Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự sinh tổng hợp anthocyanin của tế bào bắp cải tím (brassica oleracea var capitata f rubra)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG THỊ KIM THÚY KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NGUỒN NITƠ LÊN SỰ SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN CỦA TẾ BÀO BẮP CẢI TÍM (Brassica oleracea var capitata f rubra) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ THỦY TIÊN TP Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2012 Luận văn Thạc sĩ Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành kết góp ý giúp đỡ nhiều ngƣời Tơi xin gửi lời chân thành sâu sắc đến: - Cô Lê Thị Thủy Tiên Cô ngƣời gợi mở đề tài giúp em thiết kế nghiệm thức thí nghiệm Em cảm ơn ln bên cạnh động viên giúp đỡ em Cô nguồn động viên tinh thần suốt thời gian thực luận văn, đặc biệt trình hoàn thành luận văn - PGS.TS Nguyễn Đức Lƣợng, PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng, TS Huỳnh Ngọc Oanh truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập Em xin cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hƣơng tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt thời gian học tập trƣờng - Cán phịng thí nghiệm 102, 108 117 tạo điều kiện cho thực tốt luận văn - Các anh chị bạn học viên cao học K2009, K2010, em sinh viên K07 phịng thí nghiệm 102B2 Đặc biệt cảm ơn anh Đơng, bạn Trân, Hịa, em Phúc, Hƣơng giúp đỡ tơi nhiều q trình hồn thành luận văn - Gia đình tạo điều kiện vật chất tinh thần cho suốt thời gian học tập vừa qua TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 ĐẶNG THỊ KIM THÚY i Luận văn Thạc sĩ Tóm tắt Luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Nội dung thực đề tài bao gồm khảo sát ảnh hƣởng nguồn nitơ vô t lệ muối amoni muối nitrate h u casein hydrolysate, phenylalanine dịch chiết từ tảo Spirulina lên tăng sinh sinh tổng hợp anthocyanin mô s o từ tử diệp c y mầm bắp cải tím Mơi trƣờng MS có bổ sung 2,4-D mg/l kinetin mg/l thích hợp cho hình thành tăng sinh mơ s o từ tử diệp bắp cải tím Sự diện muối amoni nitrate môi trƣờng ni cấy theo t lệ 1:5 thích hợp cho tăng sinh mô s o điều kiện tối với ch số tăng trƣởng 2.028 t lệ 1:2 t lệ muối mơi trƣờng MS) thích hợp cho sinh tổng hợp anthocyanin điều kiện chiếu sáng (35.398 x 10-3 % FW) Sự bổ sung casein hydrolysate 750 mg/l vào mơi trƣờng ni cấy có tác động thúc đẩy tăng sinh mô s o điều kiện chiếu sáng nhƣng không ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp anthocyanin mô s o Sự bổ sung phenylalanine nồng độ 30 mg/l vào môi trƣờng ni cấy tuần thích hợp cho tăng sinh mô s o điều kiện sáng với ch số tăng trƣởng 2.420 bổ sung phenylalanine 30 mg/l tuần cảm ứng mô s o sinh tổng hợp anthocyanin tốt điều kiện có ánh sáng (70.680 x 10-3 % FW) Sự bổ sung dịch chiết từ tảo Spirulina vào môi trƣờng nuôi cấy hiệu tăng sinh tổng hợp anthocyanin mô s o ii Luận văn Thạc sĩ Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC ẢNH viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x Chƣơng MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 2.2 2.3 Giới thiệu bắp cải tím 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Nguồn gốc 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Giá trị dinh dƣỡng bắp cải tím 2.1.5 Công dụng bắp cải tím Tổng quan anthocyanin 2.2.1 Anthocyanin 2.2.2 Cơng thức hóa học anthocyanin 2.2.3 Phân loại 2.2.4 Con đƣờng sinh tổng hợp anthocyanin .10 2.2.5 Anthocyanin bắp cải tím 12 2.2.6 Vai trò anthocyanin thực vật 12 2.2.7 Vai trò anthocyanin sức khỏe ngƣời 13 2.2.8 Anthocyanin nhƣ chất màu thực phẩm 13 Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro 14 iii Luận văn Thạc sĩ Mục lục 2.3.1 Nuôi cấy mô s o 14 2.3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào 15 2.3.3 Thu nhận hợp chất thứ cấp phƣơng pháp nuôi cấy tế bào thực vật in vitro 16 2.3.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả tổng hợp thu nhận hợp chất thứ cấp nuôi cấy in vitro 17 2.3.4.1 Khoáng đa lƣợng 17 2.3.4.2 Khoáng vi lƣợng 18 2.3.4.3 Vitamin 18 2.3.4.4 Amino acid 18 2.3.4.5 Chất đông tụ môi trƣờng 19 2.3.4.6 Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật 19 2.3.4.7 Nguồn carbon .20 2.3.4.8 Chất cảm ứng (Elicitors) 21 2.3.4.9 Ánh sáng 22 2.3.4.10 Nhiệt độ .22 2.3.4.11 Độ pH 23 2.3.4.12 Áp suất thẩm thấu 23 2.3.4.13 Bổ sung tiền chất 23 2.3.5 Nguồn nitơ h u .24 2.3.5.1 Casein hydrosylate (CH) .24 2.3.5.2 Phenylalanine 24 2.3.5.3 Tảo Spirulina 25 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Địa điểm nghiên cứu .28 3.2 Sơ đồ nghiên cứu chung 28 3.3 Thiết lập quy trình ni cấy in vitro tạo mơ s o bắp cải tím 28 3.3.1 Vật liệu 28 3.3.2 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 30 iv Luận văn Thạc sĩ Mục lục 3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng hạt giống bắp cải tím 30 3.3.2.2 Thí nghiệm 2: ảnh hưởng 2,4-D kinetin lên khả tạo mô sẹo 31 3.3.2.3 Thí nghiệm 3: xác định tăng trưởng mơ sẹo từ tử diệp bắp cải tím 32 3.3.2.4 Thí nghiệm 4: ảnh hưởng nguồn nitơ (muối amoni, muối nitrate, casein hydrolysate, dịch chiết tảo Spirulina phenylalanine) lên khả tăng sinh sinh tổng hợp anthocyanin 32 3.4 Phƣơng pháp thu nhận dịch chiết tảo Spirulina xác định hàm lƣợng anthocyanin thô 34 3.4.1 Phƣơng pháp thu nhận dịch chiết tảo Spirulina 34 3.4.1.1 Nguyên tắc hoạt động máy phá vỡ tế bào sóng siêu âm 34 3.4.1.2 Cách tiến hành .35 3.5 Phƣơng pháp trích ly xác định hàm lƣợng anthocyanin thô từ mô s o bắp cải tím .35 3.6 3.5.1 Nguyên tắc xác định hàm lƣợng anthocyanin thô từ mô s o 35 3.5.2 Phƣơng pháp trích ly anthocyanin từ mô s o 37 Phƣơng pháp xác định nitơ tổng dịch chiết tảo 37 3.6.1 Nguyên tắc 37 3.6.2 Cách tiến hành 38 3.6.2.1 Vơ hóa mẫu .38 3.6.2.2 Định đạm máy Kieldal 38 3.6.2.3 Cách tính 38 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 39 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Kết 41 4.1.1 Thí nghiệm 1: : khảo sát t lệ mầm hạt giống bắp cải tím điều kiện gieo cấy in vitro .41 v Luận văn Thạc sĩ 4.1.2 Mục lục Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng 2,4-D kinetin lên khả tạo mô s o từ tử diệp bắp cải tím 42 4.1.3 Thí nghiệm 3: khảo sát tăng trƣởng sinh tổng hợp anthocyanin mô s o từ tử diệp bắp cải tím .44 4.1.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng nguồn nitơ muối amon, muối nitrate, casein hydrolysate, dịch chiết tảo Spirulina phenylalanine) lên khả tăng sinh sinh tổng hợp anthocyanin 48 Bàn luận .60 4.2 4.2.1.T lệ nảy mầm hạt giống bắp cải tím điều kiện gieo cấy in vitro .60 4.2.2.Ảnh hƣởng 2,4-D kinetin lên khả tạo mô s o từ tử diệp bắp cải tím .61 4.2.3 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên tăng sinh tích l y mô s o .62 4.2.3.1 Ảnh hƣởng nguồn cung cấp nitơ 62 4.2.3.1 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng .65 4.2.3.2 Ảnh hƣởng thời điểm bổ sung .65 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 67 5.2 Đề nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO .69 PHỤ LỤC 73 vi Luận văn Thạc sĩ Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát anthocyanidin (gốc aglycon) Hình 2.2 Quá trình sinh tổng hợp anthocyanin 11 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử anthocyanin bắp cải tím 12 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu chung 28 Hình 3.2 Sơ đồ khử trùng hạt bắp cải tím 30 Hình 3.3 Sự thể màu sắc anthocyanin pH khác .35 Hình 3.4 Sơ đồ trích ly xác định hàm lƣợng anthocyanin mơ s o bắp cải tím 37 Hình Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o bắp cải tím giống 46 Hình Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o bắp cải tím giống 47 Hình 4.3 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mô s o nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung muối amoni nitrate với t lệ khác điều kiện chiếu sáng khác 49 Hình 4 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung casein hydrolysate với nồng độ khác 51 Hình Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung phenylalanine tuần điều kiện sáng tối 53 Hình Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung phenylalanine tuần điều kiện sáng tối 54 Hình 4.7 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mô s o nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung phenylalanine tuần điều kiện sáng tối 55 Hình 4.8 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung dịch chiết tảo tuần điều kiện sáng tối .58 Hình 4.9 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mô s o nuôi cấy mơi trƣờng có bổ sung dịch chiết tảo tuần điều kiện sáng tối .59 Hình 4.10 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung dịch chiết tảo tuần điều kiện sáng tối .60 vii Luận văn Thạc sĩ Danh mục ảnh DANH MỤC ẢNH Ảnh 2.1 Cây bắp cải tím ngồi ruộng Ảnh 2.2.Bắp cải tím bắp cải trắng Ảnh 2.3 Tảo Spirulina 26 Ảnh 3.1 (a Hạt giống bắp cải tím GN-BT9; 29 Ảnh 3.2 Mẫu cấy tạo s o ban đầu 31 Ảnh 4.1 Cây mầm giống bắp cải tím GN-BT9 (a) mầm giống bắp cải tím Red Jewel F1 (b) sau ngày gieo cấy in vitro 41 Ảnh 4.2 Mô s o giống GN-BT9 sau tuần nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 1mg/l kinetin mg/l 43 Ảnh 4.3 Mô s o giống Red Jewel F1 sau tuần nuôi cấy môi trƣờng bổ sung 43 viii Luận văn Thạc sĩ Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng Giá trị dinh dƣỡng 100 g bắp cải tím Bảng 2.2 Cấu trúc anthocyanidin Bảng Thành phần amino acid tảo Spirulina 26 Bảng Thành phần vitamin khoáng chất tảo Spirulina 27 Bảng T lệ nảy mầm hạt bắp cải tím sau ngày gieo cấy in vitro 41 Bảng 4.2 T lệ mẫu tạo s o từ tử diệp bắp cải tím sau tuần nuôi cấy 43 Bảng 4.3 Sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi mô s o giống bắp cải tím theo thời gian ni cấy .45 Bảng 4.4 Hàm lƣợng anthocyanin tích l y mơ s o giống bắp cải tím theo thời gian nuôi cấy 45 Bảng 4.5 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung muối amoni nitrate với t lệ khác điều kiện chiếu sáng khác 48 Bảng 4.6 Sự tăng trƣởng tích l y anthocyanin mơ s o ni cấy mơi trƣờng có bổ sung hàm lƣợng casein hydrolysate với nồng độ khác điều kiện chiếu sáng khác .50 Bảng 4.7 Hàm lƣợng anthocyanin mô s o nuôi cấy mơi trƣờng có bổ sung phenylalanine tuần 0, 1, với nồng độ khác điều kiện chiếu sáng khác 52 Bảng 4.8 Hàm lƣợng nitơ tổng dịch chiết tảo với nồng độ thay đổi 56 Bảng 4.9 Hàm lƣợng anthocyanin mô s o nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung dịch chiết tảo thời điểm khác 57 ix ... anthocyanin tế bào bắp cải tím (Brassica oleracea var capitata f rubra)? ?? đƣợc tiến hành nhằm nâng cao sản lƣợng anthocyanin tế bào bắp cải tím ni cấy in vitro Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát ảnh hƣởng nguồn. .. xuất hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học đƣợc nghiên cứu ứng dụng, ni cấy tế bào thực vật đƣợc xem phƣơng pháp sản xuất đại [1] Đề tài: ? ?Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh tổng hợp anthocyanin. .. 2.1.2 Nguồn gốc Bắp cải tím (Brassica oleracea var capitata f rubra) thuộc họ Brassicaceae, loại rau cải có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải Tây Nam Châu Âu, đƣợc trồng rộng rãi khắp giới Bắp cải tím