoa học tự nhiên

Mai Thị Đàm Linh Cử nhân Trường Đại học Khoa học tự nhiên

Nguyễn Lê Huyền Trang Cử nhân Viện Khoa học & Công nghệ VN

Đinh Xuân Tuấn Cử nhân TT Phòng trừ mối, VKH Thủy lợi

Đào Duy Đạt Cử nhân Viện Công nghộ sinh học, VKHCN

Lý Ngọc Oanh Cử nhân Trường Đại học Khoa học tự nhiên

Đỗ Minh Phương KTV Trường Đại học Khoa học tự nhiên

Phạm Thùy Linh Cử nhân Trường Đại học Khoa học tự nhiên

d Mục tiêu nội dung nghiên cứu

Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học diện rộng với thiếu hiểu biết thuốc gây thiệt hại lớn kinh tế, ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi sinh sức khoẻ cộng đồng Mục tiêu cơng trình điều tra tình trạng nhiễm nấm gây bệnh sô' loại trồng phổ biến nước ta, phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh kháng n n , sơ nghiên cứu số tính chất hiệu diệt nấm chất kháng sinh thu

Penicillium sp., cịn có Mucor sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Syncephalastrum sp., Cladosporium sp., Monilinia sp., Acremonium sp

Từ 110 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất có 14 chủng ức chế Fusarium .oxysporum, chiếm (12,73 %) chọn hai chủng kháng F oxysporum mạnh nhất, chủng T - 41 chủng D - 42 Hai chủng thuộc nhóm xám (Gy) Sơ xác định theo ISP, chủng xạ khuẩn T-41 có nhiều đặc điểm giống với lồi s antimycoticus, chủng D-42 có nhiều đặc điểm giống với loài s viridogenes Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng chủng T-41 28-30°C, pH tối ưu từ 6,5 đến 7,5; chủng D-42 26-28°C, pH tối ưu 7,0 -ỉ-7,5

Cả hai chủng T-41 D-42 cho hoạt tính kháng sinh mạnh mơi trường A-12 Trong đó, hoạt tính kháng sinh chủng T-41 môi trường rắn (xốp) mạnh nhiều so với môi trường dịch thể Chủng D-42 cho lượng sinh khối lớn thời với lượng chất kháng sinh tích luỹ nội bào

T-41 D-42 cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhiệt độ khoảng 30°c, pH trung tính kiềm Nguồn cacbon thích hợp cho chủng T-41 tinh bột tan % D-42 ri đường Nguồn nitơ thích hợp cho lên men hai chủng bột đậu tương., hai chủng, lượng sinh khối tích luỹ lớn hoạt tính kháng sinh cực đại đạt sau khoảng 96-120 nuôi Trên môi trường lên men xốp, hoạt tính kháng sinh chủng T-41 đạt hoạt tính vào ngày thứ 12

Chất kháng sinh hai chủng T-41và D-42 tan tốt etanol, n-butanol, etyl axetat Chất kháng sinh khơng thay đổi hoạt tính xử lý nhiệt 100°c với thời gian kéo dài 60 phút Chất kháng sinh từ T-41 có phổ hấp phụ cực đại bước sóng: X = 213; X = 276,5 X = 326,5.

Kết thử nghiệm bước đầu hiệu diột nấm gây bệnh thực vật chẻ' phẩm T-41 D-42 cho thấy chế phẩm từ s antimycoticus T-41 có tác dụng diệt nấm Sclerotium rolfsii cà chua với hiệu lực ngang với Mexyl, ngang với chế phẩm từ Trichoderma viride cao Rovral chế phẩm từ s viridogenes D-42 lại có tác dụng diệt nấm Rhizoctonia solani bắp cải với hiệu lực tương đối cao (hơn Rovral và T-41, valiđamyxin chế phẩm từ Trichoderma viride).

e Các kết đạt được

- Thu thập, khiết bảo quản 132 chủng nấm gây bênh thực vật 14 chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt nấm mạnh

- Đào tạo cử nhân - 02 báo

f Tinh hình kinh phí đề tài

Tổng kinh phí cấp : 60.000.000 đồng (Sáu mươi triệu đồng) Đ ã chi khoản sau :

- Thuê mướn chuyên gia hợp : 25.000.000 đồng - Hóa chất vật liệu : 27.000.000 đồng

SƯMMARY

a P r ọ ịec t:

Study on production o f antibiotics against phytopathogenic fungi by Actinomycete strains íolated from soil samples in Vietnam

Code num ber: QG-02-12 b Prọịect leader : Assoc Pro Dr Kieu Huu Anh c Researching staíT:

Name Title, degree Offi.ce

Pham Van Ty Assoc Pro Dr Hanoi University of Natural Sciences Bui Thi Viet Ha M.Sc Hanoi University of Natural Sciences Nguyen Thanh Huyen M.Sc Hanoi University of Natural Sciences Mai Thi Dam Linh Bachelor Hanoi University of Natural Sciences Nguyen Le Huyen Trang Bachelor Institut of Science and Technology Dinh Xuan Tuan Bachelor Institut of Irrigation Science

Dao Duy Dat Bachelor Institut of Biotechnology, Inst of S&T Ly Ngoe Oanh Bachelor Hanoi University of Natural Sciences Do Minh Phuong Technician Hanoi University of Natural Sciences Pham Thuy Linh Bachelor Hanoi University of Natural Sciences d The aim and content of research

Findings published recently by the EPA have made scientists increasingly aware of the drawbacks of many chemical pesticides, in terms of their effect on the environment, as well as on the grovvers & consumers of agricultural Products Biological control is a potent means of reducing the damage caused by plant pathogens The períormance of a biocontrol agent cannot be expected to equal that of an excellent fungicide; although some biocontrol agents have been reported to be as effective as fungicide control

The goal of this work is to survey and study phytopathogenic fungi írequently found on some cultivated crops of North Vietnam and to isolate Streptomyces strains capable of producing antibiotics against the above

110 Streptomyces strains were isolateđ from soil samples Isolates initially were selected in vitro for activity against Fusarium oxysporum and 14 strains capable of producing antibiotics against the above fungal pathogen were found These strains were then screened for activity against other phytopathogenic fungi, including Sclerotium roựsii and Rhizoctonỉa solani Some morphological, physiological and color characteristics of two most active strains T-41 and D-42 were investigated based on the methods of the International Streptomyces Project (ISP) Electron microscopic spore and aerial mycelium studies were carried out These two strains appeared to related to Streptomyces antimycoticus and s viridogenes, respectively.

T-41 and D-42 have been indentified having signiíicant antifungal activity in vitro with nophytotoxic effects on plants Optimal conditions for the growth and antibiotic production of these two isolates were also found

Greenhouse and ground microlot trials with T-41 and D-42 spores were conducted Streptomyces spores from these two selected isolates applied to soil of tomato and inoculated with Sclerotium roựsii at 30g spores per lot of soil and to soil of cabbage and inoculated with Rhizoctonia solani at 200 ml spore solution per lot of soil significantly reduced the mortality of plants

e Results

- 04 bachelors graduated

- A collection of 132 phytophathogenic íungus strains and 14 antifungal antibiotic- Ọĩoảucing-Streptomyces strains

- 02 report papers

XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI

MỤC LỤC

Mở đầu

Chương - Tông quan tài liệu

1.1 Vi n ấ m - N g u y ê n n h â n chủ yếu gây b ệ n h h i trồ n g 1.1.1 Sự lan tru y ề n chu kỳ p h t triển nâin gây b ệ n h thự c v ậ t 1.1.1.1 Sự lan tru y ề n

1.1.1.2 Sự lây n h iễm

1.1.1.3 C h u kỳ p h t triển n ấ m

1.1.2 Các loại n ấ m gây bệnh thực v ậ t th n g gặp 1.1.2.1 R hừoctonia

1.1.2.2 Sclerotium

1.1.2.3 Fusarium

1.1.3 T hiệt h i kin h t ế trồ n g v i n ấ in

1.1.4 N h ữ n g b iện p h p p h ò n g trừ n ấ m gây bện h thực v ậ t 1.1.4.1 Biện p h p p h ị n g trừ hố học

1.1.4.2 Biện p h p đ â u ữ a n h sinh học

1.2.Xạ k h u ẩ n v ch ất k h n g sinh có n g u n gốc xạ k h u ẩ n tro n g việc p h ò n g trừ n ấ m gây h ại thực v ậ t

1.2.1 Xạ k h u ẩ n

1.2.1.1 Đặc điểm c h u n g xạ k h u ẩ n 1.2.1.2 P h ân loại xạ k h u ẩn

1.2.2 V trò chất k h n g sinh có n g u n gơc xạ k h u ẩ n toong p h ò n g trừ n ấ m gây h ại thực vật

1.2.2.1 Tình h ìn h n ghiên cứu v ứng d ụ n g ch ất k h n g sin h tro n g p h ò n g ch ố n g bện h thực v ậ t vi sinh v ậ t gây

1.2.2.2 Các n h ó m ch ất k h n g sinh có n g u n gốc xạ k h u ẩ n

1.2.2.3 Các y ế u tố ả n h h n g đ ế n sinh tô n g h ợ p c h ấ t k h n g sin h xạ k h u ẩ n

1.2.2.4 Tách ch iết tình c h ế chất k h n g sinh

1.2.2.5 ứ n g d ụ n g xạ k h u ẩn chất k h n g sin h có n g u n gốc xạ k h u â n tro n g p h ò n g trừ n ấ m gây b ệ n h thực v ậ t

C h n g - V ậ t liệ u p h n g p h p 2.1 N g u y ê n liệu hoá chất

2.1.1 N g u y ê n liệu

2.1.1.1 M ẩu 11.1.2 M ẫu đ ấ t 2.1.1.3 V i sin h v ậ t 2.2 H o ch ất

2.1.3 D ụ n g cụ v th iế t bị 2.1.4 Các cô n g thức m ô i trư ng 2.2 P h n g p h p n g h iê n cứu

2.2.1 T h u m ẫ u b ê n h thự c vật, p h â n lập n ấ m v đ ịn h tên 2.2.1.1 P h ân lậ p n ấ m g â y bệnh

2.2.1.2 Xác đ in h đặc điểm p h â n loại, đặc đ iểm h ìn h th i v đ ịn h tên

2.2.2 P h â n lập v tu y ể n chọn xạ k h u ẩn 2.2.2.1 P h â n lập xạ k h u ẩ n theo V inogradski 2 2 Xác đ ịn h h o t tín h kh án g sinh

2.22.3 T uyển ch ọ n ch ủ n g xạ k h u â n sinh c h ẩt k h n g sinh 2.2.3 Bảo q u ả n giống

2.2.4 N g h iên u đặc điêm sinh học v p h â n loại x k h u ẩ n 2.2.4.1 Đặc đ iể m h ìn h thái

2.2Ả.2 Đặc đ iể m n u ô i cấy 2.2.4.3 Đặc đ iể m sinh lý sinh hoá 2.2.5 Lên m en

2.2.5.1 Lựa ch ọ n m ôi trư n g lên m en thích h ợ p

22.5.2 Ả nh h n g n g u n cacbon, n itơ lên sinh tổ n g h ợ p ch ất khán g sinh

2.2.53 Ả nh h n g p H ban đ ầ u đến k h ả n ă n g h ìn h th n h chất kh án g sinh

2.2.5A Ả nh h n g n h iệt độ đ ên khả n ă n g h ìn h th àn h c h ất k h n g sinh

2.2.5.5 Đ ộng th i củ a q u trình lên m en 2.2.5.Ĩ Lên m e n xốp

2.2.6 Tách ch iế t tìn h c h ế chất k h n g sinh

2.2.6.1 Tách ch iết c h ấ t kh n g sinh từ sinh k h ố i b ằ n g d u n g m h ữ u 2.2.Ơ.2 Tách chiết c h ấ t k h n g sinh từ dịch lên m e n b ằ n g d u n g m ôi h ữ u

2.2.7 Xác đ ịn h m ộ t s ố tín h chất c h ất k h n g sinh 2.2.7.1 Xác đ ịn h k h ả n ă n g bền n h iệt c h ất k h n g sinh 2.2.7.2 Xác đ ịn h Rf chất kháng sinh b ằ n g sắc k ý giấy. 22.7.3 Xác đ ịn h p h ổ tử ngoại chất k h n g sinh

2.2.8 S ản x u ấ t c h ế p h ẩ m 2.2.8.1 Q u y trìn h sả n x u ấ t

2.2.9 T ìm h iể u k h ả n ă n g ứng dụ n g

của hạt

22.9.2 Xác đ ịn h ản h h n g củ a dịch n u ô i đ ế n k h ả n ă n g sinh trư n g v p h t triển

2.2.10 T h n g h iệm c h ế p h ẩ m trê n đ n g ru ộ n g

Chương - Kết thảo luận

3.1 T ình trạ n g nh iễm n ấm gây b ện h trê n trồ n g q u ả tươi 3.1.1 K ết q u ả th u m ẫu

3.1.2 T ình trạ n g nh iễm n ấ m trồ n g

3.1.3 T ình trạ n g n h iễm nấ m trê n ă n q u ả v q u ả tươi 3.1.4 Tình trạ n g n h iễm n ấ m ữ ê n u

3.2 Đặc điểm h ìn h thái p h â n loại m ộ t số n ấ m gây b ệ n h th n g gặp

3.2.1 N ấm gây bên h R h o c to n ia so la n i 3.2.2 Nấm gây bệnh Sclerotiuữì ro lỉsii 3.2.3 N ấm gây bệnh F usarìum o x ỵ sp o r u m

3.3 Phân lập tuyên chọn xạ khuân

3.3.1 Sự p h â n bơ' h o t tính k h n g sin h ch ủ n g xạ k h u ẩ n 3.3.2 T u yển chọn ch ủ n g xạ k h u ẩ n sinh chất k h n g sin h có h o t tính cao chống n ấ m F o x ỵ s p o r u m

3.4 N ghiên cứu đặc điểm sinh học v đặc điểm p h â n loại củ a c h ủ n g xạ k h u ẩ n T-41 D-42

3.4.1 Đặc điểm hình thái

3.4.2 Đặc đ iêm n u ô i

3.4.3 Đặc đ iểm sinh lý - sinh hố

3.4.4 Hoạt tính kháng sinh

3.4.5 P h ân loại

3.5 K n ă n g tông h ợ p chất k h n g sin h ch ủ n g T41, D42 S treptom yces hygroscopicus TC 5-4

3.5.1 Lựa chọn m ôi trư n g lên m en th ích h ợ p

3.5.2 Anh hưởng điều kiện nuôi cây

3.5.2.1 Ả nh h n g n h iệ t độ v p H b a n đ ầ u

3.5.2.2 Á nh h n g n g u n c h ất lên trình sin h tổ n g h ợ p CKS c ủ a ch ủ n g T-41, TC 5-4 v D-42

3.5.3 Đ ộng th lên m en

3.6 Lên men xốp

3.7 T ách chiết tinh c h ế chất k h n g sinh 3.7.1 Tách chiết c hẫt kháng sinh từ dịch lên m en

3.7.2 Tách ch iêt chât k h n g sinh từ m ô i trư n g lên m en xốp

3.7.3 Sơ đồ tách chiết tình c h ế c h ất k h n g sinh ữ o n g d ịch n u ô i

87 88 88 89 89

3.8 M ộ t s ố tín h ch ất chất k h án g sinh 84

3.8.1 Xác đ ịn h k h ả n ă n g bền n h iệ t ch át kh án g sinh 84 3.8.2 Xác đ ịn h Rf chất kh án g sinh

3.8.3 Xác đ ịn h p h ổ tử ngoại chất kh n g sinh 3.9 s ả n x u ấ t c h ế ph ẩm

3.9.1 Q u y trìn h sản x u ấ t

3.9.2 Xác đ ịn h m ộ t số tính c h ất c h ế ph ẩm

3.10 T ìm h iể u k h ả n ă n g ứng d ụ n g 0Q

7 ? ? 7 ' ?

3.10.1 A nh h n g tới n ă n g n y m ẩm cua hạt 90 3.10.2 Ả nh h n g đ ế n khả n ă n g sinh trư n g 92 3.11 Bước đ ầ u th nghiệm c h ế p h ẩ m đ n g ru ộ n g 92

Kết luận 94

MỞ ĐẦU

Hàng nãm giới bệnh trổng gây nên tổn thất to lớn sản xuất nỏng nghiệp Chúng phá huỷ 537,3 triệu loại nông sản, khoảng 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp giới; số này, chiếm 83% bệnh vi nấm gây ra, chủ yếu bệnh đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương

Việt Nam nước nông nghiệp với triệu đất canh tác Sản phẩm nơng nghiệp chiếm vị trí hàng đầu kinh tế quốc dân Khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, bời bệnh vi nấm vần đề tránh khỏi thực tế gây tổn thất nặng nề cho nông nghiệp nước ta Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hố chất nhằm làm tăng sản lượng nơng nghiệp từ lâu phổ biến tăng lên không ngừng từ 10.000 tấn/ nãm vào nãm cuối thập kỷ 80 đến 40.793 tấn/ năm vào năm 1998 Diện tích đất canh tác có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tăng tới khoảng 80 - 90% Chủng loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng Việt Nam đa dạng, có khoảng 269 hoạt chất với gần 735 tên thương mại Tuy chủng loại nhiều vậy, song người nơng dân thường sử dụng theo thói quen hiểu biết hạn chế mức độ độc hại thuốc bảo vệ thực vật nên nhiểu loại thuốc cũ độc wofatox, lindan, DDT, dichlovos, bassan lưu hành Hiện thị trường thuốc bảo vệ thực vật có tới 28 hoạt chất cấm sử dụng, 19 hoạt chất hạn chế sử dụng Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật diện rộng với số lượng lớn, với hạn chế hiểu biết thuốc gây nhiều thiệt hại lớn kinh tế ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi sinh sức khoẻ cộng đồng Bởi vậy, việc xây dựng nông nghiệp phát triển theo định hướng "nồng nghiệp bền vững" cần thiết cấp bách Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á - Thái Bình Dương FAO năm 1992 khẳng định đấu tranh sinh học nến tảng chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM)

Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VI NẤM - NGUYÊN NHẤN CHỦ YỂU GÂY RA CÁC BỆNH HẠI CÂY TRồNG Hàng nãm giới giới bộnh hại trồng nấm gây chiếm khoảng 83% Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm việc nhiễm nấm tránh khỏi Hàng năm lượng lớn lương thực, công nghiệp ngắn ngày bị nhiễm loại nám mốc gây bệnh tạo hàng loạt dịch bệnh khác ảnh hưởng lớn đến suất trồng [1]

Vi nấim sinh vật nhân chuẩn điển hình, phát triển nhanh bào tử sinh dễ lan truyền thông qua gió khơng khí từ xâm nhập vào trổng hạt giống, ngồi cịn tổn đất xâm nhập vào thông qua rễ Cây trồng bị nhiễm vài loại nấm gồm loại nấm ký sinh vốn không gây hại cây, phán lớn loại nám gây hại Sự nhiễm nấm xẩy giai đoạn phát triển tuỳ theo chủng nấm gây bênh mà triệu chứng bệnh biểu mức độ khác

1.1.1 Sự lan truyền chu kỳ phát triển nấm gáy bệnh thực vật

1.1.1.1 Sự lan truyền

Phát tán bào tử hình thức lan truyền quan trọng hầu hết loại nấm gây bệnh phần mặt đất cây, nhờ nấm lan truyền từ sang khác, từ vùng sang vùng khác

B àolỉr nấm —

'L a a truyeach.il dộag

-*Laa u y ề a th.ụ dộag—

- Bào từ hữu tính, từ the đ ã , th.ể bẩu tự phóng vào tcooLg Jdiổag khí 'M a nước tưói làm bào lử bắa

IU ag ca (bào từ nấm collectotrichum ) Gió th ố i bào từ o ấ m đ l xa

Côn tràng m ang tcuyẻa bào từ, tiú dụ bọ cánh, cứag C arpophilus spp. Các yếu ló lan tru y ề a ichác: đất, hại

g iố n g , CÍ1 gióag, xác c â y bệnh _

Bào tử đuợc lan truyền cách chủ động hay thụ động tuỳ thuộc vào đặc điểm sinh học loại nấm ảnh hưởng yếu tô' mơi trường (hình 1)

1.1.1.2 Sự lây nhiễm

Bào tử nấm nguồn bệnh trình lây nhiễm nấm Quá trình lây nhiễm giai đoạn bào tử tiếp xúc với bể mặt ký chủ Để lây nhiẻm, trước hết bào tử phải nảy mầm Nói chung, có hai kiểu nảy mầm : nảy mầm trực tiếp nảy mầm gián tiếp Nảy mầm trực tiếp sinh ống mầm sau phát triển thành sợi nấm, nảy mầm gián tiếp bào tử ban đầu tạo nhiều bào tử nhỏ, bào tử sau nảy nhiều ống mầm [4] Sự nảy mầm bào tử tuỳ thuộc vào nhiều điều kiện sinh thái độ ẩm, nhiệt độ, độ pH môi trường, ánh sáng oxy Độ ẩm yếu tơ' có tác dụng định nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp tới tỷ lệ, tốc độ kiểu nảy mầm bào tử cịn ánh sáng yếu tơ' ảnh hưởng đến nảy mầm [3] Tuy nhiên yếu tơ' có quan hệ chặt chẽ với

Sau bào tử nảy mầm, ống mầm xâm nhập vào bên mô ký chủ nhiều đường : qua bể mặt nguyên vẹn, qua vết thương giói qua khí khổng trên ký chủ Phytophthora inỷestans xâm nhập qua khí khổng qua lớp biểu bì nguyên vẹn lá, nấm Penicillium spp Rhiiopus spp loại ký sinh yếu xâm nhập vào qua vết thuơng giới [15]

Sau xâm nhập nấm phân huỷ cấu trúc tế bào chất hữu khó tan thành dễ tan để hấp thụ Vũ khí hố học nấm để công vào tế bào ký chủ enzym, chất sinh trưởng độc tố [4] Tác động nấm tiết enzym phân giải thành tế bào chủ yếu xenluỉoza pectin Sau phân giải thành, nấm sử dụng enzym thuỷ phân để phân giải thành phần tế bào chất

Trong trình phân giải hấp thụ chất dinh dưỡng, nhiều loại n n tiết độc tố để tác động tới hoạt động sinh lý tế bào, đầu độc tế bào, làm cho mô bị suy yếu chết Lúc triệu chứng bệnh bắt đầu biểu

hãm amilaza phân giải kitin, kìm hãm hoạt tính proteaza amilaza có tế bào nấm [11]

1.1.1.3 Chu kỳ phát triển nấm

Nhìn chung chu kỳ phát triển nấm chia thành hai dạng dựa hình thức sinh sản ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh tới giai đoạn phát triển nấm (chu kỳ lây nhiễm) Dạng thứ chu kỳ phát triển hồn tồn nấm trải qua hai giai đoạn sinh sản vô tính hữu tính Ở dạng thứ hai, tức chu kỳ phát triển khơng hồn tồn, nấm khơng có bỏ qua giai đoạn sinh sản hữu tính [16] Tuy nhiên sơ' loại, ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh mà chủ yếu nhiệt độ, chu kỳ phát triển bị thay đổi nhiểu Thí dụ Phytopthora inỷestans có chu kỳ phát triển hồn tồn điều kiện khí hậu nhiệt đới chưa phát thấy giai đoạn hữu tính [21] Một sơ' nấm bất tồn có thay đổi chu kỳ phát triển tìm thấy giai đoạn sinh sản hữu tính, nấm xếp lại hệ thống phân loại cách chuyển sang lớp nấm khác trì hai lóp theo giai đoạn vơ tính hữu tính Do vậy, nghiên cứu chu kỳ phát triển nấm cần phải tìm hiểu đặc điểm sinh học mối quan hộ yếu tố ngoại cảnh với phát triển nấm khu vực địa lý khác

Chu kỳ lây nhiễm hay gọi "chu kỳ bệnh" bao gồm tất giai đoạn ký sinh bên ký chủ thời kỳ không ký sinh

Sơ đồ tổng quát chu kỳ bệnh trình bày hình

Báo tồa tcoag dất, xác bệoh vạt chất h.ữu ca chét, hạt gióng, cay irổag, k ý ch.0 phụ, aỏag sảa phàm

Nhìn chung chu kỳ bệnh nấm trình hoạt động liên tục dẫn đến việc hình thành bệnh, nhiên giai đoạn ký sinh chu kỳ lập lại nhiều lần tuỳ thuộc vào đặc điểm tốc độ sinh sản nhiều hệ ký sinh vụ mùa Trong điéu kiện định (nhiệt độ, độ ẩm khơng thích hợp .) nám chuyển sang giai đoạn bảo tồn

Nắm vững chu kỳ bệnh cụ thể có ý nghĩa lớn cơng tác phịng trừ bệnh đạt hiệu cao nhờ tìm điểm yếu điểm định hình thành bệnh chu kỳ, từ chọn biện pháp phịng trừ thích hợp dựa vào thay đổi chu kỳ bệnh vùng sinh thái khác điều chỉnh biện pháp phòng trừ hiệu

1.1.2 Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp

L l.2.1 Rhizoctonia

Đặc điểm chung

Là đối tượng bệnh hại quan trọng nay, Rhiioctonia sống đất, có sợi màu trắng vàng, sau thành màu vàng nâu Hạch nấm thường tồn vết bệnh, ban đầu có màu trắng sau chuyển thành màu nâu Nấm tồn đất xác trồng nhiều năm dạng hạch nấm

Rhizoctonia gây bệnh cho nhiều loại trồng khác nhau, đặc biệt từ có giống cải tiến thấp cây, ngắn ngày, sử dụng lượng phân đạm cao gieo cấy diện rộng, thâm canh tăng vụ phát triển diện tích trồng lúa, trồng rau quanh nãm Nấm gây hại trổng mùa vụ, phổ biến vụ xuân Thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển nấm bệnh [17] Đặc biệt vào vụ lúa mùa ngô hè thu tỉnh phía Bắc hay vụ bắp cải đơng sớm bệnh thường nặng hơn, hàm lượng phân đạm cao giúp bệnh phát triển sớm gây thiệt hại nhiều [14]

Các triệu chicng bệnh Rhixoctonia

Trên cày trồng khác bắp cải, cà chua, khoai tây, đậu đỗ, đậu tương, rau cải, xu hảo, ngô, nấm Rhizoctonia thường gây bệnh rễ, phần thân sát mặt đất bắp thân trưởng thành [18]

gây thiệt hại nghiêm trọng Chính hạn chế nhận thức nơng dân tác hại bộnh làm cho bệnh lan nhanh Khi phần gốc thân tiếp xúc với đất ẩm có nguổn bệnh thường có tượng thối rữa gọi bệnh thối gốc Trên lúa ngô đám vết chết loang lổ phiến bẹ đuợc gọi bệnh khơ vằn (hình 6), bệnh thường xuất lớn đóng bắp Bắp cải xà lách bị nhiễm nấm gọi bệnh thối ướt Vết bệnh lúc đầu vết chết màu nâu vàng ngoài, thông thường thấy lớp nấm trắng xám bề mật, sau vết bệnh lan nhanh gây thối toàn bắp Khi trời ẩm, vết bệnh nhìn thấy sợi nấm nằm xen kẽ với hạch nấm Hạch nấm dẹt có màu nâu, bề mặt hạch có lỗ nhỏ (hình 7)

Hình 4: Bệnh thối ướt bắp cải Rhizoctonia

Hình 6: Bệnh khơ vằn ngơ Rhizoctonia

1.1.2.2 Sclerotíum

Đặc điểm chung

Sclerotium có phạm vi phân bơ' rộng từ vùng có khí hậu lạnh Sapa đến vùng đất cát ven biển hay vùng có khí hậu nóng khơ đến vùng Sclerotium rol/sii gây bệnh sống đất, sợi nấm màu trắng đâm tia, sợi nấm sản sinh nhiều hạch nhỏ Hạch nấm tồn đất xâm nhập trực tiếp vào mơ gây bệnh cho Nấm gây hại nhiều loại cảy trồng : lạc, lúa, ngô, họ đậu, cà chua, khoai tây, dưa hấu, bầu bí, làm thuốc (bạch truật, địa tiền ) [17] Ồ Việt Nam, bệnh Sclerotium thường gây nguy hiểm cho trồng cạn, phổ biến bệnh héo rũ trắng gốc bệnh tiêm hạch lúa Trên lúa bệnh xuất nhiều vùng thiếu nước tưới

Nám phát triển gây bệnh nhiệt độ 15 - 37° c, điều kiện thích hợp cho nấm phát triển khí hậu nóng ấm, ẩm độ khơng khí ẩm độ đất cao [22] Bệnh Sclerotium gây hại trồng quanh nãm nặng vào vụ xuàn Nấm gây hại nặng cà chua lạc miền Bắc Việt Nam vào thời điểm trước thu hoạch, lúc đất trồng ẩm ướt Sau thu hoạch, thu dọn ruộng khơng hạch nhỏ nấm gây bệnh tồn đất thân chết mục tiếp tục gây bệnh cho trồng vụ sau Trên ruộng đất cát pha bị nước thường xuyên thường thấy nấm bệnh xuất [19] s rolỷsii tổn nhiều nám đất xác bị bệnh

Các triệu chứng bệnh Sclerotium roựsii

I.I.2.3 Fusarium Đặc điểm chung

Là loài nấm phân bố rộng tất vùng địa lý giới, có khả nãng gây bệnh cao với nhiều loại cây, Fusarium gây thiệt hại không nhỏ sản xuất nồng nghiệp Việt Nam giới Mặt khác cịn sản sinh độc tố gày nguy hiểm cho động vật hoang dại, vật nuôi người Fusarium gây nhiều bệnh khác vói trổng điển hình bệnh héo bó mạch, héo vàng F oxysporum ký sinh hộ rễ thường gây thối rễ G moniỉỉforme tiết giberelin kích thích sinh trưởng gây nên bệnh lúa von, đặc biệt cịn tiết íumonisin gây bệnh ung thư thực quản [11] Chỉ tính riềng khoai tây thiệt hại Fusarium spp gây bệnh thối củ trẽn đồng ruộng bảo quản chiếm tới 20% tổng sản lượng thu hoạch [13]

Fusarium oxysporum gây bệnh tổn đất, chí đất nhiễm bệnh vài năm Nấm gây bệnh lan truyền qua hạt giống, nhiễm bệnh lan truyền theo nước tưới nhờ gió Trong nhiều trường hợp người ta gặp có mật vi khuẩn Ralstonỉa solanacearum với triệu chứng điển hình giống F oxysporum: chẻ dọc thân bị bệnh thấy mạch dẫn màu nảu đen.

Fusarium oxysporum phát triển thuận lợi điẻu kiẽn thời tiết ấm ẩm, trẻn đất cát pha bạc màu đất thịt nhẹ Trong điểu kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ trung bình 27 - 30°c, ẩm độ đất tương đối cao bệnh phát triển mạnh, gây thiệt hại không nhỏ đến suất trồng [12]

Bệnh phát triển nhiều ruộng từ tháng trở gây hại mạnh khoảng tháng đến tháng 11

Các triệu chứng bệnh Fusarium

1.1.3 Thiệt hại kinh tê trồng vi nấm

Hàng nãm giới thiệt hại khoảng 537,3 triệu loại nông sản chù yêu (chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp giới) Riêng lúa chiếm khoảng 9%, ngô 10%, rau 12%, ãn 16,5%, bệnh nấm gây chiếm khoảng 83% [1] Theo số liệu Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), tổn thất hàng nãm sản phẩm nông nghiệp tác nhân gây hại khác gây 20% tổng sản luợng tồn cẩu Tính thành tiền tổn thất nãm tỷ USD gạo, tỷ USD khoai tây, tỷ USD đường, 2,5 tỷ USD cà phê, tỷ USD vể lúa mạch, tỷ USD ngô, 1.5 tỷ USD lúa mì tỷ USD lạc, riêng tổn thất nấm chiếm khoảng nửa (nghĩa khoảng 12 tỷ USD) Theo Ou (1972) số 45 bệnh lúa mô tả, có tới 60% nấm gây Theo kết nghiên cứu Viện bảo vệ thực vật (1971- 1976), sơ' 24 bệnh hại lúa Việt Nam có 13 bệnh nấm gây ra, 34 bệnh ngô có 26, 21 bệnh khoai tây có

Từ năm 1957 đến nuớc ta trải qua nhiều đợt dịch bệnh hại trồng đạo ôn, khô vằn, héo rũ, thối cổ rễ, mà tác nhân gây bệnh chủ yếu nghiêm trọng nhất vi nấm, phổ biến Fusarium oxysporum, Rhiioctonia spp., Sclerotium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp., hầu hết loài bán ký sinh hoại sinh điển hình, có phạm vi ký chủ rộng gây nhiều tổn thất lớn sản lượng thu hoạch làm tính ổn định nâng suất nhiều giống trổng

Cây bị nhiễm nấm ảnh hưởng lớn đến nâng suất chất lượng trồng Khi xâm nhập vào cây, nấm lấy hết chất dinh dưỡng làm nguyên liệu xây dựng tế bào cho làm giảm giá trị Song song với trình phát triển, nấm cịn sinh độc tơ' gây hại cho thân ảnh hưởng đến sinh vật tiêu thụ chúng động vật ãn thực vật người Khi sinh trưởng cây, nấm gày bệnh nghiêm trọng, làm giảm khả nâng sinh sản, làm chậm trình phát triển cây, mạnh hon làm chết cày Hơn tốc độ lây lan nấm nhanh, kéo theo lượng lớn trồng bị nhiễm bệnh Sự nhiễm bệnh lan truyền từ sang khác, từ vùng sang vùng khác, tạo vùng dịch bệnh lớn khó kiểm sốt Tinh hình dịch hại nấm qua năm khỏng giảm mà cịn có chiều hướng tâng với bệnh ngày phức tạp với phòng vệ ngày cao lồi nấm Vì việc nghiên cứu chế phám nhằm hạn chế thiệt hại nấm mối quan tâm hàng đầu nhà khoa học đặt cấp bách

1.1.4 Những biện pháp phòng trừ nấm gày bệnh thực vật

1.1.4.1 Biện pháp phịng trừ hố hoc

thập kỷ 80, đến 40,793 tấn/ năm vào năm 1998, đồng thời diện tích đất canh tác có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tăng lên đến khoảng 80 - 90% Chủng loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng Việt Nam đa dạng, có khoảng 269 hoạt chất với gần 735 tên thương mại Tuy chủng loại nhiều vậy, song người nơng dân thường sử dụng theo thói quen hiểu biết hạn chế mức độ độc hại thuốc bảo vệ thực vật nên dẫn đến việc lạm dụng thuốc hoá học thời gian dài Nhiều loại thuốc cũ độc như: wofatox, lindan, DDT, dichlovos, bassan lượng lớn loại thuốc khồng rõ nguồn gốc sử dụng Hiện thị trường thuốc bảo vệ thực vật lưu hành có tới 28 hoạt chất c n sử dụng, 19 hoạt chất hạn chế sử dụng

Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật diện rộng với số lượng lớn, với hạn chế hiểu biết thuốc bảo vệ thực vật gây nhiều thiệt hại to lớn kinh tế ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi sinh sức khoẻ cộng đồng Hoá chất bảo vệ thực vật hợp chất độc, khó phân huý, chúng tồn thời gian dài, tổn đọng sản phẩm nơng nghiệp, tích tụ đất nguồn nước nguyên nhân gây vụ ngộ độc lớn cho người động vật Ngay vói trồng nhiễm lượng thuốc cao làm cho tỷ lệ nảy mầm, sức nảy mầm bị giảm sút, mọc lên còi cọc, rễ ngắn phát triển khơng bình thường Nó cịn làm giảm tính chống chịu trổng, ảnh hưởng đến phẩm chất nông sản, gây nẻn tượng ngộ độc trổng khô cháy, quăn queo, rụng hoa trái ngộ độc cấp tính, giảm sinh trưởng tính chống chịu ngộ độc mãn tính

1.4.2 Biện pháp đấu tranh sinh học

1.2 XẠ KHUẨN VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH CÓ NGUồN G ố c XẠ KHUAN t r o n g

VIỆC PHÒNG TRỪNẤM GÂY HẠI THỰC VẬT 1.2.1 Xạ khuẩn

1.2.1.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn

Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn phân bơ' rộng đóng vai trị quan trọng tự nhiên Trung bình gam đất nói chung thường có triệu mầm xạ khuẩn [16] Phẩn lớn xạ khuẩn tế bào gram dương, có tỷ lệ G+C cao (>70%), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty) 60 - 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả sinh chất kháng sinh Trong sô' 8000 chất kháng sinh biết giới có 80% xạ khuẩn sinh [17]

Xạ khuẩn thuộc nhóm dị dưỡng, phần lớn ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt mịi trường trang tính kiểm Mặc dẩu thuộc vi khuẩn xạ khuẩn có cấu tạo hệ sợi vi nấm, tiết diện sợi có kích thước tương tự vi khuẩn Thành tế bào khơng chứa xenluloza hay kitin, tế bào phân chia theo kiểu phân bào vơ ty Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có dạng thơ ráp, dạng phấn, khơng suốt, có nếp tỏa theo hình phóng xạ Khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác : đỏ, da cam, vàng, xám, trắng Các lồi xạ khuẩn tạo sắc tơ' hồ tan mơi trường nuôi cấy

Hộ sợi xạ khuẩn gồm khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất cắm sâu vào môi trường để lấy nước thức ãn Khuẩn ty chất phát triển thời gian dài khơng khí hình thành khuẩn ty khí sinh Sau thời gian phát triển đỉnh khuẩn ty khí sinh xuất cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, móc Bào tử xạ khuẩn có dạng hình trụ, hình cầu hình que, hình elip, bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vảy, có gai, có lơng [18] Các đặc điểm cuống sinh bào tử, hình dạng kích thước bào tử đóng vai trị quan trọng việc định tên xạ khuẩn

1.2.1.2 Phàn loại xạ khuẩn

Phân loại dựa đặc điểm hình thái tính chất ni cấy

Dựa đặc điểm hình thái, xạ khuẩn thường chia thành nhóm chính: • Nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt: sinh sản bào tử phân hố thành

khuẩn ty khí sinh khuẩn ty chất

• Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang : khuẩn tv phân chia theo hướng vng góc với nhau, tạo cấu trúc tương tự nang bào tử

• Nhóm xạ khuẩn tuơng tự Corynebacterium cầu khuẩn : tế bào có hình chữ V, T dạng cầu, thơng thường khơng có khuẩn ty

Hầu hết chi xạ khuẩn mô tả đuợc phân chia tùy theo khác đặc điểm hình thái tính chất ni cấy như: màu khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty chất, sắc tố hồ tan, có mặt khuẩn ty chất, hình dạng kết cấu mặt bào tử, đặc điểm cuống sinh bào tử phân đốt khuẩn ty Tuy nhiên, loài xạ khuẩn có biểu khác hình thái hay lồi khác giống mật hình thái nên phân loại xạ khuẩn người ta phải dùng thèm tiêu bổ sung khác đặc điểm sinh lý, sinh hoá, miễn dịch học hay sinh học phân tử

Phân loại dựa đặc điểm sinh lý sinh hoá

Khi phân loại xạ khuẩn đến loài người ta sử dụng hàng loạt đặc điểm sinh lý sinh hoá khả hoá nguồn cacbon nitơ, nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả biến đổi chất khác nhờ hệ thống enzym, mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả chịu muối yếu tố khác môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng phát triển khác nhau, tính đối kháng nhạy cảm vói chất kháng sinh, khả tạo thành chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác xạ khuẩn

Tuy nhiên, tính khơng ổn định biến dị cao xạ khuẩn, nay, để phân loại xác phát lồi người ta phải sử dụng đặc điểm dựa phân loại số, tiến hành so sánh cao phân tử ADN, ARN, protein hay giải trình tựrARN 16S

Hệ thống phân loại chi Streptomyces dùng đê' tài

Đó hệ thống phân loại định dạng loài Streptomyces ISP [20]] Hệ thống phân loại ISP dựa tiêu chuẩn sau:

- Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc chia thành màu: màu trắng (white - W), màu xám (Gray - Gy), màu đỏ (Red - R), màu vàng (Yellow - Y), màu xanh (Green - Gn), màu xanh da trời (Blue - B), màu tím (V) Trong trường hợp mà màu sắc khuẩn lạc rơi vào hai màu hai màu ghi nhận (chẳng hạn, GyW)

- Sắc tố melanin: Xạ khuẩn chia thành hai nhóm là: nhóm có khả sinh melanin nhóm khơng có khả nãng sinh meianin

- sắc tố hoà tan: Các loại xạ khuẩn chia thành hai nhóm, nhóm sinh sắc tơ hồ tan vào mổi trường nhóm khơng sinh sắc tố hồ tan

- Hình thái cuống bào từ Các lồi chi Streptomyces chia thành ba nhóm: Rectịỷỉexibiles (RF) - cuống bào tử thẳng hay lượn sóng, Retinaculiaperti (RA) - cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu, Spirales (S) - cuống bào tử xoắn.

- Bể mặt bào tử : dựa bể mặt bào tử, xạ khuẩn phân thành nhóm là: nhán (Smooth - Sm) nhóm bề mậl bào tử dạng nhẩn, gai (Spiny -Sp), nhóm bề mặt bào tử dạng gai, mụn cóc (Warty - Wa), nhóm bể mật bào tử dạng xù xì, lơng (Hairy - Ha) nhóm bề mặt bào tử dạng sợi

- Sử dụng nguồn cacbon: Khả sử dụng nguồn cacbon positive (+), khơng có khả sử dụng negative (-), sử dụng khơng sử dụng kí hiệu (±) Ngồi cần thiết quan tâm đến đặc điểm sinh lý sinh hóa khác khả khử nitrat, khả sinh chất kháng sinh, v.v

1.2.2 Vai trò chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn phịng trừ nấm gây hại thực vật.

1.2.2.ỉ Tình hình nghiên cứu ứng dụng chất kháng sinh phòng chống bệnh thực vật vi sinh vật gây ra

Từ cuối năm 1940, khám phá giá trị to lớn penixilin chất kháng sinh khác mở kỷ nguyên cho lịch sử y học Những thành tựu mở xu hướng đầy triển vọng sử dụng chất kháng sinh để bảo vệ thực vật

Năm 1954, Trung Quốc phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces.sp 5.406 có khả nâng sinh chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ Trung Quốc áp dụng triệu trổng thu kết khả quan Ngoài ra, Trung Quốc ứng dụng chế phẩm YIB (yield increasing bacteria) 6,7 triệu 30 tỉnh khác Chế phẩm khơng phịng chống bệnh vi khuẩn mà chứa hormon thực vật IAA, giberelin làm tãng suất trổng Sau Trung Quốc, jinganmyxin, chất kháng sinh tách chiết từ loài xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus, ứng dụng thành cơng phịng chống bệnh thối rễ Hơn 10 nhà máy công nghiệp Trung Quốc sản xuất chế phẩm thương mại

ở Nhật Bản người ta có chế phẩm chống đạo ơn, khơ vằn có hiệu blastidin s, kausugamyxin, valiđamyxin

Nhiều nước khác Hàn Quốc, Malaysia, Thái Lan, Pakistan thành công việc ứng dụng chất kháng sinh để phòng chống bệnh vi sinh vật gây thục vật

ơ Việt Nam có cơng trình nghiên cứu ứng dụng chất kháng sinh phòng chống bệnh vi nấm gày thực vật Đây hướnơ nhằm tìm biện pháp hữu hiệu phòng trừ bệnh gày thiệt hại cho mùa màng khắc phục hạn chế hố chất bảo vệ thực vật

1.2.2.2 Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn

Bảng : Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn

Nhóm Cấu trúc hố học

sở

Đối

tượng Cơ chế tác động Nhóm |ỉ - Lactam

(perúcilin, xepalosphorin,

monobactam, cacbapenem )

Vòng p - lactam gồm nguyên tử c

nguyên tử N

Vi khuẩn gram (+)

ức chế tổng hợp peptiđoglican, thành

tế bào vi khuẩn

Nhóm polypeptit (baxitraxin, polymyxin)

Các chuỗi axitamin Vi khuẩn

gram (-) Phá vỡ màng sinh chất

Nhóm aminoglycozit (streptomyxin,

neomyxin, kasugamyxin )

Các aminosaccaroza nối với liên

kết glycozit tạo vòng aminoxiclitol

Vi khuẩn gram (-), sô'

nấm

ức chế tổng hợp protein

Nhóm tetraxyclin (clotetraxyclin oxytetraxyclin, tetraxyclin )

Hệ thống vòng naphtalen

Vi khuẩn gram (+),

gram (-)

ức chế ngược tổng hợp protein

Nhóm macrolit (erythomyxin,

spiramyxin, azitromyxin )

Các vịng đại lacton nối với thành phẩn

đường aminosaccaroza

1

Vi khuẩn

Nhóm polyen (Nystatin, amphoterixin B)

Cấu trúc phức tạp

Một số vi khuẩn,

nấm tuyến trùng

Tác động lên thành phần sterol ergosterol tạo nên lỗ rò ri màng sinh chất Các chất kháng sinh

khác (Cloramphenicol, thiamphenicol, )

Cấu trúc đơn giản ức chế tổng hợp protein

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh xạ khuẩn

Thành phần mơi trường lên men • Ảnh hưởng nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường đường đơn: glucoza, fructoza hay loại đường kép như: saccaroza, maltoza, lactoza loại tinh bột, chất có thành phần khơng xác định ri đường Trong tất nguồn cacbon glucoza nguồn cacbon dễ tiêu hố, thường gây nên tượng kiềm chế dị hoá tổng hợp chất kháng sinh ngưỡng nồng độ Tuy nhiên khắc phục đuợc tượng việc bổ sung liên tục lượng nhỏ glucoza theo định kỳ, mà khơng dẫn đến tích lũy chất trao đổi ức chế Do tiến hành sản xuất chất kháng sinh từ nguồn cacbon glucoza

• Ảnh hưởng nguồn nitơ

Nguồn nitơ: tồn hai dạng vô hữu Nguồn nitơ hữu gồm cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương Nguồn nitơ vô thường dùng dạng muối amôn (NH4+) nitrat (N ) Thơng thường q trình sinh tổng hợp chất kháng sinh đòi hỏi hai nguồn nitơ mơi trường

• Ảnh hưởng nguồn photpho vơ cơ

tổng hợp nocaxiđin Nocardia uniỷormic địi hỏi nồng độ photphat vơ cao tới 100-200 n/ml [6]

Điều kiện nuôi cấy

• Thơng khí

Xạ khuẩn có nhu cầu thơng khí cao so với vi sinh vật khác tron° giai đoạn nhân giống Do nồng độ oxy C môi trường lên men ảnh hường trực tiếp tới hiệu suất tạo thành sản phẩm mong muốn Nồng độ C thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh - ml C 100 ml mơi trường

• Nhiệt độ

Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt nhiệt độ 28 - 30°c Nhiệt độ thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh thường nằm khoảng 18 - 28°c

• pH môi trường

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc lớn vào mơi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường pH trung tính pH axit hay kiềm ức chế trình tổng hợp chất kháng sinh Bởi vậy, hệ thống nồi lên men người ta thường thiết kế hệ thống điều chỉnh pH tự động HC1 NaOH

• Chất lượng bào tử giống sinh dưỡng

Thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh không phụ thuộc vào điều kiện lên men mà phụ thuộc vào chất lượng bào tử giống sinh dưỡng, cụ thể tuổi khả nãng đồng mặt di truyền hoạt tính trao đổi chất giống

Tuổi giống cho hiệu suất cao 24 giờ, nhiên thời gian ni cịn phụ thuộc vào chủng tuổi bào tử giống Lượng giống cấy truyền sang môi trường lên men phụ thuộc vào chủng xạ khuẩn thành phần môi trường nhân giống (thường từ - 10%)

1.2.2.4 Tách chiết tình chế chất kháng sinh

Việc chọn phương pháp tách chiết tinh chế chất kháng sinh phụ thuộc vào chất chủng sản xuất tính chất lý hố chất kháng sinh

• Tách sinh khối từ dịch ni cấy

• Tách chiết chất kháng sinh từ khuẩn ty

Thông thường chất kháng sinh sinh khối chiết dung mòi hưu etanol, metanol, n-butanol, etylaxelat, axeton Hiệu tách phụ thuộc vào khả hồ tan chất kháng sinh dung mơi Axeton dung mịi có độ phân cực thấp thường sử dụng để tách chiết chất kháng sinh có hiệu Vói dung mơi phương pháp thử hoạt tính phương pháp khuếch tán trẻn thạch khoanh giấy lọc

• Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc

Các chất kháng sinh dịch lọc thường tách chiết dung môi phân cực Muốn tách có hiệu ta phải chọn dung mơi thích hợp điều kiện mơi trường tách (pH) thích hợp mà chất kháng sinh hồ tan tốt dung mơi Dung mơi có chứa chất kháng sinh cô chân không nhiệt độ thấp để loại dung môi nhằm thu chất kháng sinh thơ [4]

• Tinh c h ế chất kháng sinh

Kết tinh phương pháp để tinh chế chất kháng sinh tách chiết sản phẩm phân tích để xác định tính chất hoá lý chúng Đây phương pháp quan trọng để tinh chế chất kháng sinh Sự kết tinh thực cách giảm nhiệt độ hay cải biên hệ dung môi Dung môi chứa vệt kháng sinh cuối q trình kết tinh loại bỏ cách cô chân không Việc bảo đảm tinh chế chất kháng sinh có độ tinh cao thực sắc ký Đây phương pháp tinh chế chất kháng sinh cho hiệu cao

ỉ.2.2.5 ứng dụng xạ khuẩn chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn phòng trừ nấm gày bệnh thực vật

Trong thiên nhiên, loai vi sinh vật đối kháng ức chế hoạt động tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh chủ yếu chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất chúng Sự đối kháng vi sinh vật đất sờ cúa biện pháp đấu tranh sinh học phòng chống bệnh

Thơng thường, lồi xạ khuẩn đối kháng ức chế một vài loại vi nấm Đặc biệt có nhũng lồi có hoạt phổ rộng lồi s lavendulae huinansis có hoạt tính ức chế mạnh vi khuẩn gram (+) lẫn gram (-) nấm gây bệnh Tuy nhiên việc sử dụng chủng có phổ rộng phải thận trọng đế tránh làm ức chế vi sinh vật có lợi vùng rễ đảm bảo việc cân khu hệ vi sinh vât đất

các chất kích thích sinh trưởng thực vật sinh trường khu hệ vi sinh vật hữu ích vùng rễ

Hầu hết chất kháng sinh tìm thấy có nguồn gốc từ xạ khuẩn Được sử dụng bảo vệ thực vật chậm so với việc dùng y học chăn nuôi thú y, song chất kháng sinh có triến vọng to lớn thực tế sán xuất bời ví chúng có nhiều ưu việt so với hoá chất bảo vệ thực vật: có tác dụng chọn lọc cao, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh nồng độ thấp, có tác dụng nhanh, thường khơng độc độc thấp người, động vật thực vật, có khả nãng ức chế vi sinh vật kháng thuốc hố học, sơ' lớn có tác dụng nội hấp, thời gian bán huỷ ngắn khơng gây ô nhiễm môi trường Chất kháng sinh dịch lên men chủng sinh chất kháng sinh dùng đế xử lý hạt giống hay hổ rễ trước gieo trổng nhằm tiẻu diột nguồn bệnh bẻn hạt, diệt bệnh phận mặt đát làm mầm bệnh đất Tuy nhiên, để khấc phục tính chóng nhờn thuốc vi sinh vật, việc định kỳ thay thuốc, người ta dùng hỗn hợp chất kháng sinh Bên cạnh cịn cần ý tới việc đảm bảo cân khu hệ vi sinh vật hữu ích đất

Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Mầu cây

Mẫu nghiên cứu đối tượng trồng bị bệnh khác (cây công nghiệp ngắn ngày, lương thực, ăn quả, rau loại tươi bị nhiễm mốc tự nhiên) Các mẫu thu thập địa điểm khác nhau: Hà Tây, Bắc Ninh, Viện Rau Quả, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội theo thời vụ nãm 2003 dựa triệu chứng bệnh điển hình (vết đốm, héo rũ, biến màu, thối hỏng), từ thu 85 mẫu bệnh

2.1.1.2 Mẫu đất

19 mẫu đất lấy từ độ sâu - 10 cm địa hình khác nhau: đất núi, đất bãi đê, đất ruộng lúa, đất vườn vùng khác thuộc hai tỉnh Bắc Ninh Nghệ An Từ phân lập 110 chủng xạ khuẩn

2.1.1.3 Vi sinh vật

- Bacillus subtilis, E coli, Aspergillus chủng xạ khuẩn Streptomvces hygroscopicus (TC - ) nhận từ Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quớc Gia Hà Nội

- Staphyloccus aureus nhận từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội - Fitsarium oxysporum nhận từ Bảo tàng Giống chuẩn, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Pseudomonas solanacearum nhận từ Viện KHKT Nông Nghiệp.

- Rhiioctonia solani, Sclerotium rolfsii, Penicilium nhận từ Bộ môn Bệnh Nông dược Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội

2.2.2 Hoá chất

- Các loại đường chuẩn: glucoza, arabinoza raffinoza, fructoza, lactoza xyloza inositol, sacaroza hãng Merck (Đức) sản xuất

- Các hoá chất khác: KH2P 4, KC1, FeS04.7H20 , M gS04.7H20 NaNO, 2.1.3 Dụng cụ thiết bị

Cân điện 0,00 lg

Kính hiển vi điện tử truyền qua Kính lúp điện soi dùng điện (Trung tâm Bệnh nhiệt đới) Kính hiển vi quang học OLYMPUS Tủ thổi khí vơ trùng

Máy đo pH Delta 320

Kính hiển vi điện tử quét JEOL Máy đo quang phổ tử ngoại Nồi hấp cao áp, tủ khử trùng khơ 2.1.4 Các cịng thức mỏi trường

Mòi trường phản lập giữ giống nấm

Mối trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Ạgar) (g/1): Khoai tâv miếng - 200, thạch - 18, đường - 20, nước llit, pH - 7,4

Mối trường CLA (Camation Leaf Agar)

- Các mảnh hoa cẩm chướng (1 mảnh/ 2ml = - mảnh/đĩa)

- Môi trường WA (Water Agar): đun 15g WA 800ml nước cho tan thạch Bổ sung nước cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng 121°c 20 phút, để nguội khoảng 40uc rót đĩa Petri

- Đặt - mảnh/ đĩa rót mơi trường WA khử trùng vào đĩa Petri

Môi trường c z (Czapek - Dox - Ạgar) (g/1): N aN 03 - 2; KH2P - 1; M gS04.7H:0 - 0,5; KC1 - 0,5; FeS04-0,01: thạch - 20; nước máy - lít

Mơi trường phán lập, giữ giống nghiên cứu xa khuẩn:

Mối trường ĨSP - (g/1): tinh bột tan - 10: K;HPOị - 1.0; M gS04.7H:0 - 1,0: NaCl - 1,0; (NH4 )2S 4- 2; CaCO;,- 2; nước - lit; dung dịch khoáng - lml; pH - 7,2; thạch - I8g

Thụy Điển Nhật Bản Nhật Bản

Mỏi trường Gauze I (g/1): tinh bột tan - 20; K2H P 04 - 0,5; M gS04.7H:0 - 5' NaCl - 0.5; (NH4)2S 04- 2; KNCV 0,5; FeS04- 0,01; nước - llit; pH - 7.4; thach 18g

Mối trường giữ giống: có thêm (g/1): pepton - 5; cao nấm men - 10

Mỏi trường Gauze II (g/1): Nước chiết thịt - 30ml: pepton - 5; NaCI - 5: 2lucoza - 10; thạch - 18: nước - llit, pH - 7.4

Mối trường ISP-I (g/1): Tryton - 5, cao nấm men - 3, thạch - 18, nước llit, pH - 7,2

Mối trường ISP-2 (g/1): cao nấm men - 4; cao malt - 10; dextroza - 4; nước cất lit, thạch - 18, pH - 7,3

Mối trường ISP- (g/1): Pepton - 10, cao nấm men - 1, xitrat sắt - 0,5, thạch - 18, nước - llit, pH - 7,2

Mối trường ISP-9 ( g/1): (NH4)2S - 2,64; KH2P - 2,38; K2HPO, - 5,65; M gS04- 1; dung dịch muối B - ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; nước - llit: pH 6,8

- 7.

Môi trường 79 (g/1): glucoza - 10, pepton - 10, cazein thuỷ phân - 2, cao nấm men - 2, NaCI - 6, K2H P 04- 0,2, thạch - 18, nước llit, pH - 7,4

Mồi trường A-4H (g/I): glucoza - 15; bột đậu tương - 15; N a - 5; CaCƠỊ -1: nước - lít; pH

Mối trường A-4 (g/1): glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO, - 1; nước llít; pH

Mỏi trường A-9 (g/1): glucoza - 10; ri đường - 20; pepton - 5; nước - lít; pH Mõi trường A-12 (g/lì: tinh bột tan - 10; ri đường - 10: bột đậu tương - 10: KH2P - 2; C aC 03 - 1; NaCl - 5; nước - llít; pH

Dung dich muối A

- Dung dịch muối sờ (g/1): K2H P04 - ; MgS04 - ; NaCl - ; CaCO-, - 6; nước cất 1000 m l

- Dung dịch muối vệt (g/I): CuS04 - 6,4; FeS04 - 1.1: MnCl2 - 7.9: nước cất 1000

ml.

- Cách làm : Lấy 30ml dung dịch muối sở 0.1 ml dung dịch muối vệt phản vào bình nón 250ml Bổ sung thèm 20ml nước cất cho mỏi bình có 50ml dung dịch hỗn hợp muối (dung dịch muối A) chinh pH

lOOml

Các môi trường lên men xốp:

Mơi trường: Gạo + Dịch khống Mơi trường: Gạo + Nước

Môi trường: Bột gạo + Trấu + Bột đậu tương Môi trường: Bột đậu tương + Trấu

Môi trường: Bột gạo + Trấu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.2.1 Thu mẫu bệnh thực vật, phản lập nấm định tên

22.1.1 Phán lập nấm gây bệnh

Phân lập nấm gây bệnh (từ mẩu trồng):

Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, Rửa mẫu bệnh đất cát vịi nước Cắt chọn mảnh mơ bệnh thích hợp Khử trùng bề mặt mảnh mô cồn (ethanol 70%) vòng phút Rửa lại nước cất vô trùng Thấm khô mảnh mô giấy thấm vô trùng Dùng dao mổ vô trùng cắt mảnh mỏ thành mảnh nhỏ - mm (chứa phần mô bệnh mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt mảnh mô nhỏ vào môi trường PDA, đĩa petri Ghi cẩn thận bút viết kính: ngày, cây, bệnh Để đĩa môi trường đặt mẫu tủ ấm (30°c ) Theo dõi phát triển sơị nấm mọc từ mô bệnh Khi nấm phát triển từ mô bệnh môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang mơi trường thích hợp: PDA c z

Thu nhân giống khiết: lấy phần đỉnh sợi nấm mọc đĩa thạch, cấy truyền sang ống thạch nghiêng chứa môi trường Czapek nhận giống khiết bảo quản tủ lạnh 4°c

Phân lập nấm gã\ thối quả

Để phàn lập chủng khiết, tách khuẩn lạc từ vết bệnh cho vào bình nón chứa 50ml nước vô trùng lắc đều, dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng nấm, nhỏ - giọt lên đĩa petri chứa mơi trường PDA (có bổ sung streptomvxin) gạt giọt dịch Nuôi - ngày nhiệt đô 28 - 30°c

-Thu nhận giống khiết: từ khuẩn lạc mọc trẽn đĩa thạch cày truyền sang ống thạch nghiêng (chứa môi trường PDA CZ) Khi nhận đươc aiống khiết bảo quản tủ lạnh 4l’C để định tên làm thí nghiệm

2.2.1.2 Xác định đặc điểm phàn loại, đặc điểm hình thái định tẻn.

• Các đặc điểm hình thái nấm quan sát mắt thường, kích thước khuẩn lạc nấm đuợc đo thước đo Các chi tiêu cần xác định :

- Hình dạng mặt trước khuẩn lạc - Hình dạng màu sắc bào tử - Hình dạng mặt sau khuẩn lạc - Sự hình thành sắc tố

• Các đặc điểm phân loại quan sát kính hiển vi

- Làm tiêu bản, soi kính hiển vi quang học kính hiển vi điện tử, mơ tả hình dạng kích thước sợi nấm quan sinh bào tử, định tên sơ tới chi - Định tên đến loài

- Chụp ảnh khuẩn lạc, sợi nấm quan sinh bào tử 2.2.2 Phàn lập tuyển chọn xạ khuẩn

2.2.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân lg đất cho vào bình nón 50ml chứa 9ml nước cất vơ trùng, lắc máy lắc 30 phút Dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4.5ml nước vơ trùng tiếp tục pha lỗng đến 10"\ 10 ’, , 10"6 Từ nồng độ pha loãng nồng độ 10'3 đến 10‘6 , nhỏ 0,lm l sang đĩa petri chứa mơi trường ISP4 Dùng que gạt vị trùng trang đéu sau ni nhiệt độ phịng từ - ngày Trên mẫu đất khuẩn lạc xạ khuẩn cấy pha sang dĩa petri chứa môi trường ISP4 để làm Sau ni nhiệt độ phòng từ -7 ngàv, từ khuẩn lạc làm cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng ISP- Gauze I tiếp tục nuôi điều kiện - ngày Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh chủng xa khuẩn chia thành nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh Blue (B) nhóm xanh da trời Violet (V) nhóm tím, nhóm màu khơng xác định (X )

• Phương pháp thỏi thạch (dùng đ ể sơ tuyển xạ khuần).

Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường ISP Gauze I hộp petri sau ngày dùng khoan nút chai khoan thỏi thạch đặt vào hộp petri đẫ cấy vi sinh vât kiểm định Để vào tủ lạnh 4-5h cho chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường thạch sau để vào tủ ấm Vi khuấn kiểm định ni 37"c, nấm men nấm mốc nuôi 28-30°C, đọc kết sau vài ngày Hoạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thước vịng vơ khuẩn ( D - d, mm ), D kích thước vịng vơ khuẩn d đường kính thỏi thạch

• Phương pháp đục lỗ ( Xác định hoạt tính kháng sinh dịch thể).

Dùng khoan nút chai đục lỗ môi trường thạch cấy vi sinh vật kiểm định hộp petri Nhỏ vào lỗ khoan dung dịch cần thử (các bước tiến hành phương pháp thỏi thạch)

• Phương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoại tính kháng sinh dung mơi). Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm tẩm lượng dịch CKS (lml/10 khoanh giấy lọc) Sau sấy khơ 40°c Đặt khoanh giấy lọc tẩm CKS vào hộp petri cấy vi sinh vật kiểm định (Các bước giống phương pháp thỏi thạch)

2.2.2.3 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Từ ống thạch nghiêng giống hoạt hoá đuợc cấy truyền sang binh nón dung tích 250 ml chúa 100 ml mơi trường Gauze I ni lắc 220 vịng/ phút 48 nhiệt độ phòng

Giống phát triển tốt cấy truyền với tỷ lệ 10% sang binh nón dung tích 250 ml chứa 80 ml mơi trường Gauze I dịch thể Quá trình lên men kéo dài 96 nhịêt độ phòng máy lắc 220 vịng/ phút Sau thử hoạt tính kháng sinh dịch lọc 2.2.3 Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn lựa chọn cấy lên mõi trường thạch nghiêng Gauze I ni nhiệt độ phịng Sau 10 - 14 ngày xạ khuẩn mọc tốt, ống giống bảo quản tủ lạnh - 6°c Sau - tháng cấy truyền lại lần

Để bảo quản lâu giống giũ ống cát, parin lỏng vơ trùng giữ lạnh sâu glyxerin đông khô, bảo quản từ tháng đến năm

2.2.4 Nghiên cứu đặc đièm sinh học phàn loại xạ khuẩn

2.2.4.1 Đặc điểm hình thái

Xạ khuẩn ni cấy trẻn mơi trường Gauze I có gãm lamen nghiêng bề mặt môi trường Sau 7-9 ngày ni nhiệt độ phịng lấy quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử lamen kính hiển vi quang học [36] Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lượn sóng kí hiệu RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn khơng hoàn toàn ký hiệu RA (Ratinaculiapert ) xoắn hoàn toàn ký hiệu s (.Spira) [37].

Bề mặt bào tủ

Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mật khuẩn ty khí sinh có bào tử, sau quan sát chụp ảnh kính hiển vi điện tử qt

Bào tử có hình dạng: trịn, ovan, elip, hình que [38]

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng: Nhẵn ký hiộu Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu Wa (Warty), dạng gai ký hiệu Sp (Spiny) dạng tóc ký hiệu Ha (Hairy)

2.2.4.2 Đặc điểm ni cấy

Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty chất sắc tố tan

Xạ khuẩn đuợc nuôi cấy môi trường: Gauze I, Gauze II, ISP-2, ISP-4, 79 khoai tây (KT) nhiệt độ phòng Sau 7, 14, 21 ngày lấy quan sát màu khuẩn ty khí sinh (K TK S), khuẩn ty chất (KTCC) sắc tố tiết môi trường

Sự hình thành sắc tố melanin [40]

Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường ISP-6 nhiệt độ phịng Bắt đầu quan sát màu mơi trường sau 24 ngày thứ 14 Nếu sinh melanin, màu cùa môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm màu đen

2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý sinh hoá

Nhiệt độ tối ưu

Xạ khuẩn cấy môi trường thạch nghiêng Gauze I nuôi nhiệt độ: 25°c, 28°c, 37°c Khả sinh trưởng xác định sau 7-10 ngày nuôi

Khả sinh enzym ngoại bào

Xác định hoạt tính enzym ngoại bào cách nuôi xạ khuẩn môi trường chứa chất dùng để xác định hoạt tính enzym

- Gelatin (xác định hoạt tính gelatinaza ) Khả chịu muối

Cấy xạ khuẩn môi trường thạch nghiêng ISP-I có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ 0,5; 1; 3; 5; 7; 8; 9; 10; 11 12 (%), sau 7-10 ngày lấy quan sát sinh trưởng

Khả sử dụng nguồn cacbon

Xạ khuẩn nuôi cấy mổi trường ISP-9 có bổ sung 1% nguồn đường: glucoza, manitol, maltoza, raffinoza, arabinoza, inostol, fructoza lactoza sacaroza, xyloza, xitrat natri, rhamnoza

Cách làm: cân lg đường, trùng đèn u v phương pháp bổ sung vào 100 ml mơi trường ISP-9 cịn nóng Lắc cho tan đường đổ vào đĩa petri nuôi cấy xạ khuẩn, sau 14 ngày quan sát sinh trưởng

Trong mơi trường có glucoza coi đối chứng dương (+) mơi trường khơng có đường coi đối chứng âm (-)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh đối chứng dương ít: có khả sử dụng loại đường đó, kí hiêu (+)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh đối chứng dương, kí hiệu (++)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng đối chứng âm khơng mọc: khơng có sử dụng loại đường , kí hiệu (-)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt đối chứng âm đối chứng dương nhiều, kí hiệu (±)

2.2.5 Lên men

2.2.5.1 Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp

Xạ khuẩn lên men môi trường (theo Waưen, Prokop Grundy, 1995) là: A - 4, A - 4H, A - 9, A -12, ISP - Gauze I Sau 96 nuôi cấy lấc tròn 220 vòng/phút nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng sinh dịch lên men (phương pháp đục lỗ) sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn môi trường phù hợp cho nghiên cứu

22.5.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon, nitơ lẽn sinh tổng hợp chất kháng sinh

Xạ khuẩn lên men môi trường dịch thể bình nón 250ml với thành phần môi trường sau:

Bổ sung nguồn cacbon (%): Tinh bột tan ; glucoza - 5- lactoza - 1,5; saccaroza - 1,5; ri đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dunơ dịch muối A) bổ sung 0,2% (NH4)2S

Bổ sung giống lên men m áy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút Sau 96 lên m en xác định hoạt tính kháng sinh dịch lên men phương pháp đục lỗ

Ảnh hưởng nguồn nitơ

Bổ sung nguồn nitơ (%): Cao nấm men - 1,0; bột đậu tương ; pepton - • (NH4)2S - 0,2 ; NH4Q - 0,1 K N 03 - 0,1 vào hỗn hợp dung dịch muối bổ sung thêm 1,5% glucoza Sau bổ sung giống lên men thử hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ

22.5.3 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả hình thành chất kháng sinh

Xạ khuẩn nuôi lắc môi trường A-12 (220 vòng/phút) chinh pH theo pH 5, 6, 7, 8, NaOH H IN Sau 120 thử hoạt tính kháng sinh

2.2.5.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành chất kháng sinh

Xạ khuẩn nuôi cấy vào mơi trường A-12 ni lắc 220 vịng/ phút nhiệt độ 25°c, 30°c, 37°c sau 120 thử hoạt tính kháng sinh bàng phương pháp đục

lỗ.

2.2.5.2 Động thái trinh lên men

Xạ khuẩn lên men môi trường phù hợp dịch thể bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường Nuôi lắc máy lắc 220 vịng/phút Sau 24 lấy bình xác định thơng số: sinh khối, pH hoạt tính kháng sinh

Mục đích việc nghiên cứu động thái lên men để xác định thời gian điếu kiện tối ưu cho việc hình thành chất kháng sinh

2.2.5.3 Lên men xốp

Xạ khuẩn nuôi nhiều nguồn chất khác nhau, sau ngày bắt đầu kiểm tra hoạt tính kháng sinh cách cân g mồi trường nuôi cấy cho vào đĩa petri cấy vi sinh vật kiểm định (các bước giống phương pháp thỏi thạch)

2.2.6 Tách chiết tinh chẻ'chất kháng sinh

2.2.6.1 Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối dung môi hữu cơ

sinh khối lắc 30 phút nhiệt độ phịng, sau ly tâm loại sinh khối Cuối dung môi chiết thử hoạt tính kháng sinh vi sinh vật kiểm đinh bàng phương pháp khoanh giấy lọc

2.2.Ó.2 Tách chiết chái kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu cơ

Chất kháng sinh dịch lên men tách nhiều phương pháp khác như: hấp phụ , trao đổi ion hay tách chiết dung môi hữu Trong nghiên cứu đề cập tới phương pháp tách dung mỏi

Dịch men sau loại sinh khối tách loại dung mơi hữu khác như: n-butanol, etyl axetat tỷ lệ dịch chiết dung môi 1:1 Hỗn hợp dịch lên men dung môi lắc nhiệt độ phịng 30 phút Sau thử hoạt tính kháng sinh dung mơi dịch chiết phương pháp khoanh giấy lọc

2.2.7 Xác định số tính chất chất kháng sinh

2.2.7.1 Xác định khả nhiệt chất kháng sinh

Dịch nuôi cấy sau lọc đun cách thuỷ 40°c, 70°c 100°c kéo dài 20, 40, 60 phút, sau làm nguội xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ

2.2.72 Xác định R f chất kháng sinh sắc ký giấy.

Chất kháng sinh hoà tan dung môi hữu khác chấm 0,05 ml dịch hoà tan nảy lên giấy sắc ký Waskman với kích thước X 20 cm, chạy hệ dung môi : n-butanol: H?0 (84:16); n-butanol: axetic : H20 (2:1:1); metanol: a.axetic: H20 (1 :2 : 1) Sau chạy sắc ký băng giấy làm khố tự nhiên và hình phương pháp vi sinh vật với vi sinh vật kiểm định Fusarium oxysporum R f dươc tính theo cịng thức:

Rf = d / D

Trong đó: d - khoảng cách từ điểm chấm tới điểm chất kháng sinh D - khoảng cách từ điểm chấm đến điểm dung môi chạy đến

22.7.3 Xác định p h ổ tử ngoại chất kháng sinh

2.2.8 Sản xuất chế phẩm

2.2.8.I Quy trình sản xuất

Giống ống nghiệm cấy truyền sang bình tam giác 250ml có chứa 50g môi trường lên men xốp để khởi động giống Sau đến ngàv giống từ bình khời động cấy truyền sang bình tam giác lOOOml có chứa 200g mịi trường lên men xốp để sản xuất chế phẩm Lượng giống cấv vào bình lOOOml 5% Sau 12 đến 14 ngày nuôi chế phẩm đưa vào buồng sấy sấy nhiệt độ 40 -

50°c, sau đưa vào máy xay chế phẩm dạng bột đóng gói hồn thiện

Ống giống

Bình nhàn giống khởi động (250ml chứa 50g mòi trường

ni cấy xốp) 5% 5 - ngày

Bình sản xuất

(lOOOml chứa 200g môi trường nuòi cấy xốp)

12 - 14 ngày

Buồng sấy (40 - ỈO#C)

M áy xay Đóng gói

Chế phẩm hoàn thiện

2.2.8.2 Xác định s ố tính chất chế phẩm

Sô'lượng chất lượng bào tủ cùa chể phẩm

Chế phẩm sau hoàn thiện đuợc kiểm tra số lượng bào tử xạ khuẩn có tronơ gam chế phẩm

Khả tồn đất trổng

Chế phẩm bổ sung vào đất khử trùng để điều kiện tự nhiên Sau ngày tiến hành phân lập lại xác định sỏ' lượng bào tử xạ khuẩn chế phẩm có gam đất

Độ tinh c h ế phẩm

Bổ sung chế phẩm vào môi trường phân lập vi khuẩn phân lập nán nhằm kiểm tra chế phẩm có chứa bào tử vi khuẩn hay bào tử nấm

2.2.9 Tim hiểu khả ứng dụng

2.2.9.1 Xác định ảnh hưởng dịch nuôi cấy đến khả nâng nẩy mầm hạt.

Dịch nuôi cấy xạ khuẩn kiểm tra hoạt tính kháng sinh pha lỗng đến nồng độ: 1, 50 100% Ngâm hạt số loại dịch pha lỗng, sau 24 vót ra, đặt vào hộp petri có lót giấy thấm bổ sung nước thấm ướt Mỗi hộp đặt 100 hạt Để vào tú ấm theo dõi khả nãng nảy mầm hạt sau ngày Đối chứng ngâm nước cất Tính tỷ lệ nảy mầm, thí nghiêm lặp lại lần

2.2.9.2 Xác định ảnh hưởng dịch nuôi cấy đến khả sinh trưởng phát triển cây

Dịch ni cấy pha lỗng đến nồng độ: 1, 2, 10, 50 100%, ngâm hạt thóc vào, sau 24 lấy để vào hộp petri có lót giấy thấm tẩm ướt dịch có nồng độ tương ứng, hàng ngày bổ sung dịch pha lỗng có nồng độ tương ứng Quan sát nảy mầm sau ngày sinh trưởng cày sau 10 ngày

2.2.10 Thử nghiệm chế phẩm trèn đồng ruộng

Chế phẩm sau hoàn thiện mật sản xuất đem thử nghiệm đồng ruộng

Vật liệu thủ nghiệm ch ế phẩm:

- Tổng điện tích thử nghiệm: 36m: ruộng chia thành 36 ỏ thí nghiệm (lm 2/ ô) - Nấm gây bệnh cây: sử dụng hai loại nấm gây bệnh phổ biến chù yếu trẻn

- Chế phẩm:

• chế phẩm sinh học vừa sản xuất

• 1 chế phẩm sinh học khác từTrichoderma viride. • chế phẩm hóa học Rovral Mexyl

- loại trổng thử nghiệm: Bắp cải giống cà chua giống

Mơ hình b ố trí thử nghiệm:

Với loại nấm bệnh có cơng thức thí nghiệm, cơng thức có đất gổm ô đối chứng thừ nghiệm sau (CP = chế phẩm)

1) Nấm gây bệnh (ổ đối chứng) 2) Nấm gây bệnh + CP T41 3) Nấm gây bệnh + CP D42

4) Nấm gây bệnh + CP từ Trichoderma 5) Nấm gây bệnh + Rovral

6) Nấm gây bệnh + Mexyl

Mỗi cơng thức lặp lai lần, với loại nấm gây bệnh cần sử dụng hết 18 ô đất

Các bước tiến hành thủ nghiệm:

Lây nhiễm nấm gây bệnh vào đất trổng tất ô cách đưa trực tiếp nấm vào đất Nấm gây bệnh cấy túi nilon chứa 30g mỏi trường trấu + cám ngày sau cấy, nấm đem lâv nhiễm vào đất với liều lượng Rhiĩoctonia solani 45g / ô Sclerotium rolỷsii 60g / ô.

7 ngày sau lây nhiễm nấm, tiến hành bổ sung lán chế phẩm vào đất theo cỏng thức thí nghiệm với liều lượng sau:

CP T41: 30g/ ô thí nghiệm CP D42: 200ml/ thí nghiệm CP Trichoderma: 60g/ thí nghiệm

Rovral: 10g/81 / 500m2

Mexyl: 30g/81 / 500m:

7 ngày sau bổ sung chế phẩm tiến hành trổng bắp cải giống cà chua giống với số lượng 35 cây/ ô

7 ngày sau trồng tiến hành bổ sung chế phấm lần với liều lượng lán Đổng thời ngày lần, xác định sô' chết ô

Chương : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TÌNH TRẠNG NHIỄM n ấ mg â y b ệ n h t r ê n c â y TRồNG v q u ả tươi 3.1.1 Kết thu mẫu

85 mẫu bệnh điển hình thu thập từ 31 đối tượng trổng tươi nhiễm nấm khác vườn trồng vùng xung quanh Hà Nội, Hà Tây, Bắc Ninh Viện Rau quả, Trung tâm giống trổng Từ Liêm, Trường Đại học Nông Nghiệp I Các mẫu bị bệnh thu thập vụ Đông- Xuân năm 2003 Kết thu mẫu ghi bảng

Bảng S ố lượng mẫu địa điểm thu mẫu

Đối tượng trồng

Số lượng mẫu thu thập

Địa điểm thu mẫu

Cây công nghiệp lương thực

35 Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội, Bắc Ninh, Hà Tây

Cây ăn tươi 22 Viện rau quả, vườn trổng ngoại thành Hà Nội

Cây rau 28 Hà Tây, Trung tâm giống

trổng Từ Liêm

Tổng cộng 85

3.1.2 Tinh trạng nhiễm nấm trồng

Sau thu thập mẫu bị bệnh với triệu chứng bệnh điển hình từ đối tượng trổng khác nhau, tiến hành phân lập, khiết loại nấm xác định đặc điểm hình thái cần thiết cho việc định tên sơ Hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc đo quan sát mắt thường, hình dạng kích thước khuẩn ty, bào tử cuống sinh bào tử đo quan sát kính hiển vi Trung tâm Bệnh nhiệt đới Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Dựa tiêu chuẩn phân loại Saccardo (1886) [5] VỚI giúp đỡ cùa Bộ mòn Bênh

Bảng Nấm gáy bệnh gặp công nghiệp lương thục

Đối

Biểu C hủng

s

tuợng nấm

Hình thái khuẩn lạc

T

phân Kết quà định tèn

cây

bệnh T

lập trồng

Đốm C1 Trắng, bào tử đen, không sắc tô' Svncephalastrum sp 1

đen C2 Trắng, xốp Aspergillus sp.

1

Chè phiến C3 Đen mịn Aspergillus sp.

lá, xoăn C4 Xanh đậm, Penicillium sp.

mép, C5 Trắng bơng, bào tử đen, sắc tố Mucor sp.

xỗn vàng

ĐT1 Trắng sợi đâm tia, có hạch màu nâu, nhẵn bóng

Sclerotium rol/sii

Đậu ĐT2 Sợi nâu vàng, chân cát bám, có Rhizoctonia solani tương

Cây héo rũ, rễ mốc

hạch thỏ ráp

2

(giai đoạn

RĐ1 RĐ2

Xanh rêu, trịn mịn

Trắng bơng xốp, khơng sắc tố

Aspergillus sp Aspergillus sp.

hai RĐ3 Xanh đậm, mịn Penicillium sp.

tuần trắng, RĐ4 Trắng, bào tử đen, sắc tô' vàng Mucor sp.

tuổi) RĐ5

RĐ6

Đen mịn, trịn

Trắng bơng xốp, sắc tô' hồng, dày

Aspergillus sp Fusarium oxysporum

LI Xám lông chuột, mỏng Aspergillus sp. L2 Trắng xốp, sắc tố hồng,

dày

Fusarium oxysporum

Lạc Cây L3 Trắng sợi đâm tia, có hạch nâu Sclerotium rolfsii (giai héo rũ, L4 Sợi nâu vàng, chân cát bám, có Rhiioctonia solani

3 đoạn rễ mốc hạch thơ xù xì

tháng trắng, L5 Trắng, bào tử đen, không sắc tố Svncephalastrum sp.

tuổi) đốm L6 Xanh rêu, tròn, dày Aspergillus sp.

vàng

L7 L8 L9

Đen mịn, tròn, mòng

Trấng, bào tử đen sắc tố vàng Xanh đậm, bào tử trắng

4 Cây HV (dùng sản xuất bột ngũ cốc trẻ em) Lá đốm vàng, tròn; Hoa héo vàng, thân rễ thối khô HV1 HV2 HV3 HV4 HV5 HV6 HV7

Trắng toả trịn, tàm hồng Trắng vơi bám, dày thơ Xanh đậm, trịn, mịn Xám lồng chuột, mỏng Trắng xốp bông, không sắc tố Trắng, bào từ đen sợidài leo cao

Đen, tròn

Chưa định tên Chưa định tên Penicillium sp Aspergillus sp Aspergillus sp Syncephaỉastrum sp.

Curvularia sp. Vết NG1 Trắng sợi lơng nhung, tỏa trịn Acremonium sp.

vàng NG2 Vàng cam, xốp bỏng Monilinia sp.

hình NG3 Trắng vôi, mịn, không sợi, Aspergillus sp. Ngô kim NG4 Xám lông chuột, min, mỏng Aspergillus sp.

hoặc NG5 Xanh đậm, tròn mịn Penicillium sp.

trắng NG6 Sợi nâu vàng, chân cát bám, có Rhizoctonia solani

mép, hạch thồ ráp

phiến

ĐX1 Trắng sợi đâm tia , có hạch nàu Sclerotium rolfsii nhẩn, bóng

Cây ĐX2 Trắng lông, bào tử đen, sợi dải Svncephalastrum sp.

Đậu héo rũ, ĐX3 Xanh rèu, tròn, dày Aspergillus sp.

xanh rễ mốc ĐX4 Sợi nâu vàng, chân cát bám, có Rhizoctonia solani

tráng hạch thô ráp

ĐX5 Trắng xốp bông, lan toả hết đĩa Fusarium sp. thạch

Cú có KT1 Trắng, bào từ đen sắc tố vàng Mucor sp.

vết đen chân bám sâu

<7 Khoai tròn, KT2 Xanh rêu, mịn, mỏng Aspergillus sp ;

7

tây vàng KT3 Trắng bông, sợi dài bào tử đen Svncephalastrum sp.

mầm có vịng đồng tâm

héo KT4 Đen mịn, tròn Cladosporium sp.

Ngồi ra, cơng nghiệp lẫn lương thực thấy xuất chi Aspergillus, Mucor, Penicillium số chi khác Syncephalastrum Cladosporium, Acremonium

3-1.3 Tinh trạng nhiễm nấm ăn tuơi

Quả tươi, trước thu hoạch trình bảo quản thường dễ bị nhiễm nấm Chúng xâm nhập vào qua bề mạt nguyên vẹn, qua khí khổng qua vết thương giới Trong thực tế, việc sử dụng hóa chất để bảo quản phổ biến hậu thường gây ngộ độc cho người tiêu dùng Do vậy, sử dụng biện pháp sinh học bảo quản với mục đích an tồn cho người sử dụng vấn để cẩn quan tâm hàng đẩu Trên sở chúng tơi tiến hành tìm hiểu có mật nấm mốc số loại ãn tươi Kết trình bày bảng

Bảng Nấm mốc nhiễm ăn tươi

s T T Đối tượng cáy trồng Chủng nấm phân lập

K ết định tên s T T Đối tượng cày trồng Chủng nấm phân lập

Kết định tén

VI Aspergillus sp. HI Svncephalastrum sp.

V2 Aspergillus sp. H2 Aspergiỉlus sp.

1 Vải / Hồng H3 Penicilỉium sp.

V3 Aspergillus sp.

V4 Penicillium sp. H4 Aspergillus sp.

H5 Monilinia sp. DD1 Aspergillus sp.

DD2 Penicillium sp. XI Cladosporium sp.

2 Đu đủ DD3 AspergiIIus sp. Xoài X2 Aspergillus sp.

DD4 Acremonium sp. X3 Penicillium sp.

DD5 Chưa định tên

DI Penicillium sp. ĐAI Aspergillus sp.

3 Dứa D2 Mucor sp. Đào ĐA2 Syncephalastrum sp.

D3 Aspergillus sp. ĐA3 Penicillium sp.

Q1 Penicilium sp. NHI Aspergillus sp.

4 Quất Q2 Aspergillus sp. 10 Nhãn NH2 Aspergillus sp.

Q3 Acremonium sp. NH3 Aspergilỉus sp.

Q4 Cladosporium sp. NH4 Penicillium sp.

s Cam CAI Syncephalasirum sp. 11 Nho NOI Aspergillus sp.

CA3 CA4 Aspergiìỉus sp Penicillium sp. N 03 N 04 Aspergillus sp Monilinia sp. NI Mucor sp.

6 Na N2 Aspergilỉus sp. N3 Penicillỉum sp.

i

Bảng cho thấy đối tượng tươi bị nhiễm mốc tự nhiên thấy xuất hiện nhiều đại diện thuộc chi Aspergillus Penicilium Đại diện hai chi thấy xuất trẽn bề mặt ăn Bên cạnh đó, cịn sỏ' chi khác Mucor, Syncephalastrum, Acremonium, Monilinia Đây loài nấm hoại sinh điển hình

3.1.4 Tinh trạng nhiễm nấm rau

Ngồi lương thực, cơng nghiệp ãn rau loại cảy trồng quan trọng Đây đối tượng mà nhiều loại nấm gây bệnh xâm nhập gây hại làm ảnh hường trực tiếp đến chất lượng nãng suất Kết phân lập định tên sơ trình bày bảng

Bảng Nấm bệnh gập loại rau thông thường

s T T Đối tượng trồng Biểu bệnh Chủng nấm phân lập

Khuẩn lạc Kết định tên

KL1 Trắng sợi, bào tử đen, sắc tố Mucor sp.

Lá đốm vàng,

Rau vàng, củ KL2 Trắng, lông dài, bào tử đen, Syncephalastrum sp.

1 khoai vết thâm không sắc tô'

lang đen, thối KL3 Xanh đậm, bảo tử trắng, Penicillium sp. xốp KL4 Xanh rêu, chân bám, dày Aspergillus sp.

KL5 Trắng, tâm hồng Chua định tên

Cây héo CC1 Trắng, sợi dạng lưới, xốp Fusarỉum oxysporum vàng, rễ bỏng, đốm tím hoa cà

mốc CC2 Trắng SỢI đâm tia, có hạch Sclerotium rolfsii

2 Cà trắng, nhẩn bóng

chua

quả có CC3 Sợi nâu vàng, chản cát bám Rhizoctonia solani

vết đen có hạch thơ ráp

trắng CC5 CC6

CC7 CC8

Vàng cam, xốp len,

Trắng, bào tử đen khơng sắc tơ'

Xanh rêu, trịn dày Trắng lơng dài, vươn cao

Monilinia sp Syncephalastrum sp. Aspergillus sp Aspergillus sp. Đậu đũa Rễ thối, thâm, héo ĐI Đ2

Trắng sợi đâm tia, có hạch nâu, nhẩn bóng

Xanh đậm, trịn, dày

Sclerotium rolỷsii Penicillium sp. Cải bắp Bẹ bị thối, vết nâu bấp to CBC1 CBC2 CBT1 CBT2

Trắng sợi đâm tia, có hạch nâu, nhẩn bóng

Sơi nâu vàng, chân cát bám, có hạch thơ ráp

Nâu vàng, chân bám, khơng hạch

Sợi nâu vàng, chân bám, có hạch Sclerotium rolfsii Rhizoctonia solani Rhizoctonia solani Rhizoctonia solani Xà lách Rễ thâm nâu, thối nhũn, héo rũ XL1 XL2

Sợi nâu vàng, chân bám, có hạch

Trắng sợi dài bào tử đen

Rhnoctonỉa soỉani

Syncephalastrum sp.

6 Súp lơ

Hoa rễ thâm

nâu

SL1

SL2 SL3

Sợi nâu vàng, chân bám, có hạch

Trắng sợi dài, bào tử đen Xanh đậm, tròn, mịn, mỏng

Rhizoctonia solani Svncephalastrum sp Penicillium sp. Khoai mơn Lá đốm vàng, trịn KM1 KM2 KM3

Trắng xốp bơng, khơng sắc tố,

Xanh đậm, trịn, mịn Vàng cam, xốp

Aspergillus sp.

Penicillium sp Monilinia sp.

8 Cà tím

Lá có đốm đen trịn, nhũn CT1 CT2 CT3

Đen mịn, trịn

Trắng xốp bơng, sợi vươn dài

Xanh đậm, viền trắng, tròn

Aspergillus sp Aspergillus sp. Peniciỉlỉum sp. Cải xanh Xoãn lá, mặt phiến CX1 CX2

Đen mịn mỏng

Xanh rêu, tròn dày

Aspergillus sp

bị mốc trắng

10 Cà rốt

Có vết đen nâu

trên cù

CR1

CR2

Trắng vơi vàng, rắn chắc, có vịng tâm

Xanh đậm, mịn, mỏng

Acremonium sp Penicillum sp. 11 Dưa chuột Cây héo, rễ có vết thâm nâu DC1 DC2 DC3 DC4

Trắng sợi đâm tia, hạch nàu Trắng lơng nhung, tỏa trịn Trắng tỏa trịn, viền vơi Xanh đậm, viền trắng

Sclerotium rolfsii Acremonium sp Chưa định tên Penicillium sp.

12 Bẩu bí

Cây héo, rễ thối, mốc trắng, có phấn trắng BB1 BB2 BB3 BB4 BB5

Trắng sợi đâm tia, có hạch nâu

Trắng xốp bỏng, lan hết đĩa Trắng, tỏa tròn, tâm hồng Trắng vôi vàng, rắn Xám lông chuột, sợi

Sclerotium roỉfsii

Aspergillus sp Chưa định tẽn Acremonỉum sp Aspergillus sp.

13 Mồng

tơi

Vết tím trịn

MT1 MT2 MT3

Trắng, bào tử đen, không sắc tố

Trắng lông nhung, tỏa tròn Xanh đậm, vién trắng, dày

Syncephalastrum sp.

Acremonium sp Penicillium sp. Bảng cho thấy cà chua thường gặp loại nấm gây bệnh chuyên hoá như Fusarium oxysporum, Sclerotium roựsii, Rhiioctonia solani, bọn thường gây hại đến tất giai đoạn phát triển loại cảy đậu đũa, dưa chuột, bầu bí thường gặp Sclerotium roựsii, loại thường gày hại giai đoạn con, vườn ươm Thiệt hại nặng nấm Sclerotium roựsii, Rhizoctonia solani phải kể đến cải bắp, xà lách sup-lơ

Nhận xét chung loại nấm thường gặp ưên trổng:

Trên lá, quả, thường gặp loại nám kí sinh Penicillium sp., Aspergillus sp., Mucor sp Những loại phổ biến tự nhiẻn, bị bệnh, bảo quản

Hiện tượng trồng bị héo rũ, thối rễ dẫn đến bị chết, nguyẽn nhân nấm gây bệnh, phải kể đến thời tiết, điều kiện dinh dưỡng, đất trồng

Hình 17: Rhizoctonia kính hiển vi điện tử

Hình 19: Sợi nấm Sclerotium roựsỉi kính hiển vi điện tử

3.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CỦA MỘT s ố NẤM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP

Hệ thống phân loại hình thái Saccardo, 1886 [5] dựa vào đặc điểm quan sinh dưỡng sinh sản vơ tính nấm chủ yếu Các đặc điểm bao gồm hình thái sợi nấm, hình thái cuống sinh bào tử, hình dạng, màu sắc kích thước bào

Ngồi đặc điểm hình thái khuẩn lạc (màu sắc khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc, sắc tố tiết) xem xét, chúng nhận biết mắt thuờng nán nuôi môi trường PDA

3.2.1 Nấm gảy bệnh Rhizoctonm solani

Sợi nấm đa bào hình ống, phân nhánh nhánh tạo với sợi nấm góc 45- 90°, chỗ phân nhánh thắt nhỏ, giáp có màng ngăn ngang kích thước 8- 13|im (hình 17) Bào tử màng dày gặp phát sinh ẩm độ cao Nhiệt độ thích hợp 17-28°c , 30°c nám sinh trưởng

Rhiioctonia solani thường xuyên gảy hại nặng giai đoạn con, trẽn nhiểu thời vụ trồng nước ta Nguồn bệnh tồn dạng sợi hạch nám đất xác trồng

3.2.2 Nấm gây bệnh Sclerotium rol/sii

Khuẩn lạc môi trường PDA sau - ngày ni có màu trắng, sợi nấm đâm tia bề mặt khuẩn lạc (hình 18) Tản nấm phát triển mạnh sợi đa bào khơng màu, có mấu (hình 19) Hạch nấm hình thành vết bệnh có dạng hình cầu, bể mặt nhẩn nhỏ hạt cải, có màu vàng nâu nâu đen

3.2.3 Nấm gây bệnh Fusarium oxysporum

Đặc điểm hình thái nhận biết nấm nuôi cấy trẻn mỏi trường PDA

ở pH 6,0 và nhiệt độ 30°c.

Màu sắc khuẩn lạc: màu trắng, bể mật khuẩn lạc - ngày đầu mịn mượt Sau trở nên bỏng xốp, khuẩn lạc có màu hồng đào, có viền màu trảng ngày ni cấy Đây đặc điểm đặc trung nám Fusarium oxysporum mơi trường PDA (hình 24) Trong hình 25 thấy hình dạng bào tử lớn bào tử nhỏ, hình 26 thấy cành bào tử cuống sinh bào tử

Bảng M ột số đặc điểm phân loại nấm Fusarium oxysporum phân lập từ cày cà chua nhiễm bệnh

Bào tử nhỏ Bào tử lớn Bào tử màng dày Cuống sinh bào tử

Khơng có vách ngăn tế bào

Có 2-5 vách ngăn tế bào, phần lớn có 3-

4 vách ngăn

Khơng có vách ngán tế bào, có có vách ngãn

ngang

Phàn nhánh đơn kép tam nhánh Cuống bảo tử ngắn, gốc thuôn

nhỏ Vách tế bào mỏng Vách tế bào

dày Vách tế bào dày

Hình elip, bầu dục, hình trứng đơn bào

Hình cong lưỡi liềm, đẩu

cong nhọn, đầu hình

bàn chân

Hình trịn oval hình thận

đơn bào

Hình thành sau 2-3 ngày đĩa môi trường PDA 3-

4 ngày mỏi trường CLA

Hình thành sau 4-6 ngày nuỏi môi trường PDA 5-7 ngày

trên mơi trường CLA

Hình thành mỏi trường CLA sau 18- 25 ngày, trẻn môi trường PDA sau 12-

15 ngày

Hình thành đơn lẻ tạo thành cụm

cuống bào tử đính dạng đầu

Hình thành đơn lẻ thành cụm

Hình thành riêng biệt 2-3 nầm cạnh hay xen kẽ

Hình 20 Đặc điểm hình thái Fusarium oxysporum phàn lập từ cà chua (trên PDA)

o dP° ©

o o

o

©

c?

Hình 22: Cành bào tử cuống sinh bào tử Fusarium oxysporum

Hình 24 : Hình thái khuẩn lạc Penỉcillium sp phân lập từ hồng

3.3 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN

3.3.1 Sự phản bố hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn

Từ 19 mẫu đất lấy nhiều vùng khác hai tinh Bắc Ninh Nghệ An phân lập khiết 110 chủng xạ khuấn Sô' lượng phân bó xạ khuẩn đất trình bày bảng

Bảng 7: S ố lượng sư phân bố xạ khuẩn đất số vùng

TT Nơi lấy mẫu Số lượng mẫu

đất

Số chủng phân lập đưọc

I NGHỆ AN

1 Thị Xã Cửa Lò 01

2 Thành phố Vinh 01 01

3 Huyên Hưng Nguyên 01

4 Huyện Nghi Lộc 01 05

5 Huvện Diễn Châu 01 09

6 Xã Hưng Đông 01 15

7 Thị trấn Quán Hành 01

8 Núi Quyết 01

9 Huyện Nghi Xuân 01 01

Tổng I 09 31

n BẮC NINH

1 Huyện Gia Bình 02 15

2 Huyện Tiẻn Du 02 20

3 Huyện Yên Phong 02 17

4 Huyên Tièn Scm 02

11

5 Huyện Lương Tài 02 16

Tổng n 10 79

Kết cho thấy số luợng xạ khuẩn thu từ mẫu đất lấy vùng khác giao động nhiểu phụ thuộc vào tính chất địa điểm loại đất nghiên

Các chủng phân lập sơ tuyển phương pháp thỏi thạch với loại vi sinh vật kiểm định F.oxysporum; B.subtilis; p.solanacearu E.coli Tỷ lệ chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân chia theo nhóm màu ISP hoạt tính kháng sinh củã chúng trình bày bảng

Bảng Sự phân b ố hoạt tính kháng sinh nhóm xạ khuẩn phàn lập

Nhóm xạ khuẩn (theo ISP)

Tổng số chủng xạ khuẩn

Số chủng có hoạt tính kháng sinh

Tỷ lệ chủng có hoạt tính so với tổng số(%)

Số lượng % Số lượng %

Trắng ( W) 30 27,27 08 25,0 7,27

Xám ( Gr) 37 33,64 11 34,38 10

Đỏ (R) 18 16,36 08 25.0 7,27

Vàng (Y) 07 6,36 0 0 0

Hồng (V) 09 8,18 02 6,25 1,82

Lục (Gn) 04 3,64 02 6,25 1,82

Xanh da trời (B) 05 4,55 01 3,12 0,91

Tổng số 110 100 32 100 29,09

Theo nhóm mầu ISP (The International Streptomyces Project), số lượng xạ khuẩn nhiều nhóm Xám (Gr) (33,64 %) nhóm xanh lục (Gn) (3,64%) Qua bảng ta thấy tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh cao thuộc nhóm xám (34,38%) nhóm xanh da trời (3,12 %) Tỷ lệ chùng có hoạt tính kháng sinh so với tổng sô' cao (29,09 %) Trong sô' chủng phản lập có số chủng vừa có hoạt tính kháng nấm vừa có hoạt tính kháng vi khuẩn

Bảng 9: Tỷ lệ kháng vi sinh vật kiểm định khác nhau của chủng phân lập được

Tổng số chủng xạ khuẩn

Số chủng kháng

B subtilis E coli F oxysporum p solanacearum

110 13 6 14 15

Tỷ lệ % : 100 11,82 5,45 12,73 13,64

Như vậy, có tới 15 chủng ức chế p solanacearum (chiếm 13,64 %), 14 chủng ức chế F.oxysporum chiếm (12,73 %), 13 chủng ức chế B subtilis Số chủng kháng E coli có 6.

3.3.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh có hoạt tính cao chống nấm F oxysporum

Xuất phát từ mục tiêu tuyển chọn chùng xạ khuẩn có khả nãng kháng nám gây bệnh thực vật, nên sau xác định hoạt tính kháng sinh tổng thể cùa 32 chủng xạ khuẩn phân lập phương pháp thỏi thạch dịch thể, 14 chùng có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum tiến hành sàng lọc bước hai Kết trình bày bảng 10

Bảng 10: Hoạt tính kháng ĩ.oxysporum 14 chủng xạ khuẩn phán lập được

STT Ký hiệu chủng Hoạt tính kháng nấm

(D - d, mm)

1 D - 13 11

2 D - 24 18

3 D -2 7 20

4 D - 42 28

5 D - 83 20

6 D - 84 22

7 D - 121 15

8 T - 61 14

9 T - 91 8

10 T - 1 44

11 T - 51 15

12 T - 62 10

13 T - 52 13

14 T - 63 9

Hình 27: Hoạt tính kháng F.oxysporum chủng D - 42 môi trường Gauze I

3.4 NGHIÊN c ú ĐẶC ĐlỂM sin h h ọ c v đ ặ c ĐlỂM p h â n l o i c ủ a c h ủ n g

XẠ KHUẨN T-41 VÀ D-42 3.4.1 Đậc điểm hình thái

H ình 28: Chuối bào tử chủng xạ khuẩn T-41 (độ phóng đại 5.000 lấn)

3.4.2 Đặc điểm nuôi cấy

Các đặc điểm nuôi cấy chủng T-41, D-42 Streptomyces hygroscopicus TC 5-4 mơi trường khác trình bày bảng 11

Bảng 11: Đặc điểm nuôi cấy chủng T-41, D-42 s hygroscopicus TC 5-4

Môi trường

Chủng xạ khuẩn

Sinh trưởng Màu KTKS Màu KTCC Màu sác tơ hồ tan

Gauze I

T-41 +++ Xám đen Vàng nhạt Không màu

D-42 ++ Trắng Trắng Xám Không màu

TC 5-4 +++ Xám đen Vàng nhạt Không màu

Gauze II

T-41 ++ Xám đen Vàng nhạt Không màu

D-42 ++ Trắng Xám Không mầu

TC 5-4 +++ Trắng xám Vàng nhạt Không màu

ISP -2

T-41 ++ Xám Vàng nhạt Khỏng màu

D-42 - - -

-TC 5-4 ++ Xám nhạt Vàng nhạt Khòng màu

IS P -4

T-41 ++ Xám đen Vàng nhạt Không màu

D-42 +++ Trắng Xám Nâu

TC 5-4 +++ Xám đen Vàng nhạt Không màu

79

T-41 +++ Trắng Trắng Không màu i

D-42 + Trắng Xám Không màu

TC 5-4 ++ Trắng Vàng nhạt Không màu

KT

T-41 ++ Xám đen Vàng Không màu

D-42 +++ Trắng Xám đen Không màu

TC 5-4 ++ Trắng xám Vàng nhạt Không màu

Ghi chú: + + + : Sinh trường tốt

Sau ngày ni cấy, màu khuẩn ty khí sinh cùa chúng T-41 thay đổi từ trắng đến xám Sau 14 ngày nuồi cấy môi trường Gauze I, II, ISP-4 ISP-2 KT màu khuẩn ty khí sinh đểu chuyển dần sang xám đen Sau 21 ngày, màu khuẩn ty khí sinh trẻn mơi trường ISP 2, ISP 4, KT chuyển sang màu đen, trẽn mội trường ISP khuẩn ty khí sinh bị nát Cịn mơi trường 79 sau 21 ngày màu khuẩn ty khí sinh màu trắng

Kết từ bảng 11 cho thấy mẩu sắc khuẩn ty khí sinh sinh trường chủng D - 42 phụ thuộc vào mỏi trường nuôi cấy Trên môi trường KT ISP - chủng sinh trưởng mạnh, mầu sắc khuẩn ty khí sinh xám xám đen, môi trường Gauze I Gauze n sinh trưởng bình thường cịn trẽn mơi trường ISP - chủng khơng có khả sinh trưởng, sắc tố hoà tan thấy tiết mỏi trường ISP - cịn mơi trường khác khơng có

Sau ngày ni cấy, màu khuẩn ty khí sinh chủng TC 5-4 thay đổi từ trắng đến xám Sau 14 ngày ni cấy trẽn mịi trường Gauze I, ISP - 4, 79 KT màu khuẩn ty khí sinh chuyển dần sang đen Sau 21 ngày, màu khuẩn ty khí sinh bị nát có dạng xám đen

3.4.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hố.

Chủng T-41 sinh trưởng 37°c, pH thích hợp cho phát triển từ đến Chủng xạ khuẩn T-41 khơng có khả hình thành sắc tơ' melanin trèn mỏi trường có chứa sắt T-41 có khả nãng tạo thành số enzym ngoại bào amylaza, proteaza, xenlulaza, có khả nãng chịu muối đến 5%.

Chủng D-42 sinh trưởng tốt pH 6,5 -H- Tuy nhiên pH tối ưu cho sản sinh chất kháng sinh 7,0 -ỉ-7,5 khơng có khả nãng hình thành sắc tố melanin môi trường thạch hữu chứa sắt D-42 có khả nâng hình thành số enzim ngoại bào amylaza, gelatinaza, xenlulaza, kitinaza proteaza, có khả sinh trưởng nồng độ muối 8%

Chủng TC 5-4 sinh trưởng tối ưu nhiệt độ 28 - 30u 45°c chủng hồn tồn khơng sinh trưởng Kết sắc ký axit amin đạc trưng cho thành tế bào cùa chủng TC 5-4 thuộc typ I chứa LL - DAP pH thích hợp cho phát triển TC 5-4 - 8, chủng khơng có khả hình thành sắc tỏ' melanin mơi trường thạch hữu có chứa sắt TC 5-4 có tạo thành sơ enzym ngoại bào amilaza, xeniulaza, proteaza, có khả chịu muối đên 5%.

Bdng 12: Đặc điểm sinh lý - sinh hoá chủng T-41 D-42 TC 5-4

Các đậc điểm sinh lý - sinh hố Thịng sơ

T-41 D-42 TC 5-4

Phân giải xenluloza (mm) 42 45 12

Phân giải cazein (mm) 40 48 14

Phân giải gelatin (mm ) 44 38 +

Thủy phân tinh bột (mm) 35 18 14

Phân giải kitin (mm) 42 46

-Khử nitrat - - +

Hình thành melanin - -

-Dãy nhiệt độ cho sinh trưởng (°C) 20 + 37° 20 + 32° 2 - 0 Nhiệt độ tối ưu (°C) to òo •I- LO si 26 + 28° K) 00 •I*

o o

Thang pH cho sinh trưởng 5 + 9 6,5 +8 5 + 8,5

pH tối ưu 6,5 +7,5 7,0 -7,5 7,0 +7,5

Khả nâng chịu muối (%) 5 8 5

Bảng 13: Khả đồng hoá đường chủng T-41, D-42 TC 5-4.

Nguồn đường Chủng

T-41 D-42 TC 5-4

D - glucoza + ++ ++

Arabinoza + +

-Xyloza + + +

Inositol + + ++

Mannitol + + ++

Fructoza + + ++

Rhamnoza + 1

Raffinoza + 1 ++

Lactoza - ++ +

Mannoza + +

Maltoza + + + ++

Saccaroza + + ++

Kết bảng 13 cho thấy chủng xạ khuẩn T-41 khơng có khả sử dụng lactoza, nguồn đường khác sử dụng mức độ sử dụng không giống nhau, fructoza mantoza sử dụng tốt Khả nãng sử dụng đường D-42 khác D-42 có khả sừ dụng hầu hết loại đường, nhiẻn, với vài nguồn đường khả nâng sử dụng D-42 chưa rõ ràng Xạ khuẩn TC 5-4 khơng có khả nãng sử dụng arabinoza, mannoza 10 loại đường lại glucoza, sacaroza, ramnoza, fructoza, raffinoza, maltoza, xyloza, lactoza, inositol, manitol sử dụng với mức độ khác

Hình 33: Khả phân giải kitin chủng T-41

3.4.4 Hoạt tính kháng sinh

Theo Gauze (1983) hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn chi tiêu phân loại quan trọng cần nghiên cứu Kết thử nghiệm (bảng 14) cho thấy chủng T-41 TC 5-4 có phổ kháng khuẩn rộng, ngồi khả kháng nấm cịn có khả kháng vi khuẩn gram (+) gram (-) Chủng D - 42 có hoạt tính kháng nấm F.oxysporum mà khơng có hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định khác.

Bảng 14: Hoạt p h ổ kháng khuẩn chủng xạ khuẩn T - 41

Vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng sinh (D - d,mm)

T-41 D-42 TC 5-4

B.subtilis 28 - 30

Staphylococcus aureus 26 - 28

Pseudomonas solanaceraum 22

-F oxysporum 50 28 35

E coli + - 10

Aspegilỉus niger 26 14 25

Rhizoctonia solani 42 21 22

Sclerotium rol/sii 35 18 16

Penicilỉium 30 15 23

Hình 36 Khd kháng Sclerotium roựsii chủng xạ khuẩn T41

Khi đối chiếu với khố phân loại ISP chúng tơi thấy chủng T-41 có nhiểu điểm giống với lồi s antimycoticus Kết so sánh đặc điểm chủng T-

41 với lồi s antimycoticus trình bày bảng 15.

3.4.5 Phản loại

Bảng 15: So sánh đặc điểm phán loại chủng T-41 với loài chuẩn s antimycoticus

Đặc điểm phán loại (Theo ISP)

Chủng T-41 s antimycoticus (Theo ISP)

Màu KTKS Xám Xám

Màu KTCS 0 0

Hình thành Melanin 0 0

Sắc tơ' hồ tan 0 0

Chuỗi bào tử s s

Bể mật bào tử Ha Hasp

Khả sử dụng đường

Arabinoza + +

Xyloza + +

Inositol + +

Mannitol + +

Fructoza + +

Rhamnoza + +

Saccaroza + +

Raffinoza + +

Cũng theo khố phân loại ISP chúng tơi thấy chủng D-42 có nhiều đạc điểm giống với chủng s viridogenes vể hình dạng cuống sinh bào tử, cấu tníc bề mặt bào tử, khả hình thành sắc tố melanin, sắc tố mật bên khuẩn lạc, khả hình thành sắc tố hoà tan, khả sử đụng loại đường Tuy nhiên, có vài sai khác khả nâng sử dụng đưcmg (fructoza, inositol), nhu tạm coi chủng D-42 giống với lồi

s viridogenes Để phân loại xác cần phải xác định thêm số đặc tính (bảng 16)

Bảng 16 So sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn D-42 với chủng S.viridogenes

Đặc điểm phân loại Chủng D-42 Chủng S.vỉridogenes

Màu KTKS Xám Xám

Mầu sắc KTCC so với KTKS Khác Khác

Hình dạng chuỗi sinh bào tử RF RF

Kết cấu bề mặt bào tử Sm Sm

Hình thành melanin Khơng Khơng

Sắc tơ' hồ tan Có Có

Khả sử dụng đường

Arabinoza + +

Xyloza + +

Inositol +

Mannitol + +

Fructoza 1 +

Rhamnoza + +

Saccaroza 1

Raffĩnoza

Ghi chú: ( + ) có khả sử dụng

3.5 KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG T41 D42 VÀ Sưeptomyces hygroscopicus TC 5-4.

3.5.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Trong cơng nghệ sản xuất chất kháng sinh mơi trường ln đóng vai trị quan trọng Một môi trường lên men tốt phải mồi trường vừa thuận lợi cho sinh trường vừa cho hiệu suất kháng sinh cao Ở dùng loại môi trường men sờ lả A- 4, A- 4H, A- 9, A - 12 Gauze I Quá trình lên men tiến hành bình nón dung tích 500ml chứa lOOml mơi trường Ni lắc 200 vịng/ phút 28-30°C Thí nghiệm lặp lại lần Sau 120 men, xác định hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định F oxysporum Kết trình bày bảng 17.

Bảng 17: Hoạt tính kháng F oxysporum chủng xạ khuẩn trên môi trường lên men khác nhau

Chủng xạ khuẩn

Môi trường

pH sau lên

men

Sinh khối (g/ml)

Đường kính vịng vơ khuẩn (D-d, mm)

A-4 8,5 13,28 32

A-4H 16,7 28

A-9 9,3 18

TC 5-4 A-12 18,84 21

Gauzel 7,38 23

A-4 6,54 8,9 18

A-4H 7,69 12,7 16

D-42 A-9 8,1 12 30

A-12 7,27 16,5 22

Gauzel 6,84 01 12

A-4 6,1 6,7

A-4H 7,2 6,3 L2

-

T- 41 A-9 7,0 0,1

A-12 6,7 7,5 20

Kết bảng 17 cho thấy chùng D-42 tích luỹ nội bào chất khánơ sinh mạnh trừ mỏi trucmg Gauze I Hoạt tính kháng sinh ưong dịch lên men cùa môi trường A - lớn Tuy nhiên, lượng sinh khối tạo mỏi trường lại không đáng kể Bên cạnh mịi trường A - 12 cho lượng sinh khối lớn, 16 g/1 mà lượng kháng sinh dịch lọc A - 12 yếu môi trường A - Mặt khác lượng kháng sinh tích luỹ sinh khối mơi trường lớn mà dung môi dùng để chiết chất kháng sinh từ sinh khối sử dụng etanol tốt Điều đáng quan tâm lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho chủng D-42 có hiệu suất kháng sinh cao Như loại môi trường mơi trường A-12 mơi trường thích hợp cho sụ sản sinh chất kháng sinh chủng Đây môi trường giầu dinh dưỡng với nguồn cacbon tinh bột tan ri đường, nguồn nitơ bột đậu tương Rất ri đường đậu tucmg việc cung cấp cacbon nitơ cịn cung cấp số tác nhân cần thiết cho trình sinh trưởng tổng hợp chất kháng sinh chủng D-42

Trên loại mơi trường lên men có thành phần khác nhau, chủng T-41 chi có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định môi trường A-4, A-4H, A-12 Gauze I Song có mỏi trường A-12 chủng T-41 cho hoạt tính kháng sinh mạnh (20mm) Với mục đích chọn mỏi trường sản xuất chất kháng sinh chống nấm mơi trường A-12 thích hợp chủng Tuy nhiẻn, so sánh khả hình thành chất kháng sinh mơi trưởng rắn với môi trường dịch thể A-12 nhận thấy hoạt tính kháng sinh mơi trường rắn mạnh nhiều (44mm) Trên sỡ chúng tơi tìm hiểu khả hình thành chất kháng sinh chùng T-41 trẻn môi trường xốp, thời sử dụng môi trường A-12 cho nghiên cứu

H ình 40: Hoạt tính kháng F oxysporum chủng T-41 ni dịch th ể trẽn mói trường A12

H ình 42 : H oạt tính kháng sinh từ sinh khối môi trường khác l.A - 2.ISP -4 3.A -9 4.A -4H 5 A-4

3.5.2 Ảnh hưởng điểu kiện nuôi cấy

3.5.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ vổ pH ban đầu

Bảng 18: Ảnh hưởng củapH ban đầu tới khả tổng hợp chủng T-41, D - v Streptomyces hygroscopicus TC 5-4

pH ban đầu

pH sau lên men

Sinh khối (g/l) Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm)

T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4

5 5.2 5,26 5,8 6,3 6,27 12 18

6 5.8 6,85 6.4 8,6 7,82 14 15 22

7 6.3 7,12 8,5 7,9 15,4 9,98 18 29 29

8 7.2 8,10 8,5 7.2 12,8 9,23 16 19 27

9 8,1 8,72 6,2 7,4 5,84 11 14 20

Bảng 19 : Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu tới khả tổng hợp chủng T-41, D - 42 Streptomyces hygroscopicus TC 5~4

Nhiệt độ ban đầu

(°C)

pH sau lên men

Sinh khối (g/1)

Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm) T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4

25 KXĐ KXĐ 6,8 6,7 10.1 7,23 13 22 20

30 KXĐ KXĐ 7,6 7,8 13.2 10,5 19 28 28

37 KXĐ KXĐ 6,8 7,4 11.4 4,54 17 25 15

Kết bảng 18 19 cho thấy: ba chủng: T-41, D-42 TC 5-4 có khả nâng sinh trưởng cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhiệt độ khoảng 30°c, pH trung tính kiềm

3.5.2.2 Ảnh hưởng nguồn chất lên trình sinh tổng hợp CKS các chủng T-41, TC 5-4 D-42

Ảnh hưởng nguồn cacbon

và hình thành chất kháng sinh chủng tuyển chọn cho kết trình bày bảng 20

Bảng 20: ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả nâng sinh tổng hợp CKS của chảng T-41, D-42 Streptomyces hygroscopicus TC 5-4.

( Vi sinh vật kiểm định F oxysporum) Nguồn

cacbon %

pH sau lên men Hoạt tính kháng sinh

T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4

Tinh bột tan 5.9 7,50 7,5 20 17 20

Tinh bột tan 6.7 7,45 7,1 16 15 16

Glucoza 1,5 KXĐ 7,48 7,5 + 10 17

Lactoza 1,5 KXĐ 7,18 7,8 + ++ 32

Saccaroza 1,5 5,7 7,27 7,8 13 19 18

Rỉ đường 1,5 6,2 7,62 7,9 15 22 14

Kết bảng cho thấy, chủng D-42 TC 5-4 có khả nãng sử dụng nhiéu loại đường khác Tuy nhiên, ri đường thích hợp Có thể ri đường, ngồi thành phần đường cịn có số chất hữu khác có khả nảng ảnh hưởng tới trình tổng hợp chất kháng sinh chủng Tính chất có ý nghĩa kinh tế xạ khuẩn ứng dụng vào sản xuất

Ảnh hưởng nguồn nitơ

Nguồn nitơ hữu thường sử dụng lên men công nghiệp cao ngô, cao nấm men bột đậu tương nguồn nitơ vơ hay sử dụng suníat amon, clorua amon nitrat amon Kết nghiên cứu ảnh hưởng cùa nguồn nitơ lên trình sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng nghiên cứu trình bày bang

( Vi sinh vật kiểm định F oxysporum)

Bảng 21: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 Streptomyces hygroscopicus TC 5-4.

Nguồn nitơ %

pH sau lên men Hoạt tính kháng sinh

T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4

Bột đậu tương 6.43 7,65 7,2 16 25 24

Bột đậu tương 6.28 7,59 7,6 14 23 17

Cao nấm men 5.89 7,59 8,1 12 28 17

Pepton KXĐ 8,10 6.2 + 21 14

NH4C1 0,1 KXĐ 6,63 6.8 + 18 12

(NH4)2s o4 0,2 KXĐ 6,55 7.6 + 12 15

KNO3 0,1 6,18 6,72 4,5 14 15 10

Kết bảng 21 khẳng định ưu bột đậu tương lên khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng T-41 TC 5-4 Khả nâng sinh tổng hợp chất kháng sinh cao dùng bột đậu tương bột đậu tương có chứa 40% protein mà cịn có chứa chất khác cần cho sinh tổng hợp chất kháng sinh

Đối với chủng D-42, hoạt tính kháng sinh đạt cao nguồn nitơ cao nấm men, tiếp bột đậu tương

Lượng bột đậu tương thích hợp cho ỉên men chủng - 1,5% 3.5.3 Động thái lên men

Bảng 22: Động thái trình lên men chủng tuyển chọn

Thông số lên men

Chủng

Thời gian lên men (h)

0 24 48 72 96 120 144

Sinh khối (g/lOOml)

TC5-4 0,1 5,7 8,6 11,5 13,8 14,7 11,2

D-42 ++ +++ 0,3 0,4 0,4 0,3 0.2

T-41 0,13 0,2 0,4 0,6 0,6 0,4 0,3

pH môi trường sau men

TC5-4 6,8 7,2 7,5 7,6 8,2 8,7

D-42 6,02 3,62 6,93 7,03 7,34 7,77

T-41 7,2 7,63 7,72 7,55 5,2 5,16 4,8

Hoạt tính kháng sinh ( D - d,mm)

TC5-4 - 12 18 23 28 21

D-42 12 20 32 18 13

T-41 - - - 16 18 14

20

18 16

14 ^ p H m ôitruangsaulênm en

12 â

10 '1 — Snhkhỗì(^l)

X

8 =

g 55 —à — Hoạttnhkhàigsirh (rrrn)

0 24 48 72 96 120 144

T h đ íg ã n (g iờ )

35

- - 20"2 E - - 30 £

10 § •

5 = Thời gian (h)

0 24 48 72 96 120 144

Hình 44 Diễn biến sư tổng hơp chất kháng sinh theo thời gian chủng D-42

Bảng 22 hình 44, 45 cho thấy: Với chủng T-41, tốc độ tổng hợp kháng sinh đạt mạnh sau 72 tăng dần kết thúc trình lên men Tuy nhiên tích luỹ chất kháng sinh giảm dần sau 120 Lượng sinh khối tăng dần theo thời gian đạt cực đại sau 120 sau giảm hẳn Lượng sinh khối lớn thời hoạt tính kháng sinh tích luỹ đạt cực đại

Hoạt tính kháng sinh chủng D-42 bắt đầu xuất sau 24 men rổi tăng dần đạt cực đại sau 96 (32 mm) Sau 120 giờ, hoạt tính kháng sinh giảm mạnh Lượng sinh khối tãng dần với thời gian đạt trạng thái cực đại sau 96 nuôi (pha cân bằng) Sau ngưỡng thời gian lượng sinh khối giảm nhanh (pha suy vong) Qua bảng thấy hoạt tính kháng sinh lên men có quan hệ với tốc độ sinh trưởng xạ khuẩn môi trường Hoạt tính kháng sinh sinh khối đạt cực đại cuối pha cản pH môi trường giảm mạnh sau 24 nuỏi sau tăng dần kết thúc trình lên men

Đối với chủng TC 5-4 tốc độ sinh tổng hợp kháng sinh mạnh dần sau 24 lẽn men, lượng sinh khối tâng dần vói thời gian đạt cực đại 120 sau sinh khối giảm hẳn phân đoạn tự phân

Từ kết thấy, sinh trường mang đặc tính đặc trung cho chủng có liên quan đến khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chúng Nhìn chung hoạt tính kháng sinh bắt đầu tăng dần sau 24 lên men Sau 120 giờ, tích luỹ chất kháng sinh sinh khỏi giảm mạnh Điẽu liên quan chặt chẽ đến hình thành axit hữu ưong môi truờng lên men sư sinh trường cùa xạ khuẩn 3.6 LÊN MEN XỐP

kháng sinh mạnh vào ngày thứ 12 (bảng 23) Sau hoạt tính kháng sinh giảm dẩn Trong hoạt tính mơi trường gạo có chứa dịch khống cao so với mơi trường gạo chi chứa nước

Bảng 23 Hoạt tính kháng sinh chủng T-41 môi trường men xốp

(Vi sinh vật kiểm định: F oxysporum)

Môi trường lên men xốp Đường kính vịng vị khuẩn (D - d, mm)

Gạo + Khoáng 36

Gạo + Nước 28

Bột gạo + Trấu + Bột đậu tương 30

Bột đậu tương + Trấu 18

Bột gạo + Trấu 22

Hình 45 : Hoạt tính kháng nấm F oxysporum chủng T-41 loại môi trường lên men xốp.

Sau men 220vòng/ phút ngày mơi trường lên men thích hợp tối ưu hố, dịch ni chủng xạ khuẩn T-41, D-42 TC5-4 đươc loc chia phân: dich lọc va sinh khối, chít kháng sinh dich loc chiẻt dung môi: n - butanol, etyl axetat, izo-butanol; n-propanol chất kháng sinh sinh khối chiết etanol, axeton, metanol, izo-propanoI, etyl axetat Kết trình bày bảng 24

3.7 TÁCH CHẾT VÀ TINH CHẾ CHAT KHÁNG SINH 3.7.1 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men.

Bảng 24 Hoạt tính kháng sinh chiết loại dung môi khác nhau.

Nguồn chiết Dung môi

Hoạt tính kháng sinh (D • d,mm) (VSV kiểm định F.oxysporum)

T-41 D-42 TC 5-4

Dịch lọc

n- butanol 16 20 23

Etyl - axetal 10 23 21

Izo - butanol 14 18 22

n- propanol 13 19 24

Sinh khối

Izo - popanol 22 40

Etanol 20 40 42

Metanol 10 35 50

Axetol 18 38 35

Etyl - axetal 15 27 20

Chúng sử dụng loại dung mỏi để chiết rút chất kháng sinh, kết bảng 24 cho thấy loại dung mơi đểu dùng để chiết chất kháng sinh

Với chủng T-41, nguổn chiết sinh khối việc sử dụng Etanol cho kết cao nhất, với nguồn chiết dịch lọc dùng n-butanol cho kết cao

Kết bảng 24 cho thấy kháng sinh từ chủng TC 5-4 nằm sinh khối dịch lọc chúng tích luỹ sinh khối nhiều Dùng metanol để chiết chất kháng sinh sinh khối cho hoạt lực mạnh Tuy nhiên etanol có khả chiết chất kháng sinh sau metanol để thuận lợi kinh tế dùng etanol để tách chiết chất kháng sinh sinh khối cùa chùng S.hygroscopicus TC 5-4 Hoạt tính kháng sinh dịch lọc hơn, việc chiết bàng n- propanol hay n- butanol cho hoạt tính mạnh dung mỏi cịn lại

Sau chọn dung mơi tách chiết thích hợp tiến hành tách chiết chất kháng sinh chủng T- 41 D- 42 dung môi thích hợp pH 3, pH pH 10, kết trình bày bảng 25

Bảng 25: Hoạt tính kháng sinh dịch ni chủng TC5-4

Nguồn chiết pH

Hoạt tính kháng sinh ( D-d,mm)

T- 41 D -42 TC 5-4

Sinh khối

3 24 36 35

7 12 42 28

10 13 35 36

Dịch lọc

3 17 15 30

7 13 23 20

10 11 20 31

Kết bảng 25 cho thấy chủng T - 41, pH thuận lợi cho việc tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối Cịn chủng D - 42 pH khả hòa tan chất kháng sinh lớn nhất, dung môi sử dụng để tách chiết lại etanol, loại dung mòi rẻ tiền dễ kiếm so với dung môi khác axeton, metanol, etyl axetat

3.7.2 Tách chiết chất kháng sinh từ môi trường lên men xốp

hoạt tính kháng sinh, so sánh khả hoà tan cùa chất kháng sinh từn° dung môi chủng xạ khuẩn T -41 (bảng 26)

Bảng 26 Hoạt tính kháng sinh chủng T-41 dung môi hữu cơ

(Vi sinh vật kiểm định F oxysporum)

Dung môi Hoạt tính kháng sinh ( D-d,mm )

Izo-propanol 15

Etanol 26

Metanol 21

Axeton 25

Kết bảng 26 cho thấy dịch chiết chủng xạ khuẩn T-41, dịch chiết etanol, axeton metanol có hoạt tính kháng F oxysporum lớn so với dịch chiết izo-propanol Trong dịch chiết etanol axeton có hoạt tính gắn nhau, việc chiết rút chất kháng sinh chủng T-41 etanol khơng cho kết cao mà cịn giảm chi phí sản xuất etanol lả loại dung mổi không đắt tiền

Trên sở kết nghiên cứu, chúng tơi thấy quy trình tách chiết chất kháng sinh dịch nuôi cấy chủng D-42, T41 s hygroscopicus TC 5-4 thực theo sơ đồ thích hợp kinh tế

3.4.4 Sơ đồ tách chiết tinh chế chất kháng sinh dịch ni cấy

DỊCH NI CẤY

Rửa nước lần

Hoà sinh khối vào dung mơi thích hợp 70%, chỉnh pH đến 7-8 Khuấy liên tục nhiệt độ phòng Lập lại 2-3 lần

Lọc -> Bỏ bã

Cô chân không 60°c

còn lại 1/4 Hạ nhiệt độ 4°c CKS kết tủa

Bổ sung dung mỏi (Tỷ lệ 4/6) Chỉnh pH đến 7-8 (Lặp lại 2-3 lần)

Chiết -» Bỏ nước

Cô chân không 60°c

cịn lại 1/15 Bổ sung dung mơi Hạ nhiệt độ đến 4°c

CKS kết tủa

Ly tâm -»BỎ nước

CKS THÔ

3.8 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT KHÁNG SINH 3.8.1 Xác định khả bền nhiệt chất kháng sinh

Khả bền vững với nhiệt độ chất kháng sinh T-41, D-42 TC 5-4 đuơc trình bày bảng 27

Hoạt tính kháng sinh chủng T- 41 D - 42 không thay đổi 100°c thời gian kéo dài 60 phút Do việc tách chiết sử bảo quản chất kháng sinh không gặp trở ngại điều kiện nhiệt độ Điều cho thấy la chất kháng sinh chịu nhiệt thuận lợi cho việc tách chiết chúng nghiên cứu sản xuất công nghiêp

Với chủng TC 5-4 nhiệt độ 30-40°C, hoạt tính kháng sinh mạnh, dung dịch kháng sinh giữ nhiệt độ 60°c kéo dài 60 phút cho hoạt tính không thay đổi Khi giữ 80°c hoạt lực kháng sinh giảm chút sau 20-40 phút Nhưng

100°c và kéo dài tới 60 phút cịn hoạt tính kháng sinh khoảng 50% Do đó, việc tách chiết, sử dụng bảo quản chất kháng sinh phải nhiột độ không 60°c để đảm bảo hoạt lực kháng sinh

Bảng 27 Ảnh hưởng nhiệt độ hoạt tính kháng sinh chủng TC5-4

(Vi sinh vật kiểm đinh: F oxysporum) Thời gian xử lý ( phút)

Nhiệt

độ °c

10 20 40 60

Hoạt tính kháng sinh (D-d,mm) T-41 D -42 TC 5-4 T-41 D -42 TC 5-4 T-41 D -42 TC 5-4 T-41 D -42 TC 5-4

30 18 35 40 18 35 40 18 35 40 17 35 40

40 18 34 40 18 34 40 18 34 40 17 34 40

70 18 34 42 17 34 40 16 34 39 15 32 38

3.8.2 Xác định Rf chất kháng sinh

Chất kháng sinh T-41 hoà tan vào axeton chấm bảng giấy sắc ký Waskman, chạy hệ dung môi Xác định Rf phương pháp vi sinh vật với vi sinh vật kiểm định F oxysporum Kết thí nghiêm xác định Rf hệ dung mồi là:

Hệ dung môi: n-butanol: H20 ( 84: 16 ) có Rf = 0.73 Hệ dung môi: n-butanol: a.axetic: H20 ( 1: 2: ) có Rf = 0.89

Chất kháng sinh thơ chủng D - 42 hoà tan vào etyl axetat chấm lên băng giấy sắc ký Waskman (kích thước 2x20 cm) Sau chạy hệ dung môi n - butanol: axit axetic: H20 ( : : 1); n - butanol : H20 (86 : 14); metanol: axit axetic : H20 ( : : ) Khi dung môi chạy đến điểm dừng bỏ giấy sắc ký khỏi hệ dung mỏi, để khơ tự nhiên Sau xác định Rf phương pháp hình sinh học vói vi sinh vật kiểm định F oxysporum.

Bảng 28 : Hệ sô'Rfcủa CKS D - 42 trẽn loại dung môi khác nhau.

Hệ dung môi Rf

n - Bntanol: axit axetic: H20 (2 :1 : 1)

0,81

n - Btanol: H20 (84 : 16)

0,78

Metanol: axeton: H20 ( :6 :7 )

0,11

Bảng 29: Mô R fcủa CKS D - 42 trẽn hệ dung mỏi khác nhau

Hệ dung môi L 3 Or l Oị-2 q.3 q.4 0,5 0r6 0f7 0Ị.8 0r9 ^ 0Rf

n - Bu : aa : H20 •

(1:2:1)

n - Bu : HjO « (86 : 14)

Me : aa : H20 « ( : : 1)

Hình 50 : Phổ hấp phụ tử ngoại chủng T-41

3.8.3 Xác định phổ tử ngoại chất kháng sinh

3.9 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 3.9.1 Quy trình sản xuất

Ống giơng

1

Bình nhân giống khởi động (250ml chứa 50g môi trường

nuôi cấy xốp) 5% 5 - ngày

Bình sản xuất

(lOOOml chứa 200g môi trường nuôi cấy xốp)

12 - 14 ngày

Buồng sấy (40 - 50°C)

Máy xay Đóng gói

Chè phẩm hồn thiện

S ố lượng chối lượng bào tử chề phẩm

Chúng tiến hành đếm số lượng bào tử xạ khuẩn gam chế phẩm cách pha loãng nồng độ Kết thu số lượng bào tử xạ khuân gam chế phẩm là: 3,5 x i o -ỉ- 2,4x10“ / gam chế phẩm

Khả tồn đất trồng

Sau bổ sung chế phẩm vào đất ngày chúng tỏi tiến hành phần lâp lại để đếm số lượng bào tử xạ khuẩn tồn dất Số lượng bào tử xạ khuẩn tổn tai

trong đất sau ngày là: 4,3 X 105 / gam đất. Độ tinh chế phẩm

Chung tiến hdĩih kiểm tra độ tinh Sãch CÌ chế phẩĩTi cách bổ sung chế phẩm vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn nuôi cấy nán để kiểm tra xem chế phẩm có bị nhiễm vi khuẩn nấm hay không Kết thu chế phẩm khơng có lẫn nấm hay vi khuẩn khác

3.10 TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ÚNG DỤNG

3.10.1 Anh hưởng tói khả nảy mầm hạt

Một chất kháng sinh muốn sử dụng nỏng nghiệp, lâm nghiệp ngồi việc có hoạt tính chống tác nhân gây bệnh cịn phải đáp ứng số yẽu cầu khác không độc khơng kìm hãm khả nảy mầm cùa hạt trình sinh trưởng Kết thử nghiêm ảnh hường dịch nuôi cấy chủng T - 41 đến khả nảy mầm hạt trình bày bảng 30

3.9.2 Xác định số tính chất chế phẩm

Bảng 30: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng T - 41 lên khả nảy mầm hạt (%) (sau ngày)

Loại cày

Đối chứng (Nước)

Dịch ni(%)

100 50 1

Thóc 92 87 89 96

Dưa chuột 70 53 69 78

Đậu đũa 90 0 81 62

Kết bảng 30 cho thấy: nồng độ dịch ni khơng pha lỗng (nồng độ 100%), khả nảy mẩm hạt so với nước, chí với đậu đũa nồng độ 100% ức chế hoàn toàn khả nảy mầm hạt Cịn với dịch ni nổng độ 50%, khả nảy mầm hạt bị ức chế, nhiẻn không mạnh nồng độ 100% nồng độ 1% dịch nuỏi có tác dụng kích thích nảy mầm cùa hầu hết loại hạt thí nghiệm, trừ trường hợp đậu đũa, có thấp so với nổng độ 50% chút

Kết thử nghiệm ảnh hưởng dịch nuôi cấy chùng s hygroscopicus TC5-4 đến khả nảy mầm hạt trình bày bảng 31

Bảng 31: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng s hygroscopicus TCS-4 lén khả nảy mầm hạt (%)

Loại cây

Đối chứng ( Nước)

Dịch nuôi (%)

100 50 1

Thóc 95 85 91 97

Cải thìa 85 80 78 78

Cải củ 60 58 84

Dưa chuột 72 48 70 80

Đậu cô ve 96 26 76 100

Bảng 31 cho thấy: nhìn chung dịch ni khơng pha lỗng ức chế khả nảy mám hạt cải củ đậu cỏ ve Khả nảy mầm thấp (5% 26%) so với đôi chứng ngâm nước vô trùng 60% 90% Nồng độ dịch nuỏi cấy 50% vân

kìm hãm nảy mầm hạt so vói đổi chứng Cịn nồng độ 1%, dịch QÍ có tác

dụng kích thích nảy mầm hẩu hết loại hạt thí nghiệm 3.10.2 Ảnh hưởng đến khả sinh trưởng cày

B ảng 32: Ả n h hưởng c h kháng sinh T - 41 lên tỷ lệ nảy mầm hạt thóc _ sinh trưởng mạ

Nồng độ (% ) Tỷ lệ nảy mầm (% ) (sau ngày)

Chiều dài thân (cm) (sau 10 ngày)

H20 (đối chứng) 92 4.95

100 87 2.18

50 89 3.65

10 91 4.72

2 94 5.15

1 98 5.36

Kết bảng 32 cho thấy nổng độ dịch nuôi 100% 50% ức chế manh khả nâng sinh trưởng mầm hạt thóc, nồng độ 10%, ức chế khơng cịn lớn còn nồng độ thấp ( 2% vàl% ) có tác dụng kích thích sinh trưởng (tính theo chiểu dài thân)

Chất kháng sinh TC 5-4 thơ pha vào cồn 70°c để có nơng độ 20mg/ml, sau pha lỗng tiếp nước cất đến nồng độ 10; 5; ;0,5; ; 0,01; 0,005' 0.001 (mg/ml) Thử ảnh hưởng chất kháng sinh đến tỷ lệ nảy mầm cùa hạt thóc, khả sinh trưởng mầm rễ, sau 10 ngàv Kết trình bày bảng 33

Bảng 33: Ả nh hưởng chất kháng sinh TC 5-4 tỷ lệ nảy mầm hạt thóc sinh trưởng mạ [-: khòng mọc]

Nồng độ CKS (mg/ml)

Tỷ lệ nảy mầm sau ngày (%)

Chiều dài thản sau 10 ngày (cm)

Chiểu dài rẻ sau 10 ngày (cm)

0 ( đối chứng) 94 1.60 4,0

10

-5 -

-1 20 1,35 3.4

0.5 80 1.65 3.5

0.01 83 1,70 3.95

0.005 90 1.85 4.0

Chất kháng sinh TC 5-4 nồng độ 10 mg/ml ức chế hoàn toàn khả nãnơ nảy mầm hạt thóc Chỉ nồng độ 0,001mg/ml mói có tác dụng kích thích nảy mầm thời kích thích phát triển rễ sinh truởng (tính theo chiều dài thân) Cịn lại, nhìn chung nồng độ từ 1-0,001 mg/ml đểu ảnh hường nhiều đến sinh trưởng Như vậy, qua nghiên cứu sơ cho thấy nồng độ chất kháng sinh cao ức chế khả nảy mầm hạt Các nổng độ thấp không ức chế mà cịn kích thích nảy mầm sinh trưởng Nhìn chung với nồng độ đủ ức chế nấm gây bệnh thối cổ rễ không làm ảnh hường đến khả nãng sinh trưởng

3.11 BƯỚC ĐẦU THỬNGHỆM CHẾ PHẨM t r ê n ĐồNG r u ộ n g

Từ kết nghiên cứu phịng thí nghiệm, với việc sản xuất chế phẩm tiến hành thử nghiệm chế phẩm ruộng với cộng tác Bộ môn Bệnh Nông dược, Trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ trổng vật nuỏi, Liên hiệp Hội Khoa học kỹ thuật Việt Nam Quá trình thử nghiệm chế phẩm đất trổng sơ đồ hố sau (hình 60)

Kết thu được trình bày bảng 34 35

Bảng : Kết thử nghiệm trẽn cà chua :

Tỷ lệ chết (%) thời điểm thí nghiệm (tổng sơ' cày thí nghiệm : 35, nấm gây bệnh : Sclerotium rolfsii)

^ '\ C ô n g thức Ngày N

1

Đối chứng Mexyl Rovral D-42 T-41 T viride

13/9 5,71 0,95 2,86 2,86 7,62

27/9 20,95 8,57 11,43 17,14 20,95 20,95

11/10 31,43 17,14 16,19 28,57 25,71 24,76

25/10 35,24 21,90 25,71 33,33 25,71 26,67

6/11 39,05 28,57 31,43 39,05 28,57 29,52

Bảng 35 : Kết thủ nghiệm bắp c ả i :

Tỷ lệ chết (%) thời điểm thí nghiệm

(tổng số thí nghiộm : 15, nấm gây bệnh : Rhizoctonia solani)

^ \ C ô n g thức Thời

gian

1

Đối chứng

Valiđa-myxin Rovral D-42 T-41 T viride

Sau 15 ngày

73,3 20 13,3 26,6 6,6

Sau 30 ngày

86.6 20 13,3 33,3 6,6

Những kết bảng 34 cho thấy, chế phẩm từ s antimycoticus T-41 có tác dụng diệt nấm Sclerotium roựsii cà chua với hiệu lực ngang với Mexyl, ngang với chế phẩm từ Trichoderma viride cao Rovral Đáng tiếc chế phẩm từ s viridogenes D-42 khơng có hiệu lực loài nấm này.

K ẾT LUẬN

1 Từ 31 đối tượng trổng tươi nhiễm nấm địa điểm khác nhau, thu 85 mẫu nám với triệu chứng bệnh điển hình

2 Từ mẫu bị nhiễm nấm gặp chủng nấm sau:

• Trên cày cơng nghiệp, lương thực rau: Rhizoctonia solani, Sclerotium roựsii, Fusarium oxysporum chùng nấm khác Aspergillus sp Penicillium sp., Mucor sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Syncephalastrum sp Cladosporium sp., Monilinia sp., Acremonium sp

• Trẽn ăn tươi : Aspergillus sp., Penicilỉium sp., hai loại chủ yếu, ngồi cịn có Mucor sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Syncephalastrum sp., Cladosporium sp., Monilinia sp., Acremonium sp Từ 19 mẫu đất lấy nhiều vùng khác hai tinh Bắc Ninh Nghệ An, phân lập khiết 110 chủng xạ khuẩn có 14 chùng ức chế F.oxysporum chiếm (12,73 %).

4 Từ 14 chủng kháng F oxysporum chọn chùng có hoạt tính kháng F.oxysporum mạnh nhất, chủng T - 41 chùng D - 42.

Hai chủng T-41 D-42 thuộc nhóm xám (Gy) Theo ISP, chủng xạ khuẩn T- 41 xác định thuộc loài s antimycoticus, chủng D-42 có nhiều đặc điểm giống với loài s viridogenes.

Nhiệt độ tối ưu cho sinh trường chủng T-41 28-30°C, pH tối ưu từ 6,5 đến 7,5; chủng D-42 26-28°C, pH tối ưu 7,0 -i-7,5

5 Chủng xạ khuẩn T-41 D-42 cho hoạt tính kháng sinh mạnh trẻn mơi trường A-12 Trong đó, hoạt tính kháng sinh chủng T-41 môi trường rắn (xốp) mạnh nhiều so với mòi trường dịch thể Chủng D-42 cho lượng sinh khối lớn thời với lượng chất kháng sinh tích luỹ nội bào

Chất kháng sinh hai chủng T-41và D-42 tan tốt etanol, n-butanol etyl axetat Chất kháng sinh khơng thay đổi hoạt tính xử lý nhiệt 100°c với thời gian kéo dài 60 phút Chất kháng sinh từ T-41 có phổ hấp phu cực đại bước sóng: X = 213; X = 276,5 X = 326,5.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Bộ Nông Nghiệp & PTNT (2002), Danh mục thuốc bào vệ thục vát đuơc phép sù dụng, hạn ch ế sử dụng, cấm sử dụng Việt Nam, Hà Nội

2 Nguyễn Vãn cẩn (2002), Phân lập tuyển chọn vi nấm sinh kháng sinh chống Fusarium oxysporum gảy bệnh thối rễ trổng, Luận án thac sỹ ĐHQG Ha Nội

3 Nguyễn Thị Thu Cúc, Phạm Hoàng Oanh (2002), Dịch hại cam quýt, chanh bưởi, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội.

4 Đường Hổng Dật (1969), Khoa học bệnh cây, Nhà xuất Nông nghièp Hà Nội

5 Bui Xuân Đồng, Hà Huy Kế (1999), Nấm mốc phương pháp phòng chống Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội

6 Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Vãn (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.

7 Bùi Thị Việt Hà (1998), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm phân lập từ đất, Luận án thạc sỹ, ĐHQG, Hà Nội.

8 Lê Mai Hương (1993) Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phán lập Hà Nội vùng phụ cận, Luận án phó tiến sĩ, Hà Nội.

9 Lẻ Gia Hy, Phạm Kim Dung, Bùi Việt Hà (1997), ‘Tuyển chọn chùng xạ khuẩn Streptomyces có hoạt tính cao chống nám gảv bệnh thực vât”, Tạp chí Sinh học, 19 (3).

10 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luân án phó tiến sĩ, Ha Nội

11 Phạm Bình Quyền, Lè Khương Thuý (2001), "Ảnh hường thuốc bảo vệ thực vật đến loài thiên địch sâu hại lúa Việt Nam giải pháp hạn chế", Tạp chí sinh học, (23), tr 51-59.

12 Lê Lương Tề (1977), Bệnh cây, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội.

13 Lẽ Lương Tề (1997), " Nghiên cứu tác động cùa số yếu tố ngoại cảnh thuốc hoá học đến sinh trưởng phát triển Fusarium solani (Mart) Sace" Tạp chí chuyên ngành bảo vệ thực vật, (154), tr 19-22.

14 Nguyễn Văn Tuất, Lê Vãn Thuvết (2001), sản xuất, chế biến sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc sinh học, Nhả xuất Nông nghiệp, Hà Nội. 15 Nguyên Thị Ty, Lê Văn Thuyết, Lẻ Minh Thư (1997), Nghiên cứu thành phần

bệnh héo lạc nấm Aspergillus flavus sinh độc lô aỷlatoxin lạc miên Bác Việt Nam 1991-1995, Trường ĐH Nông Nghiệp I , Hà Nội.

TIẾNG ANH

16 Berdy J (1974) "Recent development in antibiotic reseach and classiíicẳon of antibiotic according to the chemical structure , Advance in Applied Microbiology, 18, pp 309-406

17 Bugress L w , Liddell C.M Summerell B.A (1998), Laboratory manual for Fusarium research, 2nd Edition, University of Sydnev, Australia, p 136.

19 Demain A.L (1974) "How antibiotic - producing núcroorganisms void suicide?", Annuals o f the New York academy o f Science 235 pp 601-602

20 FAO yearbook - Production (1994), 7, p 43

21 George N.A (1989), Plantpathology, Academic press , INC London Svdney Tokyo, Toronto, p 408 - 11

22 George N.A (1991), Plantpathology 3rd Edition, Academic press INC London Sydney, Tokyo, Toronto, p 321 - 27

23 Howell c R (1989), "Relevance of mycoparasitism in the biologicai control of Rhiioctonia solani by Gliocladỉum virens", Phytopathology 77 p 990 - 4

24 Hopwood D.A, Merrick M J (1997), "Genetics of àntibiotic production" Bacteriol, pp 41,596- 636.

25 http://bioscixbs.umn.edu/asire/protocol/isolation.html

26 Hutson D.H, Miyamoto J (1998), Tungical Activity", pp 57 -59 27 Klein, p H (1999), Microbiology, Chapter 24, pp 516-518 Fourth edition. 28 Klein, p H (1993), Mỉcrobiology, Chapter 16, pp 383-396 Second edition. 29 NHMRC (2001), "Antibiotics in Agronomy and Horticultute"

nhmre.webmaster@heath.gov.an

30 Nonomura H (1974), J FermentTechonl„ Vol 52, No 2, pp 78-92.

31 Persley G.J, De Langhe E.A (1987), Sumarỵ o f dỉsscussions and recommendation in: Banana and plantain Bressding Strategies, Autralian Centre for International Agricuteral Research (ACIAR), 21, p 11-17

32 Puhalla J.E (1985), Classification o f strains ofFusarium oxysporum on the basis o f vegetatative compatibility, Autralian Centre for International Agricuteral Research (ACIAR), 24, p 135-45

33 Porter N (1995), "Culturas conditional for antibiotic- producing microoganism" Methods in emymology, Vol XVTII, pp 3-23.

34 Robson G.D, Kuln P.J, Trinci A.P.J (1989), "Effect of validamycin A on the production of cellulose, xylanase and polygalacturonase by Rhizoctonia solani", J Gen Microbiol, 135, p 2709 - 2715.

35 Schaller A, Ryan C.A (1995), “ Systemin - a polypeptide deíene signal on plants”, BioEssơys, 18, p 27 - 32.

36 Shen, V Ch (1992),"Development and aplication of agricultural antibiotic Jiangmicin in China" FAO regional consuilation on biological control o f planí diseases, Hangzhau, China.

37 Sherling E B, Gootleb D (1996), "Method for characterization of Streptomyces species", Intera, J Syst, Bact, pp.16, 313-350

38 Subrahmanyam p, Wongkaew s, Reddy D.v, Demski J.w , McDonald D, Sharrma S.B, Smith D.H (1992), "Field Diagnosis of Groundnut Disease", ICRISÂt, 47, p 48 - 58.

39 Takeuchi, s., K Hirayama, K Ueda, H Sakai and H Yonehara (1985), "Blasitidin s, a new antibiotic", J Antibiotic XV (1): 1-5.

40 Tongchai Kampee, Phuripun Leelasuleetham, Charan chettanchitara (1995), Antibiotic Production o f Actinomycetesin Foresi Termite Soil.

41 Tresne H D, Buckus E J (1963), "System of color wheels for Streptomyces taxonomy" Appl Microbiol 11, PP- 335 - 338.

42 Vance c.p , Shenvood R.T, Kirk M.N (1997), "Ligmíication as a mechanism of disease resistance", Annu Rev Phỵtopathology, 18, p 1^9 - 258.

44 Yuanbo (1992), "Development of biological control of plant diseases in Asisa paciíic region”, FAO Regional expert consuiation o f plant diseases, China. 45 Yamaguchi (1998), "Natural product - derived íungicides as exampliíied by the

antibiotic", Fungicidal Activity, pp 57-79.

PHỤ LỤC

Phổ hấp thụ tử ngoại chủng TC 5-4

ABS NM 5

ABS 4 NM 2 4

ABS NM 7

„ Samp.Kl/Gs Koong Apr 2003 A Í Í 2 Q Q

3 U L D Ga in 109 SBU 2.0 <lo \ 4

2 0 0 0 8.0 00 360.0 100.0

ABS : 0 0 - > 4.0 000 nrt : 20 0.0 -> 100.00

Ba se lin e E se Uieu R e - s c a l c Zoom Labcl More

TRUNG TÂM KHOA HỌC Tự NHIÊN V À CÔNG NGHỆ QUỐC GIA

NATIONAL C EN TRE FO R NATURAL SC IEN C E AND TECHNOLOGY OF VIETNAM ISSN 0866-7160

t p c h í

SINH HỌC

ĩournal of Biology

MỘT S Ố C Ơ N G TRÌNH NGHIÊN cứu CỦA KHOA SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN, ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TẬP 25 - SỐ 2A THÁNG 6-2003

25(2a): 85-91 Tạp chí SINH HỌC

6-2003

TACH CHIÊT CHAT KHÁNG SINH TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN

STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS ĨC5-4

CÓ HOẠT TÍNH C AO CHƠNG NẤM GÂY BỆNH

KIỂU HỮU ÀNH, PHẠMVÃN TY, LÈ GIA HY BÙI THỊ VIỆT HÀ, NGUYÊN THANH HUYÊN

T rường đ i h ọ c K hoa liọc tự nhiên D H Q G H N

Chùng xạ khuẩn TC - dã phẫn lập từ đất vùng rễ hổ tiêu huyện Xuyẻn Mộc, tinh Bà Rịa - Vũng Tàu xác định thc lồi Streptom yces hygroscopicus theo mơ tả Chương trình xạ 'khuân quốc tế Chủng này có hoạt tính chống nám cao, đảc biệt la nám Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rể nhiều loại trồng.

I PHƯƠNG PH Á P N G H IÊN c ứ u

1 Đặc điểm phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) [ 1, 2, 5].

2 Hoạt tính kháng sinh đuợc xác định theo phuơng phap khuyếch tan trèn thạch.

3 Lên men đuợc tiến hành lên men 51 Marubishi, Nhật Bản.

4 Phương pháp tách chất kháng sinh (CKS) dung môi hữu cơ.

5 Phương pháp tách chiết CKS chất hấp phụ (theo phương pháp Umezawa 1975) [7]

6 Phương pháp tách chiết CKS bảng ưao đổi ion [7 ]

II K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Tách chiết tinh chè CKS TC 5-4

a) Tá ch ch iết C KS dung m ói hữu cơ

Sau men 220vòng/phút ngày m ồi truờng có thành phẩn sau (g/1): g lucoza 22, bột đâu tương 10, NaCl CaCO , (N H 4)2S 2, dịch nuòi cùa chùng xạ khuán

S irep to m yces liygroscopicus TC 5-4 dược lọc

ch ia thành phấn: dịch lọc sinh khối Tiến hành chiết rút CKS từ dịch lọc bầng n- butanol, từ sinh khối bầng áxeton ỡ pH 10 (bảng 1) K ết cho thấy: pH CKS dịch lọc sinh khối đểu có hoạt tính hản pH pH 10 Tuy nhièn, pH cho hoat tính cao p H 10 đôi vhút

Các loại dung môi hữu khác dùng đ ể chiết CKS từ dịch lọc cùa chùng TC5-4: n- butanol, izo-am ylalcohol, n-propanol, toluen clorophoóc, từ sinh khối: axeton etyl axetat, etanol, m etanol, izo-propanol, izo-butanol butanol K ết trình bày bàng

Báng 1.

Hoạt tính kháng sinh dịch ni chúng xạ khuẩn TC 5-4

N g u ổ n c h iết pH H oat tính kháng sinh (D -d.m m )

B sub tiỉis \ F oxvsporưm

Sinh khối

3 15 í 21

7 26 í 33

10 15 32

D ich loc

3 18 19

7 20 ' 21

10 20 21

TẠP CHÍ SINH HỌC

T ổ n g bién lập ĐẶNG NGỌC THANH

P h ó lổng bién lập : NGUYỄN TIẾN BÂN LẺ XUÂN TÚ

HỘI ĐỒNG BIÊN TẬP

NGUYỄN TÁC AN, ĐÁI DUY BAN, LÝ KIM BÀNG, NGUYỄN TIẾN BÂN, ĐOÀN CÀNH, v ũ QUANG CỎN, PHAM THỊ TRÁN CHÁU, NGUYỄN LÂN DŨNG, NỎNG VÀN HÀI, TRUƠNG NAM HÀl, ĐẶNG HUY HUỲNH, NGUYẺN ĐẢNG KHỎI NGUYỄN THỊ LÊ, PHAN KỂ LỘC NGUYỄN TÀI LUONG LÊ THỊ MUỘI, NGƯYẾN HŨU p h u n g, t r ầ n

DUY QUÝ, NGỎ KÉ SUƠNG ĐÀNG NGỌC THANH, DUƠNG ĐÚC TIẾN LÊ XUẢN TÚ, NGUYỄN VÃN UYỂN

Thu kỷ tòa soạn Trần Thanh Nga

25(2a): 85-91 Tạp chí SINH HỌC

6-2003

T A CH CHIET CHAT KHÁNG SINH TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN

STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS T C 5-4 C Ĩ HOẠT TÍNH C A O CHỐNG NẤM GÂY BỆNH

Chủng xạ khuẩn TC - dã duợc phản lập từ đất vùng rễ hổ tiêu huyện Xuyên Mộc, tinh Bà Rịa - Vũng Tàu vả xác định thuộc lồi Streptom yces hygroscopicus theo mơ tả cùa Chương trình xạ -khuàn quốc tế Chủng này có hoạt tính chống nấm cao dạc biệt nám Fusarium oxysporum gày bệnh thối cổ rễ nhiều loại trổng.

I PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN u 1 Đặc điểm phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) [ ,2 ,5 ]

2 Hoạt tính kháng sinh duợc xác định theo

phuơng phap khuyếch tan ưẻn thạch.

3 Lẻn men tiến hành men 51 Marubishi, Nhật Bản

4 Phương pháp tách chiết chất kháng sinh

(CKS) dung môi hữu cơ.

5 Phương pháp tách chiết CKS bẳng chất hấp phụ (theo phương pháp Umezawa 1975) [7]

6 Phương pháp tách chiết CKS ơao đổi ion [7 ]

IỌỂU Hữu ÀNH, PHẠMVẢN TY, LÈ GIA HY BÙI THỊ VIỆT HÀ, NGUYỀN THANH HUỸỂN

Trườìig đại học Khoa học tự nhiên DHQGHN

II KẾT QUÀ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết tinh chếCKS TC 5-4

a) Tácli chiết CKS bâng dung mòi hữu ca

Sau lên m en 220vịng/phút ngày

trong mởi trường có thành phẩn sau (g/1): glucoza 22, bột đậu tương 10 NaCI 5, CaCO, I (NH4)2S0 4 2, dịch ni chủng xạ khn

Streptomyces liygrcopicus TC5-4 lọc

c h ia thành phần: dịch lọc sinh khối Tiến hành ch iết rút CKS từ dịch lọc bầng n- butanol,

từ sinh khối âxeton pH 3, 10 (bàng

1) K ết cho thấy: pH CKS dịch

lọc sinh khối dểu có hoạt tính hẩn

pH p H 10 Tuy nhiẻn p H cho hoạt tính

cao pH 10 đơi whút.

Các loại dung m ịi hữu c khác dùng đ ể chiết CKS từ dịch lọc cùa chủng TC 5-4: n- butanol, izo-am ylalcohol n-propanol, toluen

clorophoóc, và từ sinh khối: axeton etyl axetat, etanol, metanol, izo-propanol izo-butanol butanol K ết quà trình bày bảng

B àng 1.

Hoạt tính kháng sinh dịch nuòi chủng xạ khuẩn TC 5-4

N g u ổ n c h iế t pH H oat tính khání sinh (D -d.m m )

B su b tilis F o xysp o ru m Sinh khối

3 15 21 ỉ

7 26 33

10 15 32

D ic h Ioc

3 18 19

7 20 21

10 20 21

H o t tín h k h n g sin h c ủ a c h ủ n g x k h u ẩ n T C -4 đư ợ c c h iế t b n g c ác loại d u n g m ói k h c n h a u

Bàng 2.

Nguồn ch iết D ung mỏi

H oại tính k h án g sin h ( D -d m m )

B subtilis F o x ysp o ru m

Sinh khối

A xeton 30 35

E tyl-axetai 15

E tanol 30 42

M eianol 30

Izo-butanol 22 22

n-butanol 30 10

lzo-propanol 10

D ịch lọc

n-butanol 10 23

Izo-am ylacohol 20 25

n-propanol 15 24

T oluen 15 23

G o ro ío c 15

K ết ghi bảng cho thấy CKS nằm cà sinh khổì dịch lọc, chúng tích luỹ sinh khối nhiẻu D ùng m etanol d ể chiết C K S sinh khối sê cho hoạt lực m ạnh T u y n hiên, d o eianol có khâ nảng chiết dược C K S chi sau m etanol

d ể thuận lợi vể k in h tế, c h ú n g tối d ù n g etanol dể tách chiết CKS tro n g sinh khối cù a c h ủ n g TC 5-

H oạt tính k h n g sin h d ịch lọc C hiết izo -am y laco h o l [oluen c h o hoạt tính m ạnh d u n g m ỗi c ò n lại

;

H ình I Khá nủng kháng nấm F'usarium oxyspnrum cùa c h ù n g xạ k h u ẩ n T C 5-4

b) Ảnh hưởng cùa nhiệt độ đến hoạt tính kháng sinh

K h ả n ăn g b ền vũ n g với n h iệt đ ộ c ủ a CKS TC -4 đư ợ c trìn h b ày b ản g Ở n h iệt đô 3Ơ’- 40°c, h o t tín h k h n g sin h khá m ạn h D u n g dịch kháng s in h k h i g iữ n h iệt đ ộ 6Ò°C k éo dài 60

p h ú t'c h o hoạt tính hầu n h u k hông thay đổi Khi g iư 80 c, hoạt lực kháng sinh giảm chút sau -4 phút N hư ng 100°c và kéo d tới 60 phút, cịn hoạt tính kháng sinh khoảng 50% D o dó, việc tách chiết, sử dụng bao qu ản CKS phải nhiệt độ không 60“c đê đảm bảo hoạt lực củ a CKS

Báng 3.

Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn TC5-4 (vi sinh vậe kiểm định F oxysporum)

Nhiệt độ °c

T hời gian x lý (phút)

10 20 40 60

H oat tính k h án g sinh (D -d jn m )

30 4 40 40

4 40 40 40

6 42 39 38

80 40 35 35 30

100 34 32 20

c) Tácli c h iế t b ằ n g c h ấ t h ấ p p h ụ

L ọc d ịc h n u ô i c ấ y đ ể loại bò sin h k h ố i, rổi bổ su n g 2% than hoạt tính vào dịch lọc chinh pH 3,7,10 L ắc o n g g iờ d u n g m ô i h ữ u (axeton) K ết q u ả trìn h bày bảng

B àng 4.

Khả hấp phụ CKS TC 5-4 than hoạt tính (Vi sinh vặt kiểm định B subtillis)

N g u y ê n liệu c h iế t

Đường k ín h vịng vị k huẩn (D -d, m m )

pH

3 10

D ịc h lọc sau x lý

th a n h o a i tính 0

0

G iả i h ấ p p h ụ th an hoạt

tín h b ằ n g a x eto n 36

36 42

(đ ố i c h ú n g : d ịch lọc n g u y ên 25m m )

K ết q u ả b ả n g c h o th th an hoạt tính có phù hợp cho việc giai hảp phụ CKS ưong thề' h ấp p h ụ rấ t m n h CKS, d ịch lọc sau than hoạt tính báng axeton

xừ lỵ th a n h o t tín h k h ò n g c ò n k h ả nân g kháng d S đ ó lê c h chiết n n h ché c K S T C 5-4

k huần A x e to n c ó thể g iải h ấp phụ C K S từ

than h o t tín h , c c p H h o ạt tính kháng T rẽn sò k ết q u ả d â nghiên cúu chúng sin h t h â ĩ h o n p H 10 h a y noi c c h k h ác p H ĩ o tơi tháy q u y trình tách chiết CKS cua chùng s

hygròscopicus T C -4 thực theo sơ

đổ thích hợp k in h tê'

đ ) N ó n g độ ức c h ế tố i tliiểu (M IC )

N óng độ ức c h ế tối thiểu cùa CKS TC 5-4 đói với F oxysporum là: dung m ổi hồ tan cón 70" M IC 6.4 |ig /m l: nuớc M IC 1.5 H g/m l

N hư vặy, dùng nước để hoà tan CKS hoạt tính kháng k huẩn cao hồ tan ưong cón (gấp lán)

2 Một số dạc điểm sinh học CKS TC 5-4

a ) Ả nh hường C K S T C -4 tớ i k h ả nảy m ám cù a hạt

M ột C K S m uốn dược sử dụ n g o n g nơng, lâm ng h iệp , ngồi việc có hoạt tính m n h chóng tác nhản g ãy bệnh, phải ch ất k h ố n g dộc với n h u k hông ảnh hườ ng tới k h ả nàn g nảy m ầm cùa hạt trình sinh ư n g cùa K ết th n ghiệm ảnh hường củ a dịch nuồi cáv chùng T C 5-4 đ ến khả nân g n ày m ám cùa hạt dược trình bày b ản g

B n g 5.

Ảnh hưỏng dịch nuôi cấy lèn khả nâng mẩm hạt (%)

Loại hạt cùa

Đ ối chứng (nước)

D ich n u i (% )

100 50

Thóc 95 85 91 97

Cải thìa 85 80 78 78

Cải cù 60 58 84

Dưa chuôi 72 48 70 80

Đ ảu có ve 96 26 76 100

T rong bảng 5, la thấy nhìn chung dịch ni khổng pha lỗng (nổng độ 100% ) ức c h ế khả nảng nảy m ám cùa hạt; cải cù đậu có ve, hầu nh khả nâng nảy m ám lả lì (5% 6% ) so với dối chứng ngâm o n g nuớc vồ trùng 60% 96% nổng đ ộ dịch nuỏi cấy 50% kìm hãm nảy mầm cùa hạt so với dối chứng C òn ỡ nỏng độ 1%, dịch nuỏi có tác dụng kích thích mầm cùa hầu hết loại hạt thí nghiệm Như vậy nống độ dịch nuôi th ấp % làm tăng tỷ lệ nảy m ám cùa hạt

b ì Ả nh hưởng C K S T C -4 đ ến kh sinh trưởng cùa cày

C K S T C 5-4 thố pha vào cổn 70" để có nơng độ 20m g/ml sau pha lỗng tiếp bàng nước cất đến nóng độ 10; 5; 1; 0.5; 1; 0.01; 0.005; 0.001 (mg/ml) Thừ ảnh hường cùa chất khang sinh ciẽn tỷ lc- nàv mảm cùa hat thóc, khả nàng sinh trường cùa mầm rẻ sau 10 ngày Kớt quà dưnc trình hay báng 6.

s s

CKS T C 5-4 nổng đ ộ 10 m g/m l ức c h ế hoàn to àn khả nàng nảy m ám cù a hạt thóc Chỉ n g độ ,0 m g /m l m ới có tác dụng kích thích nảy m ầm hạt, đ ó n g thời k ích thích sụ phát triển cùa rễ sin h tru n g (chiều dài thân) C ịn lại, nhìn c h u n g nóng đ ộ tù -0.005 m g/m l đéu ản h hườ ng lì nhiều dến sinh ư n g cùa cảy N h vậy, qua n ghiên cứu sơ ch o th , nồ n g đ ộ CKS cao ức c h ế khả nàng m ấm cù a hại T u y nhién nóng độ th ấp k hổng n h ũ n g k h ố n g úc chế m cịn k ích th ích nảy m ầm củ a hạt sinh trường cù a cảy N hìn c h u n g với n g dộ đù úc c h ế nám g ẫy bệnh thối có rẽ khống ảnh hường đến khả nãng sinh trư ng

3 Thâm dò khả nâng kháng nám gây bệnh

d a n iém m c th n g g ậ p ng i

T heo thố n g ké cùa V iện d a liễu V iệt Nam bẽnh vi nấm thường g àp bệnh nhân nám da, vảy róng, nấm tóc, ch n g tó c thuộc chi T n c o p h y in n góm loài T rubrum

N m g a y b ệ n h n iêm m c m iệ n g , ỉ m đạo nh c albìcans, c tropicalis h a y g ặp bệnh nhân c ố s ự s u y g iảm h ệ th ố n g m iễn d ịch , dái đuờng

Đ ể th ăm d ò k h ả n ăn g k h n g n ấm gảy bệnh

c “ a CKS TC 5-4, buớc đẩu thừ ng h iệm in vitro phucmg pháp khuếch tán tren chạch VỚI chủng nấm hay gập dã n iêm m ạc Bàng m inh họa cho thí nghiệm

- R a n c lần

- H o sin h k h ố i vảo ethanol 70% , c h in h p H đ ến -

- K h u ấ y liè n tục nh iệt độ phòng (L ặ p lại đ ế n lẩn)

- BỔ sung butanol (tỷ lệ 4/6)

- C hinh pH đến 7-8 (L ặp lại đến lẩn)

H ìn h Sơ đ ổ tác h c h iế t v tinh c h ế CKS chùng S treptom yces h y g ro sco p icu s T C 5-4

Ảnh huờng CKS TC 5-4 tỳ lệ nảy mầm hạt thóc sinh trường cảy mạ

Bảng 6.

N ống độ CKS (m g/m l)

Tỳ lệ m ầm (% ) (sau ngàv)

C hiều dài thản (cm ) (sau 10 ngày)

C h iều dài rễ (cm ) (sau 10 n g ày )

0 ( đói chúm? ) 94 1.60

10

5 _

-1 20 1.35 3,4

0.5 80 1.65 3.5

0.01 83 1.70 3,95

0.005 90 1.85 ,0

0.001 97 1.85 4.2

(-): không mọc

B àng 7.

Khả nâng ức ché nảm gảy bệnh da CKS TC 5-4

C hùng náin CKS T C 5-4 (5% etanol) (đường kính vịng vơ khn D -d, m m )

T m entagropliytes 44

T rubrum 25

c aìb ica n s 19

c Iropicalis 23

D ung m ôi

Bảng cho thấy C K S T C 5-4 dểu có khả năng kháng nám gãy bệnh, đặc biệt lả k háng T

m eniagrophyies m ạnh (kích thước vịng vố

khuẩn 44 m m)

Đ ê xác định nóng đ ộ ức c h ế tối thiểu cùa CKS T C 5-4 dối với loại nấm nêu ẽn , chúng tối tiến hành thí nghiẹm bảng phương pháp pha loãng CKS vào m ôi iruờng nuồi cấy nấm trén óng thach nghiêng Kết quà xác định dược nóng dộ ức ch ế tối thiểu cu thể nhu sau:

T m enĩagrophytes 0.1

T r u b r u m 0 ~>c!c c alhican.', 29c

c n o p i c a h s ] 'Tr

Q(|

D o CKS T C 5-4 chư a đư ợ c c ố d ặc tinh c h ế dạng khô nên c h ú n g tổi p h a lo ãn g theo

'nồng độ %.

Nước ta nước có k h í h ậu n h iệt đới nóng ẩm thích hợp ch o vi nấm p h t triể n d o đ ó việc phái xạ k huẩn có k h ả n ả n g k h n g nấm gáv bệnh có ý nghĩa

III K Ế T LUẬN

Chùng xạ khuẩn T C -4 dư ợ c p h n lập từ đất trổng tỉnh Bà R ịa - V ũ n g T u , c ó k h ả nảng chóng nám F u sarium o x y s p o ru m g v b ện h thối cố rẻ irổng Dựa th e o m ố tả củ a ISP, chung, xác đ ịn h th u ộ c loài

C h ất k h n g sin h c ù a c h ủ n g S tre p to m yc es

liygroscopicus T C -4 tan n h iều tro n g c ác dung

môi: ax eto n , eta n o l m etan o l n-b u tan o l Chất kháng sinh bền <60° c 100"c 60 phút, h o ạt tính chi cị n 50% M IC c ù a du n g dịch kháng sinh tan nước Fusarium

o xysporum l,5 |ig /m l n n g d ộ 1% C K S T C

5-4 k ích th ích s ự n ảy m ầm củ a hạt N goài khả năng c h ố n g F u sa riu m o x ysp o ru m g ảy bệnh thỏi cổ rẻ c â y trổ n g , C K S T C 5-4 cò n ức c h ế m ạnh cả nấm gây bệnh cho người Tricoplyton

m en ta g ro p h ytes, T ru b ru m , C a n d id a albicans.

TẢI UỆƯ THAM KHẢO

1 The society for Actinomycetes Japan

1987: A tlas o f A c tin o m y c etes

2 Nakase F T D „ 1989: Japan collecúon o f m icroorganism s - catalogue o f strains íourth edition, Tokyo

3 L iew c w et a l„ 1998: Isolation of A ctinom ycetes from soil and screeninơ for presence o f bioactive substances produced b ay them : 155-170

4 S h e rlin g E B a n d D G o ttlie b 1966: Intem J Syst Bact., 16: 313-350.

5 T r e s n e r H D a n d E J B u ck u s, 1963: A ppl M icrobiol., 11: 335-338

6 VVaksman s A., 1961: Q assiíicatio n identification and description o f genera and species T he A ctinom ycetes, Vol The VVilliams and W ilkins Co., Baltimore

7 U m e za w a H and s K o u d o , 1975: M ethods in enzym ology, 18: 262 - 278

EXTRACTION O F ANTIBIOTICS FROM THE STRAIN STREPTOMYCES

HYGROSCOPICUS T C 5-4 WITH HIGH ANTIFUNGAL ACTIVITY

KIEU HUU ANH, PHAM VAN TY

LE GIA HY, BUI VIET HA, NGUY EN THANH HUYEN

SUM M ARY

T h e strain T C -4 , iso lated fro m cu ltivated soil o f B aria - V ungtau province, has high activity against F u sa riu m o x ysp o ru m c au s in g root rot in plant Based on International Streptom yces Prọịect (ISP), th is strain T C -4 is id en tiíĩe d as an one o f Streplornyces hygroscopicus.

T h e an lib io tic o f the S tre p to m vc es liygroscopicus strdin TC 5-4 is m ore dissolved in: axeton, etanol, m eta n o l, n -b u tan o l than in o th er solutions

T h is an tib io tic is stab le at temperature < 60"C; at I0 "c for 60 min, its activitv reduces to % For F u sa riu m o x ỵs p o ru m , the M IC o f this an tibiotic solution dissolved in w ater is 1.5 |Ag/ml At nc co n ce n lra tio n this an tib io tic c an stim u la te the germ ination o f the grain

T h is an tib io tic can also in hibit the grovvth o f fungi causing hum an diseases, such as:

T ric h o p liy to n m eiila g ro p h vtes, T n ib n im , C andida albicans.

N g ù v n l i n b ù i : - - 0 2

25(2a): 92-98 T ạp c h í SIN H H Ọ C 6-2003

SINH TỔNG HỢP PROTEAZA NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS

TRÊN CÁC MỐI TRƯỜNG NUÔI KHÁC NHAU

Proteaza ngoại b o từ B acillus chiếm vị trí đặc biệt o n g số enzym từ vi sinh vật Trên th ế giới, chúng sàn xuất công nghiệp với khối luợng lớn [8] Vé phương diện sinh lý sinh thái, loại vi k h u ẩn rãi da dạng gồm nhóm : ua ấm , u a nóng, ưa kiềm , ua trung tính ưa axít [7], d o d ó chúng đáp ứng yêu cẩu rát k h ác [4] Cụ thê, enzym dã dược d ù n g o n g công nghiệp chái tẩy rủa [9], o n g xử lý tơ tâm [1], xừ lý phim ảnh [6], xừ lý chát thải [10] RiỀng subtilisin từ

B acillus su b tilis dã dược dù n g n h m ột m hình

d ể nghiẽn cứu cáu trúc chức nâng cuả proteaza [4]

Ở V iệt N am o n g m ột n ghiên cứu ưước đây [5], thấy B acillu s phân bỗ' rát rộng da sơ' chủng phân lập dược có khả nâng sinh proteaza ngoại bào T rong n ghiên cứu này, chúng tơi tìm hiểu khả nảng sinh proteaza ngoại bào cùa chùng m ạn h d ã dược tuyển lựa, m ói trường nuói khác Bằng xử lý th ông kê m ô tả p h ân tích đ a nhân tố, tiến tới xây d ụ n g m hình tối ưu ch o việc xác lập hệ m ôi trường tốt ch o chùng o n g sản xuất

I PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 1 Các chùng B a cilìu s phản lặp tuvên chọn n g h iên cứu trước [5]

2 Các mỏi trường nuỏi để m en dịch thể sinh lổng hơp proteaza ngoại bào có thành phán

như sau (g/1):

Mối ưuờng M T 1: Saccaroza 3,0; pepeton 2.0: cascin 2.0; ( N H j ; H P O , 0.38: K C I 0.2; K:HPO, 0.1 ZnSO, 0.001: Caò; 0.001

NGỔ Tự THÀNH, CHU VÃN MẪN, vủ THỊ MINH ĐỨC

T rường đ ại h ọ c K h o a h ọ c tự nliiẻn, Đ H Q G H N

M ôi u n g M T 2: pepeton 5,0; c a o n ám men 0,5; glucoza 5.0; N a 2H P 4.7 H 20 ,0 ; K HịPO,

1.5; MgS04.7H20 0.2: C a ã 0,02; FeS04.7H:Õ

0,001.

M ôi trư n g M T 3: tinh b ộ t 3,0: cao n ám men 2.0; casein 2.0; (N H 4)2H P 1,2; M g S O , 7HjO 0,05; C a Q , ,1 ; KC1 0,15

M ôi trư n g M T 4: pepeton 5,0; cao n ấm men 2,0; casein 2,0; cao thịt bị 1,0; N aC l 5,0

M trư ờng M T 5: sữa g ầ y 1,0; p ep to n 0.05; c ao nám m en ,0 ; N a2C , 1,0

M ôi ư n g M T 6: K 2HPO„ 0,5; M gSO, H ;0 0.01; F e S H ,0 0,0 ; C aC l, H ,0 10.Ò; N H 4Q 0,1; Sưa gầy 10,0

M ói trư n g M T 7: pepeton 10,0; c a o thịt bò 5.0; NaCl 5,0

M ồi trư n g M T H: pepeion 5,0; c ao nấm m en 0,5; g lu co z a 10,0; K H 2P 2,0; M g S H 20 0.2; C aC l2 ,02

M ôi ư n g M T N A : p epton 5,0; c a o thịt bò 3,0

M ối ư n g M T T : bột đ ậu tương 2,5; tinh bột 3,0; (N H 4)jH P 0,09; C a C O , ,1 ; M g S 7HjO 0,05; K ầ ; Q a H 20 0,01

T R U N G T Â M K H O A H Ọ C T Ự N H IÊ N V À C Ô N G N G H Ệ Q U Ố C GIA T Ạ P C H Í SIN H H Ọ C

TẬP 25 - S Ố A 6-200?

MỤC LỤC

1 NGUYỄN XUÂN QUÝNH, iNGUYÈN THỊ MAI

Đ án h g ia c h ả t ỉuợ ng nưoc sổng N h u ệ băn g việc sử dụng đông vàt khỏng xương sống c ỡ lớn làm sin h vật c h i thị

2 LÊ THU HÀ

Đ án h giá c h ấ t lượng m ỏi trường nước suối T am Đ ào, sổng Vực T huyền sịng Cẩu Tơn sơ n g Cà L ổ b ằ n g phư ng pháp phân tích m a trận

3 VŨ TRUNG TẠNG, NGUY ẺN XUẢN QUÝNH

Q u ản lý đ a d n g sin h học nguồn lợi sin h vật cù a vùng cửa sông thuộc chàu thô bác ch o p h át triể n vững (lấy cửa Bả L ạt lm vớ d)

ôã NGUYN XUN HUN, NGUYấN VIT CƯỜNG, THẠCH MAI HOÀNG

K ết q u ả ban đ ẩ u thàn h phẩn loài cá vùng đệm K hu bào tổn thiẻn nhièn Bà Nà (th u ộ c xã H o Bắc, h u y ện H oà vang, th àn h phò Đ Nẩr.g)

5- L Ê VŨ KH Ổ I

Đ a d ạn g th n h phán loài thú cùa khu vực Bà N à, thành phố Đ N ẵng

6 NGUYỄN VÁN QUẢNG

H loài m ố i m i thuộc giống M a c ro term es H olm gren (isoptera, M acroterrm itinae) V iệt N am

7 BÙI CÔNG HIỂN, NGUYẺN VÃN QUẢNG, NGUYẺN THỊ MY

K ết quà đ iều a th àn h phần loài m ối (Iso p tera) cùa Vườn quốc gia Ba Vì, tinh H Tày

8 NGUYỄN THỊ KIM THANH

T h p h àn tích m ối q u an hệ phái sinh c h ù n g loại cùa tông [rong phàn họ Me (P h y llan th o id ea e) th u ộ c họ T háu dầu (E u p h o rb iaceae) Việt Nam bầng phương pháp to án học

9 L ir u LAN HƯƠNG, NGỔ QUANG D ự

X ây dựng p h ần m ềm q u àn lý sờ liệu vé đa dạn g sinh học cho m ột sò hó Hà Nội

10 ĐÀO THI LƯƠNG, PHAM VÂN TY, NGUYẺN lándũng, MASAKO TAKASHIMA, TAKASHI NAKASE

I B u lle n vietìia ììiicu sp nov., m òt loài nấm m en sinh bào từ băn phàn lập ơ

V iệt N am

11 TRẦN VÃN TUẤN KIỂU Hữli ẢNH Đỏ MINH PHLONG

Phàn lập tuyẽn chọn chủng vi sinh vặt có nâng phàn giai chat diet eo _.4 - D. p NGUYỄN ĐÌNH QUYỂN vũ THI MINH ĐƯC, TRẤN THI LAN PHI ONG NGUYEN TL'AN

TẠ THỊ NCHỈA HÀ LẼ THI LAN OANH

Phân lập tuyển chon VI khuẩn B a c i l l u s sp có hoai tính kháng nám móc gãy thói qua

sau thu hoạch

Tran ẹ 1-6 7-11 12-20 21-26 27-32 33-41 42-50 51-58 9-63 64-71 72-77

KlÉr h ítành phamvanty lêgiahy buthiviètha ngưyẻnthanh HVYỂN

Tach chiết chái kháne sinh lư chung xa khuáir S t c p t o m ỵ c m y c e s h y g r o s c o p i c m T C -4 có hoat linh cao chón:: nám gá> bệnh.

- NGƠ Tl THANH CHI \ AN MẪN v i THI MINH Đl c

Sinh tónr hợp proteaia ncoại bào cùa B a c i l i i i i tri]] mói trường nuói khac nhau. NCU VẺN THI CHINH L\ NGOC OANH BU THI VIẼT HA

Mói số bệnh nám Zà' hai cho cáv lúa cáv vài 'à khả ức ché chóng bệnh nám cua

M khuán

1< PHAN TIẢN NGHĨA SOI VEN THI MAI PHI ONG ROBERT E MARQUIS

Cơ ché lác dụng cùa neroxit hvđro vi khuán gáy sâu răn g S tre p to c o cc u s m uta n s.

1" NGl VẺN QUỐC KHANG

Khá nàng diét sáu hai băng ché pham khai Ihác từ th ảo m ộc có V iệt N am

It TRẤN THI LONG DOÃN ĐINH HOANG NGUYÊN Ql ố c KHANG

Thàrr dò phương phap tach chiẻi khả nâng ứní; dụng vài chất thú sinh cùa neem iA z u c J ir a c ln a Iitih c ii A Juss.) làm thuốc trư sáu hại

Ir NGITẺN THI QUV NGl/YẼN QUỐC KHANG

Đác tinh hóa - lý cùa cac hợp châi tự nhién chiẽt rút từ seo gà P i e r i s s e n s i f o r m i s Burm F.

20 TRINH ĐINH DAT PHAM VAN LẬP NGỎ THI HOAN NGUYÊN VAN SÁNG, ĐINH NHO THÁI

Nghién cứu hệ isozym nhầm góp phán phân loại m ột số lồi m i ong

: i v í VÁN v u T R Ấ N Dl C H I C H I VÀN MÁN L É HÓNG Đ IÊ P , K H Ú C T H I AN

Nghién cứu biẽn động mói số chi tiêu sinh lý cùa tiếp cốt th ảo (S a m b u c u s

ch inensiì L indl.l Ihec n h ịp diệu ncày.

2 TR AN D l CH I V ĩ VAN VI/ Y V E S L E M O I N E A RA HHA OU I EV A D A R K O

Đi) bén nhiéi cùa bó m áy q u an c hợp lồi vi táo dị Rliodella vio la cea dược trổng nhiệt c1<^ khác nhau.

NGl/YẺN MÓNG IR NG CHI VAN TRING

Anh hướng cùa viẽc cát mài tới cấu irúc cùa luvến andrrogen ỡ tóm cang

M a c r o b r a c h i u m i i i p p o i i c n \ De Hann.

24 TRẦN CÓNG VẺN NGITẺN THI QUỲ HOẢNG THI MỸ NHUNG

Anh hường cùa cis-plaũn tổng hợp lại Việt Nam sổ chi tiéu sinh Lý máu ngoại

VI cù a c h u ò l n h ă l trã n c S w iss m a n s u b n c sã c c o m a 180

:? NGITẺN ' AN MU NGIYẼN THI CHINH PMAM HOANG TRLNG

Đánh ciá t>' lé nhiêm viru: viérr can B người di lao dòne nước ngồi. > VỊ THI THI ONG LAN PHAM THI TRAN CHAI PHAN THI KIM

Bưac dáu khão sát tinh đa danc di truyền cùa mót sỏ giống dáu lương iróng Việt Nam.

r CHI van mẫn trinh đinh DAT NGITẺN THI THI HIỂN NGUYÊN VÀN QUÀNG, NGl/YẼN \ AN SANG, Ỉ)I\I1 NMO THAI

■ Phan lích linh da dang di truyén cùa isozym esĩeraza cùa hai loài mối M a c r o t e r m e s

iirnuiniuii-: \ O íù m uucnncò: xunuaucnsi!,

M u THI t> \ M L I N H ỉ ) ỏ T H I M \ H l’H l ( ) N ( i P H A N TK O VC ; N H Ậ T , K l É l H Í T A N H V i n ; iir m ir i: hi> V.: ph.ir n u r i: h c u cu t mi>: sc c h u n g VI k h u â n p h n l ậ p d ợ c t ứ c c

-• 1-1" iiii!.' s.tr \v r.iro smh \u n g M in r quanh phí' Má N ó i

( ' s ' i ■■ ■ Xi m i i.l- Iỉ \> u , in K h o a h o c VJ C ó n (’ n c h c

s IV «lu>n!Ị; Hi QIKK' Viet Cau G iâ y Ha Nị!

••• ' • : I h i t n r s

-92-9

9 - 103

1 04-1

85-91-ĐIỂU TRA TÌNH TRẠNG NHIÊM NẤM GÂY BỆNH TRÊN MỘT s ố LOAI CÂY TRỒNG Ỏ VIỆT NAM

Nguyễn Lẽ Huyền Trang, Bùi Thị Việt Hà, Mai Đàm Linh, Kiểu Hữu Ảnh T r n g Đ i h ọ c K h o a h ọ c T ự n h iên - Đ ại h ọ c Q u ố c G ia H N ội

V i k h í h ậ u n h iệ t đ i g ió m ù a , n ó n g v ẩ m , từ n h iề u n ă m c c b ệ n h d o vi n ấ m đ ã m ột vấn đề k h ỏ n g th ể tr n h k h ỏ i v th ự c t ế đ ã g â y n h iề u tổ n th ất n ặ n g n ề c h o n ề n sả n x u ấ t n n g nghiệp n c ta

T ro n g k h u ò n k h ổ n h ữ n g n g h iê n c ứ u c ủ a m ìn h , c h ú n g tỏi tiế n h n h đ iề u tra tìn h trạn g nhiễm nấm gây bệnh ưên số loại trổng phổ biến nước ta làm tiền tìm kiếm, n g h iê n c ứ u v s ả n x u ấ t c h ế p h ẩ m s in h h ọ c p h ò n g trừ n ấ m

I ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u

1 Mầu bệnh: 85 mẫu bệnh điển hình thu thập từ 31 đối tượng trổng bị bệnh khác (c ây c ô n g n g h iệ p n g ắ n n g y , c y lư n g th ự c , c â y ă n q u ả , c â y u v c c lo ại q u ả tươi bị nhiẻm mốc tự nhièn), thu thập địa điểm: Hà Tảy, Bắc Ninh, Viện Rau Quả Trường Đ i h ọ c N ỏ n g N g h iệ p I H N ộ i th e o th i vụ tr o n g n ă m 0 d ự a trẽn c ác triệ u ch ứ n g bẽnh đ iể n h ln h (v ế t đ ố m , h é o rũ , b iế n m u , th ố i h ỏ n g )

2 P h n g p h p : V iệ c p h n lậ p n ấ m v x c đ ịn h c c d ặ c đ iể m p h ân lo i, đ ặ c đ iếm h ìn h th cùa

nấm th ự c h iệ n b ộ m ô n V i s in h v ậ t h ọ c - Đ i h ọ c K h o a h ọ c tự n h iè n th eo c c p h ng pháp vi s in h v ậ t, trẽ n c c m õ i trư n g : P D A , C L A , C z a p e k - D o x

C c c h ù n g n ấ m đ ã p h ả n lậ p đ ợ c s b ộ đ ịn h tê n tớ i g iố n g (c h i), m ộ t sổ tới lo ài d ự a tiêu c h u ẩ n p h â n lo i c ủ a S a c c a r d o (1 8 ) v i s ự g iú p đ ỡ c ù a Bộ m ô n B ện h c â y T ru n g tâm Bệnh cày nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội

II KẾT QUÀ NGHIÊN c ú u

1 Tinh trạng nhiẻm nấm trẽn còng nghiệp lương thực

T rẽ n đ ố i tu ợ n g c y c õ n g n g h iệ p v lư n g thự c p h ổ b iến đ ã p h â n lập đư ợ c 4 c h ủ n g n ấm (bảng 1) T b ả n g n h ậ n th ấ y , tr ê n c c đ ố i tư ợ n g c y c ô n g n g h iệ p lu n g thự c th n g g ặ p loai n ấm g v b ệ n h c h u v ẽ n h o n h S c le r o tiu m rolỷsii R h n o c to n ia s o la m (trê n lạc, đ ậ u tư n g ,

đậu x a n h , n g ỏ ) , F u s a r iu m o x y s p o r u m ( tr ê n lạc v đ ậ u tư n g ) Bẽn c ạn h đ ó c ũ n g th y x u ã t h iện ^các chi A s p e r g illu s , M u c o r , P e n ic illiu m v m ộ t s ố c h i k h c n h S y n c e p h a la s tr u m , C la d o s p o r u im ,

k r e m o n iu m

2 Tinh trạng nhiẻm nấm trẽn cày ăn tươi

T 11 lo c â y ă n q u ả v q u ả tư i đ ã th u đ ợ c c h ù n g n ấm C ác k ết q u ả q u a n sá t

dịnh tèn đ ợ c tr ìn h b y trê n b ả n a c h o th y trẽ n c c đ ỏ i tư n g q u tươi bị n h iễ m m ó c tư n h iê n

thường x u ấ t h i ệ n n h iề u đ i d iệ n th u ỏ c c h i A s p e r g iỉh is P en ic iliu m Đ ại d iệ n c ủ a h a i ch i n ày

cùng th ấ y x u ấ t h iệ n tr ẽ n b ể m ậ t c c c y ăn q u Bẽn c a n h cị n m ó t số c h ị k h ác n h M u c o r

Bàng Nấm gày bệnh gặp cày công nghiệp lương thưc Đối Biểu Chủng s tượng bệnh nấm

Hình thái khuẩn lac !t

T

trổng

phản lập

Kết định tèn i Đốm đen C1 Trắng, bào tử đen, không sắc tô' Syncephalastrum sp.

ở C2 Trắng, xốp bòng Aspergillus sp.

l

Chè phiến lá, C3 Đen mịn Aspergillus sp.

xoăn C4 Xanh đậm Penicillium sp.

mép C5 Trắng bông, bào tử đen, sắc tô' Mucor sp.

xoãn vàng

h ĐT1 T r ả n g sợi đ â m tia, có hạch m àu S c le r o tiu m ro lỊsii

Đậu nâu, nhẩn bóng

ĐT2 Sợi nâu vàng, chân cát bám, có Rhi:octonia solarti tương

C â y c o n h c h th ô ráp

2 (giai

héo rũ RĐ1 Xanh rêu, tròn mịn A s p e r g illu s sp doạn

rễ mốc RĐ2 Trắng xốp, khỏng sắc tố Aspergillus sp. hai

trắng, RĐ3 X a n h đ ậ m , m ịn P e n ic illiu m sp

tuán

RĐ4 Trảng, bào tứ đen, sắc tố vàng Mucor sp. tuổi)

RĐ5 RĐ6

Đ e n m ịn , trị n

Trắng bơng xốp, sắc tố hổng, dày

A s p e r g iỉlu s sp Fusarium oxysporum LI Xám lơng chuột, mịng A s p e r g illu s sp L Trắng xốp, sắc tố hồng, dày Fusariiim oxysporum L ạc

C â y c o n

h é o rũ

L

L

T r ắ n g sợ i đ â m lia , c ó h c h n ả u Sợi nâu vàng, chân cát bám, có

S c ỉe r o tiu m ro ifsii R h iio c to n ia so la n i

3 (giai

rễ mốc h c h th ỏ x ù x ì đ o n

th án g

tr ắ n g ,

đ ố m

L

L

T r n g , b o tử đ e n , k h ô n g sắc tố

X a n h rê u trò n , d y

S y n c e p h a la s tr u m sp A s p e r g illiis sp.

tu ổ i)

v n g L L

L

Đ e n m ịn , trò n , m ỏ n g

T r ắ n g , b o tử d e n sắ c tố vàng

X a n h đ ậ m , b o tử trắ n g

A s p e r g illu s sp M u c o r sp P e n ic illiu m sp.

■ C ây

Lá đốm H V

Tráng toả tròn, tâm hổng Chưa đ ịn h tên

w

H V H V T r ắ n g v òi b m d y th ò C h a đ ịn h tên

(d ù n g

v n g

H V Xanh đâm, tròn, mịn P e n ic illu tm sp. sản

trò n :

H V Xám lòng chuột, mỏng A s p e r ẹ illu s sp. x u ấ t Hoa héo H V T r ấ n g x ố p b ô n g , k h ô n g sác tố A s p e r g illu s sp.

b ột

v n g

H V Trắng, bào tứ đen sợi dài leo cao S ce p lia lcistriim sp. n g ũ

th â n v

H V Đ e n trò n C u r v u la r ia sp. rẻ th ố i

cố c trẻ

k h ố

-Ngô

Vết NG1 Ira n g SỢI lơng nhung, tỏa trịn

vàng NG2 Vàng cam, xốp bơng hình NG3 Trắng vơi, mịn, khơng sợi kim NG4 Xám lông chuột, mịn, mỏng

hoặc NG5 Xanh đậm, tròn mịn

trắng NG6 Sợi nâu vàng, chân cát bám, có

mép hạch thơ ráp

phiến Acremonium sp Monilirỉia sp Aspergillus sp Aspergillus sp Penicillium sp Rhizoctonia solani Đậu xanh ĐX1

Cây ĐX2

héo rũ ĐX3

rễ mốc ĐX4

trắng

ĐX5

Trắng sợi đâm tia , có hạch nâu nhẩn, bóng

Trắng lơng, bào tử đen, sợi dài Xanh rêu, trịn, dày

Sợi nâu vàng, chân cát bám, có hạch thồ ráp

Trắng xốp bông, lan toả hết đĩa thạch Sclerotium roựsii Syncephalastrum sp Aspergillus sp. Rhizoctonia solani Fusarium sp. Khoai tây Củ có vết đen trịn, vàng, mầm héo KT1 KT2 KT3

Trắng, bào tử đen, sắc tố vàng, chân bám sâu

Xanh rêu, mịn, mỏng

Trắng bông, sợi dài, bào tử đen, có vịng đồng tâm

Đen mịn, trịn KT4 Đen mịn, tròn

I _ B ả n g 2: N ấ m m ố c n h iễ m tr é n cày ã n q u ả q u tươi

Mucor sp.

A s p e r g illu s sp Svncephalastrum sp. Cladosporium sp. s T T Đối tượng trổng Chủng nấm phản lập

Kết định tên ST T Đòi tượng cày trồng Chùng nấm phản lập

Kết định tén

HI S v n c e p h a la s tr u m sp

VI A s p e r g illu s sp

H2 A sp e rg iIIu s sp

1 Vải V2 A s p e r g i ll u s sp Hổng H3 P e n ic illiu m sp

V3 A s p e r g illu s sp H4 A s p e r g illu s sp. V4 P e n ic illiu m sp H5 M o n ilin ia sp. DD1 A s p e r g illu s sp

DD2 P e n ic illiu m sp XI C la d o s p o r iu m sp Đu đủ DD3 A s p e r g i ll u s sp Xoài X2 A s p e r g illu s sp

DD4 A c r e m o n i u m sp X3 P e n ic illiu m sp

DD5 Chưa định tẽn

3 Dứa DI

D2

P e n ic illiu m sp

M u c o r sp

Đào ĐAI

ĐA2

A s p e r g illu s sp

D3 Aspergillus sp. Ị ĐA3 1 P e n ic illiu m sp. Quất Q1 Q2 Q3 Q4 Penicilium sp Aspergillus sp Acremonium sp Cladosporium sp. 10 Nhãn NHI NH2 NH3 NH4

A sp e r g illu s sp

A s p e rg illu s sp Aspergillus sp

P e n ic illiu m sp

5 Cam CAI CA2 CA3 CA4 Syncephalastrum sp Alternaria sp Aspergillus sp Penicillium sp. 11 Nho NOI N02 N03 N04

A s p e rg illu s sp A s p e rg illu s sp

Aspergillus sp Monilinia sp. Na NI N2 N3 Mucor sp Aspergillus sp Penicillium sp. Tình trạng nhiễm nấm trèn rau

Bảng kết phân lập định tên 46 chúng nấm thu trẽn 13 loại rau phổ biến Bảng 3: Nấm bệnh gàp trèn loại rau thông thường

s T Đối tượng trồng Biểu bệnh Chủng nấm phân lập

Khuẩn lạc K ế t q u đ ịn h té n

KL1 Trắng sợi, bào từ đen sác tô Mucor sp.

Lá đốm vàng

Rau vàng, củ KL2 Trắng, lông dài, bào tử đen Svncephalastrum sp.

1 khoai vết thâm không sắc tố

lang đen, thối KL3 X a n h đ ậ m , b ả o tử trắn g Penicillium sp.

xốp KL4

KL5

Xanh rèu, chân bám, dày Trắng, tâm hồng

Aspergillus sp C h a đ ịn h tên

CC1 Trắng, sợi dạng lưới, xóp bịng, đ ố m tím h o a cà

Fitsarium o x y s p o ru m

Cây héo CC2

Trắng sợi đâm tia, có hạch n h ẩ n b ó n g

S c le r o tiu m ro ỉfsii

vang, re

c a Sơi nãu vàng, chân cát bám, có Rhiiocỉonia solarti ■) Cà

moc h c h th ô rá p

chua tráng, CC4 Xanh đậm, mịn Penicillium sp.

có vết

CC5 Vàng cam, xốp len M o n ilin ia sp.

đ e n m ố c

CC6 Trắng bào từ đen không sác S y n c e p h a la s ir u m sp. tr ắ n g

CC7 CC8

tố

Xanh rêu trịn dày Trắnơ lơng dài, vươn c ao

A s p e r g illu s sp

1 A s p e r g illu s sp.

-[ đũa thảm,

héo Đ2

nhẵn bóng - Ị

X a n h đ ậ m , trò n , d y Penicillium sp

4 Cải bắp

Bẹ bị thối, vết nảu bắp to CBC1 CBC2 CBT1 CBT2

Irãng SỢI dâm tia, có hạch nảu

nhẩn bóng

Sơi nâu vàng, chân cát bám, có hạch thơ ráp

Nâu v n g , c h ả n b m , k h ô n g hạch

Sợi nâu vàng, chân bám, có hạch

Sclerotium rolỊsii i Rhizoctonia solani Rhnocionia solani

R h iz o c to n ia so la n i

5 Xà lách

Rẻ thâm nâu, thối nhũn, héo XL1 XL2

Sợi nâu vàng, chân bám, có hạch

Trắng sợi dài, bào tử đen

Rhiỉoctonia soỉani Syncephalastrum sp.

6 Súp lơ Hoa rễ thảm nâu

SL1 SL2 SL3

Sợi nâu vàng, chân bám, có hạch

T rắ n g sợ i d i, b o tử đ en

X a n h đ ậ m , trò n , m ịn , m ỏ n g

Rhiioctonia solani

S y n c e p h a la s tr u m sp Penicillium sp. Khoai mơn Lá đốm vàng, trịn KM1 KM2 KM3

Trắng xốp bông, không sắc tố, X a n h đ ậ m , trò n , m ịn

Vàng cam, xốp

Aspergillus sp Penicillium sp Monilinia sp.

8 Cà tím

Lá, có đốm đen trịn,

nhũn

c r i CT2 CT3

Đen mịn, trịn

Tráng xốp bơng, sợi vươn dài Xanh đậm, viền trắng, trịn

Aspergìllus sp Aspergillus sp PeniciIIium sp. Cải xanh Xoăn lá, mặt mốc tráng CX1 CX2

Đen mịn, mòng

X a n h rê u , trò n d y

Aspergillus sp Aspergillus sp.

10 Cà rốt

Có vết đen nâu

trẽn cú

CR1 CR2

T rắ n g v ô i v n g , r ắ n chắc, có v ị n g đ ổ n g tâm

X a n h đ ậ m , m ịn , m ỏ n g

A c r e m o n iu m sp

P e n ic illu m sp.

11 Dưa c h u ộ t

C â y h é o ,

rễ c ó vết

th â m n â u

DC1 D C

D C

D C

Trấng sợi đâm tia, hạch nâu Tráng lòng nhung, tòa tròn T rắ n g tỏ a trò n , v iề n vôi

X a n h đ ậ m , v iển trắ n g

S c le r o tiu m ro lỊsii A c r e m o n iu m sp

C h a đ ịn h tên

P e n ic illiu m sp.

12 Bầu bí

C â y h é o ,

rẻ th ố i,

m ố c

tr ắ n g ,

BB1

B B2

BB3

B B

T rắ n g sơ i đ â m tia, c ó h a c h n â u S c le r o tiu m ro lỊsu

T rắ n g x ố p bỏng, la n h ết đ ĩa A s p e r g illu s sp

p h ấ n

tr ắ n g

B B X m lô n g c h u ộ t, sợ i A s p e r g illu s sp.

13 M n g

tơi

V ế t tím

tr ị n

M T

M T

M T

T ră n g , b o tử đ e n , k h ô n g sắc tố

T r ắ n g lơ n g n h u n g , tị a trò n X a n h đ ậ m , v iề n trắ n g , d ày

S y n c e p h a la s tr u m sp.

A c r e m o n iu m sp P e n ic illiu m sp.

~ J —J “1UV“6 6“K I i a i i ẵ gay UCIU1 triuyen noa như F u s a r iu m o x y s p o r u m , S c le r o tiu m r o lfs ii, R h iz o c io n ia s o la n i, b ọ n n y th n g g ây h ại đ ế n tát

cá g iai đ o n p h t t r iể n c ủ a c â y Ở c c lo i c â y n h đ ậ u đ ũ a , d a c h u ộ t, b ầ u b í th n g gặp

Sclerotium r o l f s i i , lo i n y th n g g ầ y h i g ia i đ o n c y c o n , tro n g v n m T h iệ t hại nặng

nhất n ấ m S c le r o tiu m r o l/s ii, R h iĩ o c to n ỉ a s o la n i p h ả i k ể đ ế n c ải b ắp , x c h v sú p -lơ.

III KẾT LUẬN

1 Từ 31 đối tuợng trổng tươi nhiễm bệnh địa điểm khác nhau, thu 85 mảu b ệ n h v i n h ữ n g tr iệ u c h ứ n g đ iể n h ìn h

2 Từ mẫu bệnh xác định chùng nấm sau:

T rên c â y c ô n g n g h iệ p , c â y lư n g th ự c v c â y u : R h n o c to n ia s o la n i, S c le r o tiu m ro lfsii,

F u sa riu m o x y s p o r u m v c c c h ủ n g n ấ m k h c n h A s p e r g ìllu s sp , P e n ic illiu m sp., M u c o r sp., C u rv u la ria sp , A lt e r n a r i a s p „ S y n c e p h a la s tr u m s p ,' C ia d o s p o r iu m s p f M o n ilin ia sp., A c r e m o n iu m sp

Trên ăn tươi : Aspergillus sp., Penicillium sp., hai loại chù yếu, ngoài c ò n c ó M u c o r s p „ C u r v u la r ia sp , A lte r n a r ia s p , S y n c e p h a la s tr u m sp C la d o s p o r iu m

sp., M o n ỉlin ia sp , v A c r e m o n i u m sp

H iệ n tư ợ n g c â y tr ổ n g b ị h é o r ũ , th ố i rễ k h iế n c y b ị c h ết, n g o i n g u y ê n n h n d o n m gảy

bệnh, phải k ể đ ế n y ế u tô’ th i tiế t, đ iề u k iệ n d in h d ỡ n g , đ ấ t trổ n g

TAI U Ẻ U T H A M K H Ả O

1 F A O y e a r b o o k - P r o d u c tio n ( 9 ) , , p 43

2 George N.A (1989), Plantpathology, Academic press , INC London Sydney, Tokyo Toronto, p 408 - 11

3 George N.A (1991), Plantpathology, 3rd Edition, Academic press , INC London, Sydney, Tokyo, Toronto, p 321 - 27

4 H o w ell c R ( 9 ) " R e le v a n c e o f m y c o p a r a s itis m in th e b io lo g y c a l c o n tro l o f

R h iz o c to n ia s o l a n i b y G lio c la d iu m v ir e n s , P h y to p a th o lo g y , 7 , p 9 4.

5 S u b r a h m a n y a m p W o n g k a e w s , R e d d y D v , D e m s k i J w , M c D o n a ld D S h a rrm a S.E

S m ith D H ( 9 ) , T i e l d D ia g n o s is o f G r o u n d n u t D is e a s e " , IC R IS A T , p - d8.

6 V a n c e c p , S h e r w o o d R T , K ir k M N ( 9 ), " L ig n iíic a tio n a s a m e c h a n is m o f d ise a s e

Bô m ôn Bệnh Nông dược C ộng hoà Xã hội Chủ nghĩa V iêt Nam TOƯỜNG đ i h ọ c n ô n g n g h i ệ p I Độc Ịập - T ự d o - Hạnh ph ú c

Hà Nội — » — —

GIẤY XÁC NHẬN

Bộ môn Bệnh Nông dược Trường Đại học Nông nghiệp [ - Ha

Nội xác n h ậ n :

1 Đã nhận 132 chủng nấm gàv bệnh từ Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội nhờ định tên, tronư-

có:

• 44 ch ủ n g p h â n lập từ càv công nghiệp cày lương thực

• 42 chủng phân lập từ cày ăn tươi.

• 46 chủng phân lập từ loại rau.

2 Dựa chủ yếu vào tài liệu phân loại cùa Saccardo, Bộ môn Bệnh cãv và Nông dược với Trung tâm Bệnh câv nhiệt đới cùa Trường đinh tên 106 chủng tới giống (chi), 20 chủng tới loài (tổng cộng 126 chùng) số 132 chủng nói (có danh sách kèm theo).

Ịniờng Đại học Nông nghiệp I xác nhận Hà N ộ i n g y tháng n ă m 2003 ki kỷ bên PGS.TS N guyến Kim Vân Chu nhiêm Bộ m ôn

B ả n g N ấ m gây b ệ n h g ặ p tré n cáy công n g h iệ p cáy lương thục

S T T Đối tượng

cáv tróng Chủng nấm phán lập Kết đinh tèn 1 Chè C1 S y n c c p l i a l a s i n m i sp

C2 A s p a ỵilli iì sp

C3 As pcr gtlhi.s sp C4 P c n i c il li i u n sp C5 MIICOI sp 2 Đặu tương ĐT1 S c l c m n i i n i KilỊíii

(giai đoạn hai ĐT2 R li i:o ci (in ui io U im

tuần tuổi) R Đ I A.s pcr Ịilliis sp RĐ2 A s p e i u tll it s sp RĐ3 Pc ni ci l li i u i i sp RĐ4 M n c d i sp RĐ5 A s p e r g i l l i i i sp RĐ6 F i i í u n i i i n o x x s p o n t n t i 3 Lạc L I A s p e r g i l h i i sp

(giai đoạn 1 L2 F i i s a n ii in oxys ỊH ini m 1 tháng tuổi) L3 S cle rn rn in i rolfsii

L4 R h n o c ỉ o n u i snlíini

L5 Sv ii c c p h a li ii i ri ii i i sp L6 A.\l>ert!illits sp L7 A s p e r e i l h i y

L8 M i t c o r sp L9 P e n i c i l l u i m sp 4 Cây H V (dùng HV1 Chưa dinh tên sản xuất bổ! ngũ HV2 Chưa đinh tẽn cốc tre em) HV3 Peiìic il hii ii i sp

HV4 A s p e r g i l l u s sp HV5 A s p e r p i l l i t ỉ sp HV6 S xn cc Ịìl u il asĩ n tii i sp HV7 C u n i t l u n a sp 5 Ngó NG) A c r e m o im i ii ! bp

6 Đậu xanh Đ X 1 S c l e r o i m i i i rolJsn

ĐX2 S yi lí c p l tư ld v i iíllisp

ĐX3 A í p e r g i l l m sp

ĐX4 R l m t i c i o n i a s o l a m 1 ĐX5 F i i s a n u msp

7 Khoai, tây KT1 M n c o r sp

KT2 A s p c i g ì l h i isp

KT3 S ỵ n c e p l iu lí i s n 11111sp

KT4 C l a d o s p o n u m sp

Bảng Nấm mốc nhiễm trẽn cày ãn tươi

STT Đối tượng Chung nám phân lãp Kẽt qua đinh tèn cáv tróng

1 Vải V I A s p c i p il h t i i p

V2 A s p e i Ịiilliissp

V3 Aspci gil lns sp

V4 Pciìicil lll lll lsp

2 Đu dù DD1 A s p e r g i l l u ssp

DD2 P c n ic illn iiii sp

DD3 Aspei Ịỉilliis sp

DD4 A cr e n io n iiiiii sp

DD5 Chưa dinh tện

3 Dứa DI P c n ir illiiiin sp D2 M u c o r sp

D? A si>crí!illii> '•p

4 Quấi Q1 P c m a h i i i n sp 0 2 A sperỊullii.s sp Q ĩ A crcn iiiin ti! sp

Q4 C liic lo s Ịìiin iiir

5 Cam CAI Sviic c p h a lu s in im sp

c a: A llc n h ir id sp

CA? Asi>c i:j iIIu> sp

CA 4 P c n ic ilh u m sp

6 N a NI M iict"' sp

n: A ip crịitlh i-' sp N3 P c iitc illn im sp 7 Hóng HI SviK c p llílltis lr in r sp

H2 A s p c i 1’illn "'P

H? P c lìlt llilllii: '-P H4 A ìi> c y il h r '-r

8 Xoài X I Cl ado si> ori ii ni sp X2 A s p e r g ì l l m sp X 3 P e n i c il lu in i sp 9 Đào Đ A I A s p e r g i l l u s sp

Đ A 2 S y n c e i ĩl i a lu s n tun sp Đ A 3 P e n i c i l l i i i m sp 10 Nhãn N H I A s p e r g i l h i i sp NH2 A s p e r g i l l n s sp N H3 A s p e r g i l l i i ì sp NH4 P e i i i c i l l u i m sp 11 Nho N O I A s p e r g i l ì u s sp N 2 AspCIỊỊÌIIlti sp N 3 A s p e r g i l l i i i sp N 04 M o n ì h m a sp

Bảng Nấm bệnh gặp loại rau thóng thường

Đối tương S T T

cày trong Chùng nám phán lap Kèi qua dinh ten 1 Rau khoai lang K L 1 M n c o i sp

K L2 S y n c e p h a l a s t m m sp K L 3 Pciìicil lll lll l sp K L4 A s p e r g i l l n s sp K L 5 Chưa đinh lẽn 2 Cà chua C C 1 F ii s a n i n i i o x x s p o n t m

CC2 S c l e r o m t i n rul Ịsn

CC 3 R l i i í o c ì o n i a s nl a n i

CC4 P c n ic il lii iinsp C C S M o m l i i i u i sp CC6 S v n c e p h a l a s r n i i n sp C C 7 A s p e r g i l l u s sp CC8 A s p e r s i l h i Ị sp

3 Đấu đũa Đ I S c l e r o i m i n r o ỉị s u

Đ2 P c m c i lh ii i i; sp 4 Cải bắp C B C 1 S c l c r n i n m i rrilf.su

CBC2 Rhi;o ci i>i mi s o ta u :

C B T1 R l i i i a c l c i i u i ic li i ii i

CBT2 R l u í a a o i i i u .sohuu

6 Súp lơ SL1 R h n n a o m a so ìa n i

SL2 S y n c c p h a l a s i i v n i sp 1 SL3 P e ii tc il lĩi im sp 7 Khoai món KM 1 A s p e r g i l l n s sp KM 2 P c ni ci ll iu in sp KM3 M o n i h n i u sp

8 Cà tím CT1 AspciỊ íi lln s

CT2 A s p c r g i l l u i sp CT3 P e n i c il ln im sp 9 Cải xanh C X 1 Asi> ei gil hiì sp CX2 A s p e r iỉ i ll u s sp 10 Cà rót C R 1 A c r e m o n i u n i sp

CR2 P e n i c il lt t m sp

11 Dưa chuột D C 1 S c le r o t in m rolfsii

DC2 A c r e m o n i u m sp DC3 Chưa dinh lén DC4 P e n i c il ìn in i sp 12 Báu bí BB1 S cle ro ti ii ni m l f s i i

BB2 A s Ịi cr g ill iii sp BB3 Chưa đinh tén BB4 A c r e m o n i u m sp BB5 A.spciỊỉilln.' sp 13 Mổng tơi M T1 S ỵ n c c p l ii i la s n IIII1 sp

Trung tàm nghiẻn cứu báo vệ sức khoẻ CỘNG HỒ XÃ HƠI CHÚ NGHĨA VIỆT NAM Cây trồng Vật nuôi Độc lập - Tự - Hạnh phuc.

Hà nội lỉỊỉàyx: tháng '?•/ núm 2003

GIẤY XÁC NHÂN

T r u n a tàm n s h i ẽ n c ứ u sứ c k h o ẻ C y trồ n g Vật ni xác nhặn:

Phịníi nghiên cứu nám cúa truns tâm chúng tỏi kháo sát siúp Bộ môn Vi sinh vặt học - khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc sia Hà Nội Hai chế phấm sinh học sán xuất từ bào tứ chủng xạ khuán sinh khána sinh chóng nấm gãv bệnh thực vặt Streptomyces viricỉof>enes D42 (dạng dịch !hc) Streptom yccs anrim vcoticus T41 (dạng bột).

C h ú n £ tòi đ ã sử d ụ n s loại c h è p h m nàv đế thứ n g h iệ m diệt nám gãy bệnh Ỳlciĩinum r o lfs ii n h iẻ m c y cà c h u a n ấ m Rhizoct(>niư so la n i nhiẻm húp Kết q u a c h o th ày so với c c c ò n g th ứ c thí n g h iệm d ù n " hoá chát M exyl Rovral Validacin d ù n a c h ế p h m T n c h o d e r m a viriílc:

- Đối với tác d ụ n2 d iệ t n m s roìỊsii c h ế phám từ ch u n g S i r e p ỉ o m u e s Mitimycoỉicus T I c ú a Bộ m ò n Vị sinh vật học - Trường Đai học khoa học Tự nhién ai rúc dụní: diệt n m n g a n a với M e x y l, c h ế p h ám T viriílc cao Rovral Riêng thê phám từ c h ú n iỉ s v ir i d o e n e s D c h a thấv biếu hoạt tính kh án g nám :hí nghiệm

- Đơi vó'i tác dụng diệt nàm R solani chẽ phám từ chúng s anrinncoticus T4I Hiếu hoạt tín h k é m h n s v ir id o e n e s D 42 chẽ phàm T viriile.

Nói e h u n u hai c h ẽ p h m s a iiỉin iv c o tic u s T I s virnloyưncs D42 bước đáu da hiệu q u a p h ò n e trừ n ấ m t r o n " đất

^ (ỉiá m đốc T ru n g tủm NCBVSK

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VỆT NAM

trương đ i h ọ c KHTN Độc lâP - Tự - Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

ĐÃ QUYẾT TỐN KINH PHÍ

HIỆU TRƯỞNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN XÁC NHẬN:

Đề tài đặc biệt cấp Đại học Quốc gia:

“Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm gáy bệnh thực vật Việt N am ”

Mã số: Q G - - 2

Chủ trì: PGS.TS Kiều Hữu Ảnh

Thời gian thực hiện: 7/2002 - 7/2004

Tổng kinh phí cấp: 60.000.000 đ: Năm 2002: 30.000.000đ Nãm 2003: 30.000.000đ

Đã toán xong kinh phí = 60.000.000đ

Hà Nội ngày 17 tháng năm 2004

TÓM TẮT c c Cơ n g t r ìn h n c k h CỦA CÁ NHÂN VÀ THÀNH VIÊN ĐỂ TÀI Ngành : Sinh học; Chuyên ngành : Vi sinh vật học 1 Họ tên tác giả công trình :

Kiểu Hữu Ảnh, Phạm Văn Ty, Lê Gia Hy, Bùi Việt Hà, Nguyễn Thanh Huyền

2 Năm : 2003

3 Tên báo : Tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomvces

hygroscopicus TC-5-4 có hoạt tính cao chống nâm gây bệnh

4 Tên tạp c h í: Tạp chíSừứi học, Tập 25 - số 2A tháng 6/2003 tr 85-91

5 Tóm tắt cơng trình tiếng Việt :

Chủng xạ khuẩn TC-5-4 phân lập đất trồng tỉnh Bà Rịa - Vũng

Tàu, có khả chống nấm Fusarium oxvsporum gây bệnh thối cổ rễ

trồng Dựa theo mô ta ISP, chủng thuộc loài Streptomyces

hygroscopicus. Chât kháng sinh chủng Streptom ỵces hygroscopicus TC-5-4 tan nhiều dung môi axeton, etanol, metanol, n-butanol Chất kháng sinh bền < 60°c 100 °c 60 phút, hoạt tính cịn 50% MIC

của dung dịch kháng sinh tan nước đôi với Fusarium oxysporum 1,5

ng/ml nồng độ 1%, chât kháng sinh kích thích nàv mầm hạt Ngồi

khả chơng Fusarium oxysporum gây bệnh cổ rễ trồng, chá t

kháng sinh TC 5-4 cịn íc chế manh nârn gây bệnh cho người

Trichophỵton m entagrophytes, T rubrum, Candida albicans.

6 Tiếng Anh :

"Extraction of antibiotics from the strain Strcptom vces hỵgroscopicus TC-5-4

vvith high antiíungal activity", Ịo u m a l o f Biologv, 25, 2A, 6/2003 85-91

The sữain TC5-4, isolated from cultivated soil of Baria-Vungtau

province, has high activity against Fusarium oxvsporum causing root rot in

plants Based on International Streptom vces Proịect (ISP’), this strain is

identiíied as S treptom ỵces hvgroscopicus. The antibiotic of the Streptomyces

hygroscopicus TC-5-4 is more soluble in acetone, ethanol, methanol, n- butanol than than in other solutions This antibiotic is stable at tempcrature <

60°C; at 100°c for 60 min, its activity reduces to 50% For ĩusanurn

oxysporum, the MIC of this antibiotic solution đissolveđ in \vater in 1-5 Mg/ml At 1% concentrtion, this antibiotic can stimulate the germinaticm ot the graừi This antibiotic can also inhibit the grcnvtli ot tungi causing human

Nguyễn Lê H u y ề n T rang, Bùi V iệt H à, M Đ àm Linh, Kiều H ữu Ảnh l Năm : 2004

3 Tên báo cáo : "Điều tra tìn h trạ n g n h iễm n ấ m gây bệnh m ột số loai câv ứồng V iệt Nam "

4 Tên Hội n g h ị : H ội n g h ị K hoa học T rư n g Đại học Khoa học tự nhiên lần thứ Tư, th án g 11-2004

5 Tóm tắt cơng trình tiếng V iệt:

Từ31 đối tư ợ ng trồ n g q u ả tươi n h iễm bệnh địa điểm khác thu 85 m ẫu b ệ n h vớ i n h ữ n g triệu chứng điển hình Từ phân lập khiết đ ợ c 132 c h ủ n g vi n ấm , 126 chủng định tên tới chi số tới giống

Từ mẫu bệnh xác định chủng nâ'm sau:

Trên công nghiệp, lương thực rau: Rhiỵ.octonia solani,

Sclerotium rolísii, Fusarium oxỵsporum chủng nấm khác

Aspergillus sp., Penicillium sp., M ucor sp., Curvularia sp., Altemaria sp.,

Syncephalasừum sp., Cladosporium spv Monilừĩia sp.ỵ Acremonium sp

Trên ăn tươi : Aspergillus spv Penicilỉium sp., hai loại

chủ u, ngồi cịn có M ucor sp., Curvularia sp., Aỉtemaria sp.,

Syncephalastrum sp., Cladosporium sp., Moniỉmia sp., Acremonium sp. 6 Tiếng Anh :

"Survey and study phytopathogenic fungi írequently founđ on some cultivated crops in Vietnam" Fourth Scientiíic VVorkshop at the University oíNatural Sciences, 11/2004.

From 85 plant and vegetables samples, 132 phytopathogenic íungus strains were isolated, of which 126 were identiíied and classiíied On industrial plants and íeeding crops the following phvtopathogenic fungi vvere íound:

Rhizoctonia solani, Sclerotíum rolỉsii, Fusarium oxvsporum, and others such

às Aspergillus sp., Penicillium spv Mucor sp., Curvularia sp., Aỉtemaria sp.,

Syncephalastirum sp., Clađosporium sp., Monilinia sp., and Acremomum sp ;

onvegetables and legumes A spergiỉìus spv Pemcilhum sp., and others such as

Mucor sp., Curvuỉaria sp., Alternaria sp., Svncephalastrum sp., Cladosponum

sp., Monilinia sp., and A crem onium sp.

SCIEN TIFIC PRO JECT

Branch : Biology Project category : National University level

1 Title : Study on production of antibiotics agamst phytopathogenic fungi bv Actinomycete strains íolated from soil samples in Vietnam

2 Code: QG-02-12

3 Managing Institution : Hanoi National University

4 Implementing Institution : Hanoi University of Natural Sciences 5 Collaborating Institution : Hanoi College of Agriculture

6 Coordinator : Assoc Proí.Dr Kieu Huu Anh

7 Key implementor : Hanoi University of Natural Sciences 8 Duration : from 7/2002 to 6/2004

9 Budget: 60.000.000 V N D

10 Maừi results :

- Results in Science and technology : Finding írequently plant-infecting fungi on some cultivated crops in North Vietnam, isolating and identiíying 14 Streptomyces strains capable of producing antiíungal antibiotics

- Results in practical application : Greenhouse and ground microlot

trials showed that spores from T-41 and D-42 applied to soil of tomato and inoculated with Sclerotium rolísii and to soil of cabbage and inoculated with Rhizoctonia solani signiíicantly reduced the mortahụ of plants.

- Results ữi ữaining : 04 bachelors graduated - Publications : 02 report papers

PHIẾU ĐĂNG KÝ

KẾT QUẢ NGHIÊN cứu KH - CN

Tên đề t i :

Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm gây bệnh thực vật Việt Nam

Mã số: Q G -0 -1

Cơ quan chủ trì đề t i :

Đại học Quốc Gia Hà Nội

Địa c h ỉ: 144 Đường Xuân Thủy - Cầu Giấy - Hà Nội

Tel: 8340564

Cơ quan quản lý đề t i :

Đại học Khoa học tự nhiên

Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi - Thanh X u â n - Hà Nội

Tel: 8587781

Tổng kinh phí thực c h i : 60.000.000 (Sáu mươi triệu đồng) Trong : - T ngân sách nhà nước : 0.0

- K inh phí Trường : 60.000.000 (Sáu mươi triệu đồng)

■ Vay tín dụng 0.0

- Vốn tự có : 0.0

- T hu h i : 0.0

Thời gian nghiên cứu : Thời gian bắt đầu : 07/2002 Thời gian kết thúc : 06/2004

Tên cán phối hợp nghiên cứu :

•PGS.TS Nguyễn Kim Vân, Chủ nhiệm Bộ mơn Bệnh Nông dược, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội

- GS.TS Vũ Triệu Mân, p Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Bảo vệ sức khỏe trổng vật nuôi, Liên hiệp Hội Khoa học Kỹ thuật Việt Nam

Sô’ đăng ký đề tài : Sô' chứng nhận đãng ký kết Bảo m ậ t :

'ígày : nghiên cứu ; a Phổ biến rộng r ã i :

Tóm tắt kết nghiên cứu:

Đã điều tra tình trạng nhiễm nấm gây bệnh số trổng phổ biến nước ta, phân lâp tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh kháng nấm nghiên cứu số tính chất hiệu diệt nấm chất kháng sinh thu

Trên công nghiệp, lương thực rau phát được: Rhizoctonia solani Sclerotium rolfsii, ĩusarium oxysporum số loại nấm khác Trên án tư i: Aspergillus sp., Penicillium sp., sô' loại nấm khác.

Đã phân lập 14 chủng xạ khuẩn ức chế Fusarium oxysporum, chủng T - 41 chung D - 42 kháng F oxysporum mạnh Hai chủng có nhiều đặc điểm giống với loài s antimycoticus s viridogenes, theo thứ tự.

Cả hai chủng T-41 D-42 cho hoạt tính kháng sinh mạnh mơi trường A-12 nhiệt độ khoảng 30°c, pH trung tính kiềm Nguổn cacbon thích hợp tinh bột tan 1% ri đường, theo thứ tự Nguồn nitơ thích hợp bột đậu tương, lượng sinh khối hoạt tính kháng sinh đạt cực đại đạt sau khoảng 96-120 nuôi

Chất kháng sinh hai chủng T-41và D-42 tan tốt etanol, n-butanol, etyl axetat, hẩu nhu khơng thay đổi hoạt tính bị xử lý 100°c/ 60 phút Chất kháng sinh từ T-41 có phổ hấp phụ cực đại X = 213; 276,5 326,5 nm.

Kết thử nghiệm bước đầu hiệu diệt nấm gây bệnh thực vật cho thấy chế phẩm từ T-41 có tác dụng diệt n án Sclerotium rolỷsii cà chua chế phẩm từ D- 42 có tác dụng diệt nấm Rhizoctonia solani bắp cải với hiệu lực tương đối cao Kiến nghị quy mô đối tượng áp dụng nghiên cứu :

Đề nghị cấp kinh phí để sản xuất chế phẩm ứng dụng diệt nấm quy mô đồng ruộng Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng

quan chủ trì đề tài

Chủ tịch Hội đồng đánh giá thức

Thủ trường co quan quàn lý đẹ tài Họ tên Kiều Hữu Ảnh Tràn ị j Í h h í ệ u y i m

r-T' 7:V-M.I

C ' lù n v ị um isì, ^ Học hàm

Học vị

Phó giáo sư Tiến sĩ

' X

(rỉ T

í-l/ ^ ' J

Kýtẽn Đóng dấu

\

TỤ

V ‘v * . /

n /

http://bioscixbs.umn.edu/asire/protocol/isolation.html.