Nghiên cứu thu nhận và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ ốc nón đỏ tectus conus

BÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HĨA HỌC CỦA LECTIN TỪ ỐC NĨN ĐỎ TECTUS CONUS Ngành : Cơng nghệ kĩ thuật hóa học Cán hƣớng dẫn : TS Lê Đình Hùng Họ tên sinh viên : Huỳnh Lê Thanh Thúy Mã số sinh viên : 56132057 Khánh Hịa, ngày 05 tháng 07 năm 2018 BƠ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HĨA HỌC CỦA LECTIN TỪ ỐC NĨN ĐỎ TECTUS CONUS Ngành : Cơng nghệ kĩ thuật hóa học Cán hướng dẫn : TS Lê Đình Hùng Họ tên sinh viên : Huỳnh Lê Thanh Thúy Mã số sinh viên : 56132057 Khánh Hòa, ngày 05 tháng 07 năm 2018 iii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng – trưởng phịng cơng nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang tận tình hướng dẫn, bảo, truyền đạt nhiều kiến thức suốt trình hồn thành đồ án tốt nghiệp đại học Tơi xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ sinh học biển ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi trình thực đồ án tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Cơng nghệ kỹ thuật hóa học - Khoa Cơng nghệ Thực phẩm, trường đại học Nha Trang truyền đạt, trang bị cho kiến thức cần thiết quý báu thời gian học tập trường Và cuối tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 11 tháng 07 năm 2018 Sinh viên Huỳnh Lê Thanh Thúy iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn giáo viên hướng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu Phịng cơng nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Nha Trang Các số liệu kết luận văn trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Khánh Hòa, ngày 11 tháng 07 năm 2018 Sinh viên Huỳnh Lê Thanh Thúy v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii LỜI CAM ĐOAN iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH ẢNH x MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan động vật thân mềm biển (Mollusca) 1.2 Tổng quan ốc nón Tectus conus 1.3 Tổng quan lectin 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Sự phân bố lectin sinh giới 1.3.3 Vai trò sinh học lectin 1.3.4 Cấu tạo phân tử lectin 1.3.4.1 Cấu trúc phân loại 1.3.4.2 Cấu tạo phân tử 1.3.4.3 Trung tâm hoạt động lectin 1.3.4.4 Khối lượng phân tử lectin 1.3.5 Một số tính chất hóa lí sinh học lectin 1.3.5.1 Tính tan kết tủa 1.3.5.2 Khả tương tác với đường lectin 1.3.5.3 Khả gây ngưng kết tế bào 10 1.3.6 Ảnh hưởng số yếu tố tới hoạt độ lectin 10 vi 1.3.6.1 Ảnh hưởng pH 10 1.3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường 11 1.3.6.3 Ảnh hưởng số yếu tố khác 11 1.3.7 Một số ứng dụng lectin 12 1.4 Lectin từ động vật thân mềm biển 12 1.4.1 Một số dạng lectin động vật thân mềm biển 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ động vật thân mềm biển 13 1.5 Phương pháp thu nhận lectin 15 1.5.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin 15 1.5.2 Kỹ thuật kết tủa muối trung tính 16 1.5.3 Kết tủa phân đoạn dung môi 16 1.5.4 Thẩm tách 16 1.5.5 Các kỹ thuật tinh sắc ký 16 CHƢƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 20 2.3.2 Xác định hoạt độ lectin phương pháp Ngưng kết hồng cầu 21 2.3.3 Xác định hàm lượng Protein phương pháp Lowry 22 2.3.4 Phương pháp khảo sát yếu tố cho trình chiết lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 23 2.3.4.1 Khảo sát dung môi chiết 24 2.3.4.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 24 2.3.4.3 Khảo sát thời gian chiết 24 vii 2.3.4.4 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa lectin 24 2.3.5 Tinh kỹ thuật sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 25 2.3.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng pH, nhiệt độ lên hoạt tính ngưng kết hồng cầu lectin 26 2.3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 26 2.3.6.2 Ảnh hưởng pH 26 2.3.7 Phương pháp khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate lectin 26 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiết đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu lectin từ ốc nón đỏ T.conus 30 3.1.1 Ảnh hưởng dung môi chiết 30 3.1.2 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi chiết 31 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian chiết 32 3.2 Tinh lectin 33 3.2.1 Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 để kết tủa lectin 33 3.2.2 Kết tinh kỹ thuật sắc ký trao đổi ion nhựa DEAESepharose 34 3.2.3 Kết tổng hợp trình tinh sơ lectin từ ốc nón đỏ T.conus 35 3.3 Kết khảo sát số đặc tính hóa lý sinh học lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 38 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 38 3.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus40 3.3.3 Khả liên kết carbohydrate lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BSA : Albumin huyết bò TBS : Dung dịch đệm Tris (hydroxymethyl) aminomethane – HCl chứa muối natri clorua PBS : Dung dịch đệm phosphate chứa muối natri clorua C : nồng độ đường glycoprotein Cmin : nồng độ nhỏ đường (mM) glycoprotein ( g/ml) mà tượng NKHC lectin gây bị ức chế hoàn toàn DC : dịch chiết HĐR : hoạt độ riêng HĐTS : hoạt độ tổng số NKHC : ngưng kết hồng cầu x DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Các loại đường glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết đường lectin 27 Bảng 3.1 Kết tinh lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 35 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Ốc nón đỏ Tectus conus Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 23 Hình 2.3 Ảnh hưởng gốc đường đến khả liên kết lectin với tế bào hồng cầu 27 Hình 3.1 Ảnh hưởng dung môi chiết đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 30 Hình 3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 32 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ tủa ammonium sulfate đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 33 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ (λ=280nm)và hoạt độ ngưng kết hồng cầu trình sắc ký trao đổi ion DEAE - Sepharose 35 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình thu nhận tinh sơ lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus37 Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 39 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus40 Hoạt độ NKHC (HU) 39 140 120 100 80 60 40 20 20 30 40 50 60 Nhiệt độ 70 80 90 100 (°C) Hình 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Kết hình 3.7 cho thấy khoảng nhiệt độ từ 20 đến 40 °C hoạt độ lectin khơng thay đổi (128 HU) Tuy nhiên, nhiệt tiếp tục tăng lên 50 °C hoạt tính lectin bắt đầu giảm nhanh hoàn toàn nhiệt độ từ 60°C trở lên Lectin có chất protein, đó, nhiệt độ tăng cao làm cho phân tử lectin bị biến tính khơng thuận nghịch Thêm vào đó, nhiệt độ cao làm đứt gãy số liên kết yếu phân tử protein, làm thay đổi cấu trúc phân tử, đặc biệt trung tâm hoạt động lectin, làm khả liên kết với gốc đường bề mặt tế bào hồng cầu, từ làm ảnh hưởng đến khả gây ngưng kết lectin Kết phù hợp với kết số nghiên cứu lectin từ đối tượng động vật thân mềm biển khác lectin thu nhận từ lồi nghêu Ruditapes philippinarum có hoạt tính ổn định khoảng nhiệt độ 30°C [16], hay lectin từ ốc hương Babylonia areolata có khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp 50°C[14] Như vậy, khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt động lectin từ ốc nón T.conus 40 °C 40 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Để tìm khoảng pH tối ưu cho hoạt động lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus, tiến hành thẩm tách lectin 4°C với loại đệm có pH từ đến 10 Sau đó, tiến hành thẩm tách ngược lại lần với nước cất để loại bỏ ảnh hưởng pH Xác định hoạt độ NKHC dịch lectin sau thẩm tách so sánh với hoạt độ dịch ban đầu để đánh giá ảnh hưởng pH lên hoạt tính lectin Kết trình bày hình 3.8 Hoạt độ NKHC (HU) 140 120 100 80 60 40 20 10 pH Hình 3.8 Ảnh hƣởng pH tới hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Kết nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ khơng bị ảnh hưởng thay đổi pH, mơi trường acid, kiềm, trung tính Đây khác biệt lectin từ ốc nón đỏ so với lectin từ số động vật thân mềm khác Như lectin thu nhận từ ốc hương Babyloni aareolata thể hoạt tính pH từ 5-6,5, ngồi dải pH lectin ốc hương bị hoạt tính [40], hay lectin từ ngao Spisula sp hoạt động thích hợp pH 41 Khả liên kết carbohydrate lectin từ ốc nón đỏ Tectus 3.3.3 conus Sử dụng loại glycoprotein 11 loại đường để khảo sát khả ức chế hoạt tính NKHC lectin từ ốc nón T.conus theo phương pháp mô tả mục 2.3.7 Nếu lectin liên kết với đường glycoprotein khơng cịn khả gây NKHC dựa tìm giá trị nồng độ nhỏ đường glycoprotein mà lectin liên kết Kết thu thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Khả liên kết carbohydrate lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Mẫu HI Cmin (µg/mL), (mM) Mucin 32 62,5 Asialo Mucin 32 62,5 Fetuin 500 Glycoprotein Asialo Fetuin 500 (2000 µg/mL) Transferrin - - Asialo Transferrin 250 Thymoglobulin - - Yeast mannan - - Glucose - - D-Galactose - - Mannose - - N-acetyl-D-galactosamine - - N-acetyl-D-glucosamine - - N-acetyl-D-mannosamine - - Nitrophenyl-galactopyranoside - - Đường (100 mM) 42 Nitrophenyl-glucopyranoside - - Nitrophenyl-manopyranoside - - - - - - NANA (N-acetylneuraminic acid hay Sialic acid) Xylose ―-‖: Đường 100mM hay glycoprotein 2000µg/ml khơng có khả gây ức chế hoạt tính NKHC lectin ―HI‖: Khả gây ức chế hoạt độ NKHC ―Cmin‖ : nồng độ nhỏ đường (mM) glycoprotein (µg/mL) có khả gây ức chế hoạt độ NKHC Kết bảng 3.2 cho thấy hoạt tính NKHC lectin từ ốc nón đỏ T.conus bị ức chế có mặt 5/8 loại glycoprotein nồng độ khác (Mucin, Asialo Mucin, Fetuin, Asialo fetuin, Asialo transferrin) không bị ức chế 11 loại đường sử dụng nghiên cứu Trong đó, mucin asialo mucin có khả liên kết tốt với lectin, nồng độ 62,5 g/mL ức chế hồn tồn hoạt tính NKHC lectin 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN  Lectin từ ốc nón đỏ T.conus thu nhận tinh sơ qua bước chiết đệm PBS 0,02M (pH 7,2; 0,85% NaCl) với tỉ lệ nguyên liệu:dung môi 1:4 (w/v) 4°C giờ, kết tủa muối amonium sunfate (NH4)2SO4 nồng độ bão hòa 60%, tinh sắc ký trao đổi ion nhựa DEAE-Sepharose  Một số tính chất lectin từ ốc nón đỏ T.conus  Nhiệt độ hoạt động thích hợp 40°C Hoạt tính NKHC lectin không bị ảnh hưởng pH từ đến 10  Lectin từ ốc nón đỏ T.conus liên kết với 5/8 loại glycoprotein khảo sát Mucin, Asialo mucin, Fetuin, Asialo fetuin, Asialo transferrin khả liên kết với 11 loại đường sử dụng nghiên cứu KIẾN NGHỊ  Tiến hành thêm bước tinh chế để thu nhận lectin có độ tinh cao  Tiến hành nghiên cứu cấu trúc lectin từ ốc nón đỏ T.conus  Khảo sát thêm hoạt tính sinh học lectin từ T.conus hoạt tính kháng virus, kháng ung thư… 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cao Đăng Nguyên Nguyễn Quốc Khang 1998, ‗Điều tra lectin từ mẫu sinh vật thường gặp vùng biển Hải hậu‘, Tạp chí Sinh học, tập 20, trang 122-127 Cao Đăng Nguyên Nguyễn Quốc Khang 1999, ‗Tinh lectin từ Trìa mỡ (Meretrix Meretrix Linne) bước đầu nghiên cứu khả ứng dụng Y học‘, Tạp chí Thơng tin Y Dược, số 10, tr 34 - 38 Cao Phương Dung 1994, ‗Tinh chế tính chất đặc trưng lectin trai Tai tượng Tridacna squamosa’, Tuyển tập nghiên cứu biển V, trang 153 – 163 Cao Phương Dung Lưu Thị Hà 1991, ‗Một vài tính chất lectin tai nghé (Tridacna crocea), trai tai tượng (Tridacna elongata) điệp ngọc (Pinctada margaritifera)’, Tuyển tập nghiên cứu biển III, tr 228 – 234 Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú 2009, Cơ sở công nghệ sinh học- tập 2: Cơng nghệ hóa sinh, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng Đỗ Ngọc Liên 2004, Miễn dịch học sở, Nhà xuất Đại hoc Quốc gia, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên Nguyễn Lệ Phi 1992, ‗Tinh chế IgA từ huyết người nhờ cột sắc ký lực Sepharose 4B-LM‘, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, số 2, tr 24 26 Đỗ Ngọc Liên, Cesari I, Bout D, Hoebeke J 1994, ‗Sử dụng lectin chay A.tonkinensis để chẩn đốn miễn dịch ký sinh trùng Schistosoma mamsoni’ Tạp chí Sinh học, số 16, tr 21 - 24 lectin Trang Hồng Thị Trang 2014, ‗Nghiên cứu tính chất hóa lý đặc tính sinh học chiết từ củ tỏi (Allium sativum)’, Đồ án tốt nghiệp đại học, Đại học Nha 45 10 Lê Đình Hùng, Ngơ Thị Duy Ngọc, Võ Thị Diệu Trang 2011, ‗High-Mannose type N-Glycan specific lectins from red marine algae, carrageenophytes‘, Công nghệ sinh học, số 1, tr 87-98 11 Lưu Thị Hà, Cao Phương Dung 1991, ‗Kết bước đầu điều tra lectin nhuyễn thể vùng biển Nha Trang – Phú Khánh‘, Tạp chí sinh học, tr 37-39 12 Nguyễn Chính 1996, ‘Một số lồi động vật nhuyễn thể có giá trị kinh tế biển Việt Nam’, Nhà xuất khoa học kỹ thuật 13 Nguyễn Quốc Khang R Brossmer,1997 Lectin Sam biển (Tachypleus tridentatus): Tinh chế đặc trưng lý hóa Tạp chí Sinh học, Tập 19, số (CĐ), tr 2327 14 Nguyễn Thị Vĩnh, Đinh Thị An 2007, ‗Bước đầu nghiên cứu số tính chất lectin proteinase ốc hương (Babylonia Areolata)‘ Tuyển tập báo cáo khoa học Hội thảo Động vật thân mềm toàn quốc lần thứ tư - Nha Trang 5- 6/9/2005, tr 231-238 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Adhya M & Singha B 2016, ‗Gal/GalNAc specific multiple lectins in marine bivalve Anadara granosa‘, Fish & Shellfish Immunology, vol 50, pp 242-246 16 Alexander A Bulgakova, Kyung-Il Park, Kwang-Sik Choi, Hee-Kyoung Lim, Moonjae Cho 2004, ‗Purification and characterisation of a lectin isolated from the Manila clam Ruditapes philippinarum in Korea‘, Fish & Shellfish Immunology , vol 16, pp 487-499 17 Aufy A, Rosi F, Stauudacher E, Zocchi G 2010, ‗Protein purification from gastropods‘, 18 Balzarini J, Schols D, Neyts J, Damme E Van, Peumans W & Clercq ED 1991, 'Alpha-(1-3)- and alpha-(1-6)-D-mannose-specific plant lectins are markedly inhibitory to human immunodeficiency virus and cytomegalovirus infections in vitro.', Antimicrob Agents Chemother., vol 35, pp 410-416 46 19 Belogortseva NI, Molchanova VI, Kurika AV, Skobun AS, Glazkova VE 1998, ‗Isolation and Characterization of New GalNAc/Gal- Specific Lectin from the Sea Mussel Crenomytilus grayanus‘, Comp Biochem Physiol, vol 119C (5), pp 45-50 20 Boyd WC, Almodavar LR & Boyld LG 1966, 'Agglutinins in marine algae for human erythrocytes', Transfusion (Philadelphia), vol 6, pp 82-83 21 Carpenter KE, Niem VH (eds) 1998, ‗The living marine resources of the Western Central Pacific Volume Seaweeds, corals, bivalves and gastropods‘, FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS 22 Carté BK 1996, 'Biomedical Potential of Marine Natural Products', BioScience, vol 46, pp 271-286 23 Crocker PR & Kelm S 2000, The Siglec Family of I-type lectins (Carbonhydrate in chemistry and biology) 24 Cummings RD & Liu FT 2009 Chapter 33: Galectins NCBI Bookshelf 25 Datta D, Nath Talapatra S, Swarnakar S 2015, 'Bioactive compounds from marine invertebrates for potential medicines – An overview', International Letters of Natural Sciences, vol 34, pp 42-61 26 Dias Rde O, Machado Ldos S, Migliolo L, Franco OL 2015, ‗Insights into animal and plant lectins with antimicrobial activities‘, Molecules, vol 20, pp 519-541 27 Donia M & Hamann MT 2003, 'Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents', Lancet Infect Dis., vol 3(6), pp 338-348 28 Fenton B, Espinosa R Arreguin, Sánchez N Silvia, García-Hernández E, Contreras E Vázquez, Lozano B Arreguín, et al 2013, 'Purification and characterization of structural and functional properties of two lectins from a marine sponge Spheciospongia vesparia', Indian journal of biochemistry and biophysics, vol 50, pp 562-569 29 Fujii Y, Dohmae N, Takio K, Kawsar SM, Matsumoto R, Hasan I, Koide Y et al 2012 ‗A lectin from the mussel Mytilus galloprovincialis has a highly novel primary structure and induces glycan-mediated cytotoxicity of 47 globotriaosylceramideexpressing lymphoma cells‘, The Journal of Biological Chemistry, vol 288 30 Gabius H J 1997, ‗Animal lectins‘, European Journal of Biochemistry, vol 243 (3), pp 543-576 31 Goldstein IJ, Hughes RC, Monsigny M, Osawa T & Sharon N 1980, 'What should be call a lectin?', Nature (London), vol 285, pp 66 32 Hori K, Miyazawa K & Ito K 1990, 'Some common properties of lectins from marine algae', Hydrobiologia, vol 204, pp 561-566 33 Hori K, Miyazawa K & Ito K 1986a, 'Preliminary characterization of Agglutinins from seven marine algal species', Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisher, vol 52(2), pp 323-331 34 Hori K, Miyazawa K & Ito K 1986b, 'Isolation and Characterization of Glycoconjugate-specific Isoagglutinins from a Marine Green Alga Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni', Botanica Marina, vol 29, pp 323-338 35 Huesing JE, Murdock LL, Shade RE 1991, ‗Rice and stinging nettle lectins: Insecticidal activity similar to wheat germ agglutinin‘, Phytochemistry, vol 30, pp 3565-3568 36 Hung LD, Ly BM, Trang VTD, Ngoc VTD, Hoa LT, Trinh PTH 2012, ‗A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae‘, Journal of Applied Phycology, vol 24, pp 227-235 37 Janzen DH, Juster HB & Liener IE 1976, 'Insecticidal action of the phytohemagglutinin in black beans on a bruchid beetle', Science, vol 192, pp 795796 38 Judd WJ 1980, ‗The role of lectins in blood group serology‘, Crit Rev Clin Lab Sci, vol 12, pp 171-214 39 Kong P, Wang L, Zhang H, Song X, Zhou Z, Yang Z, Qiu L, Wang L, Song L 2011, 'A novel C-type lectin from bay scallop Argopecten irradians (AiCTL-7) agglutinating fungi with mannose specificity', Fish & Shellfish Immunology, vol 30, pp 836 – 844 48 40 Lezica RP 2014 Lectins AccessScience McGraw-Hill Education 41 Liao JH, Chien CT, Wu HY, Huang KF, Wang I, Ho MR, Tu IF et al 2016, 'A multivalent marine lectin from Crenomytilus grayanus possesses anti-cancer activity through recognizing globotriose Gb3', Journal of the American chemistry society 42 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL & Ran RJ 1951, 'Protein measurement with the Folin Phenol reagent', The Journal of biological chemistry, vol 193, pp 265275 43 Mayer AM, Rodríguez AD, Berlinck RG & Hamann MT 2009, 'Marine pharmacology in 2005–6: Marine compounds with anthelmintic, antibacterial, anticoagulant, antifungal, anti-inflammatory, antimalarial, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action', Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol 1790, pp 283-308 44 Mojica ERE, Deocaris CC, Merca FE 2005, ‗A Survey of Lectin-like Activity in Philippine Marine Invertebrates 45 Munro MHG, Blunt JW, Dumdei EJ, Hickford SJ, Lill RE, Li S, et al 1999, 'The discovery and development of marine compounds with pharmaceutical potential', J Biotechnol., vol 70, pp 15-25 46 Philippine Marine Invertebrates‘, Philippine Journal of Science, vol 134, pp 139-146 47 Naganuma T, Ogawa T, Hirabayashi J, Kasai K, Kamiya H, Muramoto K 2006, ‗Isolation, characterization and molecular evolution of a novel pearl shell lectin from a marine bivalve, Pteria penguin‘, Molecular Diversity, vol 10, pp 607-618 48 Nikapitiya C 2012, ‗Bioactive secondary metabolites from marine microbes for drug discovery‘, Adv Food Nutr Res., vol 65, pp 563-587 49 Ogawa T, Watanabe M, Naganuma T & Muramoto K 2011, 'Diversified carbohydrate-binding lectins from marine resources', Journal of Amino Acids, vol 2011 49 50 Peumans WJ & VanDamme EJ 1995, 'The role of lectins in plant defence', Histochem J, vol 27, pp 253-271 51 Rüdiger H 1993, chapter 4: Isolation of Plant Lectins (Lectins and Glycobiology) 52 Sang VT & Kim SK 2010, 'Potential Anti-HIV Agents from Marine Resources: An Overview', Mar Drugs, vol 8, pp 2871-2892 53 Sharon N 1987, 'Bacterial lectins, cell-cell recognition and infectious disease', The Second Datta Lecture, vol 217(2), pp 145-157 54 Sharon N & Lis H 2003 Lectins Kluwer Academic Publishers 55 Sharon N & Lis H 2004, 'History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules', Glycobiology, vol 14(11), pp 53R-62R 56 Smith VJ, Desbois AP & Dyrynda EA 2010, 'Conventional and unconventional antimicrobials from fish, marine invertebrates and micro-algae', Mar Drugs, vol 8, pp 1213-1262 57 Sipkema D, Franssen MC, Osinga R, Tramper J & Wijffels RH 2005, ‗Marine Sponges as Pharmacy‘, Mar Biotechnol, vol 7(3), pp.142-162 58 Takahashi KG, Kuroda T, Muroga K 2008, ‗Purification and antibacterial characterization of a novel isoform of theManila clam lectin (MCL-4) from the plasma of the Manila clam, Ruditapes philippinarum‘ Comp Biochem Physiol B, vol 150(1), pp.45–52… 59 Teixeira EH, Napimoga MH, Carneiro VA, Oliveira TMD, Nascimento KS, Nagano CS, et al 2007, 'In vitro inhibition of oral streptococci binding to the acquired pellicle by algal lectins', J Appl Microbiol, vol 103(4), pp 1001-1006 60 Toyoda M, Yamazaki IM, Itakura Y, Kuno A, Ogawa T, Yamada M, Akutsu H et al 2011, ‗Lectin microarray analysis of pluripotent and multipotent stem cells‘, Genes cells, vol 16, pp 1-11 61 Terada PGM & Dahms NC 2000, ‗P-type lectins and Lysosomal enzyme trafficking (Carbohydrates in chemistry and biology) 50 62 Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, et al (eds.) 2009 Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press TÀI LIỆU INTERNET 63 https://en.wikipedia.org/wiki/Marine_invertebrates 64 http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=715868 PHỤ LỤC Bảng 3.3 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus HA Protein HĐTS HĐR (HU/ml) tổng (mg) (HU) (HU/mg) TBS 128 24,96 448 17,95 PBS 256 46,83 896 19,13 Ethanol 30% 64 24,15 224 9,28 Dung môi chiết Bảng 3.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Tỉ lệ HA Protein HĐTS HĐR (HU/ml) tổng (mg) (HU) (HU/mg) 1:2 256 38,52 1024 26,58 1:4 256 51,04 2048 40,13 1:6 128 57,6 1536 26,67 1:8 64 50,4 1024 20,32 1:10 32 41 640 15,61 nguyên liệu:dung môi (w/v) Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thời gian chiết đến Hoạt độ tổng số Hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Thời gian chiết HA Protein HĐTS HĐR (giờ) (HU/ml) tổng (mg) (HU) (HU/mg) 128 44,64 1024 22,94 128 46,4 1024 22,07 256 47,6 2048 43,03 256 50,64 2048 40,44 10 256 56,64 2048 36,16 12 256 62,24 2048 32,9 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến Hoạt độ tổng số Hoạt độ riêng lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus Nồng độ HA Protein tổng HĐTS HĐR muối (NH4)2SO4 (HU/ml) (mg) (HU) (HU/mg) 20% 1,38 1,38 30% 16 5,6 16 5,6 40% 64 14,7 64 14,7 50% 128 23,55 128 23,55 60% 256 24,9 256 24,9 70% 256 26,9 256 26,9 80% 256 30,2 256 30,2 Bảng 3.7 Kết sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Phân đoạn A280nm Hoạt độ NKHC Phân đoạn A280nm Hoạt độ NKHC 0 26 0,044 0,818 27 0,196 0,333 28 1,598 4 0,143 29 0,294 16 0,111 30 0,148 0,086 31 0,102 0,044 32 0,072 0,03 33 0,057 0,016 34 0,041 10 0,011 35 0,033 11 0,01 36 0,025 12 0,011 37 0,017 13 0,008 38 0,015 14 0,008 39 0,007 15 0,005 40 0,004 16 0,003 41 0,001 17 0 42 0,001 18 0 43 0 19 0,005 44 0 20 0 45 0 21 0 46 0 22 0 47 0 23 0 48 0 24 0 49 0 25 0,044 50 0 ... đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus? ?? nhằm: Xây dựng quy trình tách chiết thu nhận lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus thu nhận Nha Trang, Khánh Hòa Đánh giá sơ số tính. ..BÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HĨA HỌC CỦA LECTIN TỪ ỐC NĨN ĐỎ TECTUS CONUS Ngành : Cơng nghệ kĩ thu? ??t hóa học. .. lectin từ ốc nón đỏ T .conus 35 3.3 Kết khảo sát số đặc tính hóa lý sinh học lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 38 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ ốc nón đỏ Tectus