Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc

DREB đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng như cây hoa cúc, lạc, hướng dương…và đ[r]

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VĨNH PHÚC TRƯỜNG THPT NGUYỄN THỊ GIANG



BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN

Tên sáng kiến kinh nghiệm: “ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỌN LỌC THẾ HỆ R2 CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ

SẸO CHỊU LẠNH TẠI TỈNH VĨNH PHÚC”

Tác giả sáng kiến: Dương Thị Thu Huyền Mã sáng kiến : 25.56

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ……….iii

DANH MỤC BIỂU BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

1 LỜI GIỚI THIỆU

2 TÊN SÁNG KIẾN

3 TÊN TÁC GIẢ:

4 CHỦ ĐẦU TƯ:

5 LĨNH VỰC ÁP DỤNG:

6 NGÀY ÁP DỤNG SÁNG KIẾN:

7 MÔ TẢ BẢN CHẤT CỦA SÁNG KIẾN

7 Mục tiêu nghiên cứu

7 Nội dung nghiên cứu

7.3 Vật liệu, phương pháp nghiên cứu xử lý kết , tính tốn số liệu

7.3.1 Vật liệu nghiên cứu

7.3.2 Phương pháp nghiên cứu

7.3.3 Xử lý kết tính tốn số liệu 19

7.4 Kết thảo luận 20

7.4.1 Đặc điểm nơng học dịng lúa chọn lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh 20

7.4.2 Kết đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R3 27

7.4.3 Đánh giá chất lượng hạt số dịng chọn lọc R3 có nguồn gốc từ giống XCH thông qua số tiêu hóa sinh 34

7.4.4 Phân lập tách dòng gen OsDREB1F liên quan đến khả chịu lạnh lúa 36

8 NHỮNG THÔNG TIN CẦN BẢO MẬT (NẾU CÓ) 41

9 CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC HIỆN 41

10 ĐÁNH GIÁ LỢI ÍCH CỦA VIỆC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN 42

11 DANH SÁCH NHỮNG TỔ CHỨC, CÁ NHÂN THAM GIA ÁP DỤNG THỬ HOẶC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN LẦN ĐẦU: 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4D –dichlorphenoxyacetic acid ABA Abscisic acid

DNA Deoxyribo nucleic acid BAP – Benzyl amino purin

bp Cặp base

cs Cộng

ĐC Đối chứng

ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ

EDTA Ethylen diamin tetra axetic acid FAO Food Agriculture Orgnization

kb Kilobase

KLK Khối lượng khô mRNA ARN thông tin

PCR Phản ứng chuỗi polymerase TAE Tris axetat EDTA

DANH MỤC BIỂU BẢNG

Bảng Tên Bảng Trang

2.1 Đặc điểm giống lúa nghiên cứu

2.2 Các dòng hệ R2

2.3 Mồi nhân gen osDREB1F lúa

2.4 Thành phần phản ứng phản ứng PCR nhân đoạn gen

osDREB1F lúa 10

2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách

dòng 11

3.1 Đặc điểm nông học mức độ biến dị dòng chọn

lọc hệ R2 (n = 30, α = 0,05) 24

3.2 Giá trị Tα, Ttn số đặc điểm nông học dòng

chọn lọc hệ R2(α = 0,05) 36

3.3

Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 4oC± 0,5oC

trong 32 giai đoạn mạ dòng chọn lọc hệ R3

29

3.4 Hàm lượng diệp lục sau xử lý lạnh 12

oC ± 0,5oC

giai đoạn mạ dòng chọn lọc hệ R3 31 3.5 Tương quan hàm lượng diệp lục mức độ thiệt hại 33 3.6 Một số tiêu hố sinh dịng chọn lọc R3 thuộc

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên Hình Trang

3.1 Các dịng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống C27 20 3.2 Các dịng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống XCH 21 3.3 Các dòng chọn lọc R3 giai đoạn mạ thời điểm

trước trước sau xử lý lạnh 28 3.4 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu lúa 36 3.5 Kết nhân gen osDREB1F mẫu lúa 37 3.6 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

E.coli DH5α 38

3.7 Kết conoly PCR từ dòng khuẩn lạc trắng 39 3.8 Kết tách chiết plasmid dòng khuẩn mang

vector tái tổ hợp 40

3.9 Kết cắt plasmid dòng khuẩn mang vector

BÁO CÁO KẾT QUẢ

NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN 1 LỜI GIỚI THIỆU

Việt Nam nước nơng nghiệp, lúa mạnh đưa Việt Nam nước đứng đầu giới xuất gạo Năm 2017, Việt Nam tiếp tục nước xuất gạo đứng thứ ba giới sau Ấn Độ Thái Lan Chỉ tính riêng tháng đầu năm 2018, Việt Nam xuất 4,89 triệu gạo với giá trị khoảng 2,46 tỷ USD, tăng 6,7% lượng tăng 21,3% giá trị so với kỳ năm trước Gạo Việt có mặt gần 150 quốc gia vùng lãnh thổ với sản phẩm đa dạng như: Gạo hạt dài, gạo hạt ngắn, gạo thơm, gạo đồ, gạo hữu cơ… Đáng ý, gạo Việt bước đầu thâm nhập vào thị trường có yêu cầu cao như: Hàn Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ, EU…

Tuy nhiên lúa thuộc nhóm nhạy cảm với nhiệt độ lạnh hầu hết giai đoạn sinh trưởng phát triển, giống có nguồn gốc nhiệt đới cận nhiệt đới Những tổn thương nhiệt độ lạnh gây quan sát nhiều giai đoạn tăng trưởng khác lúa: hạt không nảy mầm, mạ phát triển, tượng lùn, cằn cỗi, tượng biến đổi màu sắc, tượng thối hóa đỉnh bơng lúa, gia tăng tỉ lệ hạt lép tượng hạt chín bất bình thường [3], [49], [52]

Tác động lạnh lên lúa rõ rệt Ở nhiệt độ thấp 100C,

thời gian rét kéo dài giai đoạn mạ sau cấy gây chết hàng loạt với giống không chịu lạnh Ở giai đoạn lúa trổ bông, gặp nhiệt độ 200C kết thụ phận giảm tỷ lệ lép tăng lên đáng kể Nếu

lạnh thời gian kéo dài gây bất thụ hoàn toàn Nhiệt độ 150C ức chế tổng hợp chlorophyll phân hủy lục lạp, sinh trưởng Nếu nhiệt độ giảm xuống 100C chức rễ bị tổn thương, thân bị khô héo,

Việt Nam hàng năm tỉnh vùng núi phía Bắc, miền núi trung du đồng sông hồng có tỉnh Vĩnh Phúc ln có mùa đơng lạnh giá Nhiệt độ có năm xuống đến mức rét đậm, rét hại không đảm bảo cho lúa sinh trưởng tốt, làm ảnh hưởng không nhỏ đến suất, chất lượng sản lượng xuất cuối năm

Đứng trước khó khăn thách thức đó, năm 2012 tơi nghiên cứu và bảo vệ thành công đề tài luận văn thạc sĩ “Đánh giá số dòng lúa chọn

lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh”, bước đầu chọn lọc

số dòng lúa hệ R2 cho hệ R3 đạt kết qủa tốt khả chịu lạnh tỉnh miền núi phía Bắc Trong q trình cơng tác tỉnh Vĩnh Phúc tơi nhận thấy vào vụ đông xuân lúa chịu ảnh hưởng không nhỏ điều kiện lạnh tỉnh miền núi phía bắc, đợt rét đậm, rét hại làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng lúa hàng năm tỉnh

Xuất phát từ lý tiếp tục tiến hành nghiên cứu đề tài:“Đánh giá số dòng lúa chọn lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mơ sẹo

chịu lạnh tỉnh Vĩnh Phúc”

2 TÊN SÁNG KIẾN

Đánh giá số dịng lúa chọn lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tỉnh Vĩnh Phúc

3 TÊN TÁC GIẢ:

- Họ tên: DƯƠNG THỊ THU HUYỀN

- Địa chỉ: Trường THPT Nguyễn Thị Giang – Đại Đồng – Vĩnh Tường – Vĩnh Phúc

- Số điện thoại: 0985123340 E_mail: duongthithuhuyen83@gmail.com 4 CHỦ ĐẦU TƯ:

5 LĨNH VỰC ÁP DỤNG:

Lĩnh vực áp dụng thuộc chương trình sinh học phổ thơng chương trình cơng nghệ nơng nghiệp

6 NGÀY ÁP DỤNG SÁNG KIẾN:

Từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2019 7 MÔ TẢ BẢN CHẤT CỦA SÁNG KIẾN 7 Mục tiêu nghiên cứu

- Chọn lọc số dịng lúa có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh để tiếp tục theo dõi bồi dưỡng thành dòng có triển vọng

7 Nội dung nghiên cứu

(1) Đánh giá đặc điểm nông học số dịng lúa hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh

(2) Đánh giá khả chịu lạnh số dòng chọn lọc hệ R3

Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R3 giai đoạn mạ ba thông qua đánh giá ảnh hưởng lạnh đến tỉ lệ thiệt hại, hàm lượng diệp lục a, b sau xử lý lạnh mạ ba

(3) Đánh giá chất lượng hạt số dòng chọn lọc hệ R3

(4) Nhân tách dòng gen liên quan đến khả chịu lạnh số dòng chọn lọc triển vọng

7.3 Vật liệu, phương pháp nghiên cứu xử lý kết , tính tốn số liệu 7.3.1 Vật liệu nghiên cứu

7.3.1.1 Vật liệu thực vật

Hạt R2 số dịng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống U17, C27 Xuân Châu Hương (XCH) sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

- Giống: U17 Sở Nông nghiệp tỉnh Vĩnh Phúc cung cấp

Bảng 2.1 Đặc điểm giống lúa nghiên cứu Giống Thời gian sinh

trưởng (ngày)

Chiều cao

cây (cm) Số hạt chắc/bông

Khối lượng 1000 hạt (g)

C27 100 90 90 - 95 hạt 20- 21

U17 145 - 150 95 - 100 100 hạt 26 - 27

XCH 100 80 - 85 125 - 135 hạt 27 - 28

Bảng 2.2 Các dòng hệ R2

STT Dòng chọn lọc Nguồn gốc

1 R2.03, R2.08, R2.16, R2.18 C27

2 R2.01, R2.04, R2.05, R2.09, R2.11 U17

3 R2.06, R2.13, R2.20, R2.38, R2.44 XCH

7.3.1.2 Hoá chất thiết bị

- Hoá chất: Các hóa chất dùng nghiên cứu có nguồn gốc từ Anh Đức, Mĩ Trung Quốc gồm: EDTA, Tris-HCl , Acid acetic, X-gal, Kanamycin, Ampicilin, Agar; Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối, kit dùng cho phản ứng PCR, kit tách dòng, kit sử dụng tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp, loại enzym giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI Tế bào E coli chủng DH5α, photphat citrat, petroleum ether…

- Thiết bị: Cân điện tử santorius, tủ sấy carbolite, máy quang phổ Uvis Cintra 40, máy li tâm lạnh Hettich, nồi hấp cao áp, box cấy, máy PCR system 9700 (Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode Array Spectrophotometer, máy ổn định nhiệt, máy soi UV…có nguồn gốc từ Anh, Đức

7.3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Các thí nghiệm phân tích sinh lý tiến hành phịng Cơng nghệ tế bào, phịng thí nghiệm Di truyền, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

- Phân tích sinh học phân tử tiến hành phòng Sinh học đại, khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật- Viện Công nghệ Sinh học

7.3.2 Phương pháp nghiên cứu

7.3.2.1 Phương pháp trồng theo dõi đồng ruộng

Các dòng hệ R2 giống đối chứng trồng riêng chăm sóc điều kiện Theo dõi phát triển dòng chọn lọc giống đối chứng qua giai đoạn phát triển vụ gieo trồng thông qua tiêu nông học: chiều cao cây, số bơng/khóm, chiều dài bơng, số hạt chắc/bơng, kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt, thời gian sinh trưởng Các tiêu đánh giá theo chuẩn IRRI [12]

7.3.2.2 Phương pháp phân tích hố sinh

phân tích số tiêu hóa sinh giai đoạn hạt tiềm sinh

Chuẩn bị mẫu : Hạt mẫu hệ R3 nghiền mịn sấy khô

tuyệt đối

 Xác định hàm lượng lipit

Dựa vào tính chất hịa tan lipit dung mơi hữu để chiết lipit, dung môi hữu sử dụng Petroleum ether Hàm lượng lipit xác định theo mô tả Nguyễn Văn Mùi (2001) [19]

Các bước tiến hành sau:

(1) Cân 0,3g mẫu cho vào ống eppendort, cho 1,5ml Petroleum ether (2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút 40C thời gian 30 phút

(3) Loại bỏ dịch trong, lặp lại trình lần

(4) Sấy khơ tuyệt đối cân khối lượng mẫu lại sau triết lipit Hàm lượng lipit tính theo cơng thức :

Hàm lượng lipit (%) A B x 100% A

 

B: Khối lượng mẫu sau đem phân tích (mg)

 Xác định hàm lượng protein tan theo phương pháp Lowry mô tả tài liệu Phạm Thị Trân Châu cs (1998) [4]

Các bước tiến hành sau:

(1) Cân 0,05g bột mẫu khô tuyệt đối cho vào ống eppendort (2ml), cho vào 1,5ml dung dịch đệm chiết photphat citrat (pH = 10), lắc 10 phút, để ống nghiệm 4oC vòng 24

(2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút 4oC thời gian 30 phút, thu dịch để làm thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại lần

Dịch chiết định mức lên ml dung dịch đệm phosphat citrat (pH=10) đo hấp thụ máy UV vis Cintra bước sóng 750nm với thuốc thử foling

Hàm lượng protein tan tính theo công thức: A.HSPL

X(%) 100%

M

  Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô)

A: Nồng độ đo máy quang phổ (mg/ml) HSPL: Hệ số pha lỗng

M: Khối lượng mẫu đem phân tích (mg)

 Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích mơ tả tài liệu Phạm Thị Trân Châu [4]

Đường tan hạt nảy mầm chiết nước cất, để 40C 24

giờ Sau li tâm 4oC với vận tốc 12000 vòng/phút thời gian 30 phút

Thu dịch để phân tích, tiến hành lặp lại lần

Hàm lượng đường tan tính theo cơng thức: %

100  

 

m HSPL b

a

X

Trong đó: X: hàm lượng đường tan (%) b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg)

7.3.2.3 Phương pháp phân tích sinh lý

7.3.2.3.1 Đánh giá khả chịu lạnh giai đoạn mạ phương pháp gây lạnh nhân tạo

+ Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa số dòng hệ R3 ngâm, ủ cho nảy mầm

dài 1cm chuyển vào hộp trồng đựng cát vàng rửa Mỗi hộp 45 - 50 mầm, hộp cho giống Thí nghiệm lặp lại lần với chế độ chăm sóc điều kiện Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở tưới dung dịch Knop, mạ ba (9 - 10 ngày) tiến hành xử lý lạnh nhiệt độ 40C ± 0,50C 32 Chuyển sáng bình thường nhiệt

độ 25 - 300C Sau hai, ba ngày xác định mức độ bị hại

+ Đánh giá mức độ bị hại lạnh theo thang điểm từ đến 5: 0:

Không bị hại, 1: đầu bị khô chết, 2: 1/3 đầu bị khô chết, 3: 1/2 đầu bị khô chết, 4: 3/4 bị khơ chết, 5: chết Tính giá trị trung bình 50 giống nhắc lại lần

+ Tỷ lệ thiệt hại lạnh mạ xác định theo công thức:

0

( n b ) 10 a( % )

n c

 







Trong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại lạnh gây (%) b: Trị số bị hại cấp

c: Trị số bị hại cấp cao n0: Số cấp bị hại

n: Tổng số xử lý

Xác định khả chịu lạnh giai đoạn mạ theo phương pháp mô tả tài liệu Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995) [1]

7.3.2.3.2 Ảnh hưởng lạnh đến hàm lượng diệp lục a, b giai đoạn mạ

- Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa số dòng hệ R3 ngâm, ủ cho nảy

mầm dài 1cm chuyển vào hộp trồng đựng cát vàng rửa Mỗi hộp 45 - 50 mầm, hộp cho giống Thí nghiệm lặp lại lần với chế độ chăm sóc điều kiện Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở tưới dung dịch Knop, mạ ba (9 - 10 ngày) tiến hành xử lý lạnh nhiệt độ 12oC ± 0,5oC ngưỡng thời gian ngày, thu

- Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục

mô tả sổ tay phân tích đất, nước, phân bón trồng (1998) [31] Các bước tiến hành sau:

+ Cân 0,1 g nghiền cồn ethanol 96%

+ Li tâm 6000 vòng/phút 15 phút, thu dịch

+ Dịch thu đem pha loãng 10ml đo quang phổ hấp thụ máy quang phổ UV Visible bước sóng 665 nm 649 nm

+ Hàm lượng diệp lục (mg/g tươi) tính theo cơng thức:

1000 

  

P n V C A

Trong đó: C: nồng độ diệp tính (mg/l) (gồm có Ca, Cb, Ca+b)

Ca (mg/l) = 13,70 E665 – 5,76 E649

Cb (mg/l) = 25,80 E649 – 7,60 E665

Ca+b (mg/l) = 6,10 E665 + 20,04 E649

P: Khối lượng mẫu (g)

V: Thể tích sắc tố rút (ml) 7.3.2.3 Phương pháp sinh học phân tử

7.3.2.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ lúa

Quy trình tách chiết làm DNA tổng số từ lúa dựa theo phương pháp Foolad cs (1995) có cải tiến [41]

- Tiến hành: Hạt lúa R3 số dịng từ hệ R2 bóc vỏ khử

trùng, cấy hạt môi trường MS có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar, mật độ cấy 20 hạt/ bình Sau 10 ngày thu lá, bảo quản tủ lạnh sâu -850C DNA

tách từ non lúa thực theo bước sau:

(1) Phá vỡ tế bào cách nghiền nhanh 0,2 g tươi nitơ lỏng thành dạng bột mịn chày cối sứ

(2) Cho 1,5 ml đệm chiết CTAB (CTAB 2,5%+100ml Tris - HCl pH=8 + 200 ml EDTA + NaCl 1,4mg), ủ 30 phút bể ổn nhiệt (650C)

(3) Bổ sung 1,0ml hỗn dịch chloroform: isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ 20 phút (4) Li tâm 12000 vòng/phút 10 phút 40C, thu dịch

(5) Tủa dịch isopropanol (tỉ lệ 1:1)

(7) Rửa DNA - lần ethanol 70% (8) Làm khô DNA

(9) Hoà tan DNA 300 l TE

Xác định hàm lượng độ tinh DNA

a) Đo quang phổ hấp thụ: Đo dung dịch DNA máy quang phổ có chương trình xử lý máy vi tính Mẫu DNA coi tinh tỷ số OD260/OD280 đạt 1,8 – 2,0 Mẫu pha lỗng 200 lần theo cơng thức: 995l

nước cất + l DNA mẫu Đo mẫu bước sóng  = 260 nm  = 280 nm Tính hàm lượng độ DNA theo cơng thức:

+ Hàm lượng DNA (ng/µl) = 50  HSPL  OD260

+ Độ DNA = OD260/OD280

Trong đó: 50: Hằng số

HSPL: Hệ số pha loãng

OD260: Chỉ số đo bước sóng 260nm

OD280: Chỉ số đo bước sóng 280nm

b) Điện di gel agarose xác định chất lượng DNA tổng số

Chuẩn bị gel agarose 1%, dung dịch đệm dùng cho điện di TAE 1X Tra mẫu thị phân tử (Marker) Chạy điện di 100V 30 phút Nhuộm gel dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel) 10 phút Rửa gel nước cất, sau soi qua tia cực tím chụp ảnh máy Gel Logic 1500 – Kodak –USA

7.3.2.3.2 Nhân tách dòng gen osDREB1F

Nhân gen osDREB1F PCR từ DNA hệ gen lúa

Phản ứng PCR thực với cặp mồi DREB1F/ DREB1R thiết kế dựa trình tự DNA GenBank với mã số AY78589 [60], cặp mồi tổng hợp hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi bảng 2.2

Bảng 2.3 Mồi nhân gen osDREB1F lúa

Mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi

DREB1F 5' - ATGGACACCGAGGACACGTCGTC - 3' 54OC

Thành phần phản ứng phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F lúa trình bày bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F ở lúa

1 Thành phần Thể tích(µl)

2 Nước khử ion vô trùng 12,85

3 Buffer 10X 2,5

4 dNTP (25mM) 2,5

5 Mg2+ (25mM) 2,5

6 DREB1F (10mM)

7 DREB1R (10mM)

8 Taq- polymerase(5U/µl) 0.15

9 Khn DNA(100ng/µl)

10 Tổng 25

Chu kỳ nhiệt: 94oC: phút; lặp lại 30 chu kỳ (94oC- phút, 56oC-

phút, 72oC- phút 30 giây); 72oC- 10 phút; 4oC - ∞ Sau chu kỳ cuối cùng,

chuyển nhiệt độ 4oC bảo quản trước tinh sạch, bảo quản -20oC Phương pháp làm sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR tinh kít Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trình sau:

- Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% cắt lấy băng quan tâm - Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB: V

Izopropanol = : : (1µl tương ứng với 1mg mẫu) Ủ 60o 10 phút, sau

gel tan hết ủ thêm phút cho gel tan hoàn toàn

- Bổ sung 500 µl dung dịch GB, để phút nhiệt độ phịng cho dung dịch GB tiếp xúc hồn tồn với sản phẩm PCR sau ly tâm 13000v/p phút, loại bỏ dịch chảy qua cột

- Rửa màng lọc chứa DNA PCR cách cho 500 µl dung dịch WB (Washing buffer) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Ly tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA PCR thật khô

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung dịch EB (Elution buffer) lên màng lọc, để nhiệt độ phòng phút, đem ly tâm 13000 vòng/phút phút, sau bỏ cột Thu mẫu DNA tinh Bảo quản -200C

Gắn gen vào vector tách dòng biến nạp vector tái tổ hợp

- Sản phẩm PCR làm từ thơi gen gắn vào vector tách dịng pBT sử dụng kit pGEM – T System

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dịng Tên hóa chất Thể tích (µl)

Nước tinh khiết 12,2

DNA khuôn (50ng/μl)

Vector pBT

Ligation buffer 10X

Enzyme T4 ligase (2 unit/μl) 0,8

Tổng thể tích 20

- Hỗn hợp ủ 220C giờ, sau biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli

được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào nguyên sinh chất Khi chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp không) nhân lên với tế bào chủ ni mơi trường dinh dưỡng thích hợp

Quy trình biến nạp sau:

Bổ sung 7µl vector gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH 5α trộn nhẹ, ủ đá lạnh (0 – 4oC) 30 phút, cho plasmid xuyên qua

màng chuyển nạp vào tế bào Sau hỗn hợp xử lý sốc nhiệt 42oC

1 phút chuyển vào ủ đá lạnh phút Bổ sung 400µl mơi trường LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút 37oC để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên vài chu kỳ sinh trưởng phát triển Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịch khuẩn lên đĩa mơi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) IPTG (100µM) Ủ đĩa 37oC 16 - 20

Chọn dòng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

Sau biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc môi trường thạch có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal (4mg/l), IPTG (100μM), ủ đĩa 370C 16 - 20 thu khuẩn lạc xanh trắng

Chọn 10 khuẩn lạc trắng mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18(có trình tự bắt cặp mồi vector cách khoảng 0,2kb) Thành phần phản ứng colony-PCR tương tự phản ứng PCR khác cặp mồi sử dụng mẫu DNA thay khuẩn lạc Điện di sản phẩm colony-PCR gel agarose 1% để chọn khuẩn lạc chứa plasmit mong muốn Đồng thời, nuôi khuẩn lạc ml mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l nhằm mục đích tách plasmit

Tách DNA plasmid tái tổ hợp

- Thành phần dung dịch lysozym: lysozym; Tris-HCl 0,5M, pH=7,5; EDTA 0,5M, pH=8,0 Quy trình:

- Chọn khuẩn lạc trắng riêng rẽ, nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l ampicillin qua đêm 37oC

- Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000v/p phút, loại dịch

- Bổ sung 200μl TELT, 10μl lysozym, khuấy tan để khuẩn tan hết

- Để nhiệt độ phòng phút, ủ 95oC phút, ủ 4oC

phút, ly tâm 13000v/p 15 phút

- Hút dịch sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung lượng tương đương isopropanol, ly tâm 13000v/p 15 phút

- Loại dịch nổi, rửa tủa lần cồn 70% - Làm khơ plasmit máy Speed Vac

- Hồ tan Plasmit 40 ml nước cất khử ion khử trùng - Bổ sung 0,1μl RNase, ủ 37oC

- Tinh plasmit để đọc trình tự Quy trình tinh plasmit

- Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu : VPB = : 5, mix nhẹ

- Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, li tâm 13000v/p phút - Loại dịch, ly tâm bổ sung phút để loại đệm rửa Cho cột tinh vào ống eppendorf 1,5ml

- Bổ sung 30μl nước khử ion khử trùng, để nhiệt độ phòng 1-2phút, ly tâm 13000v/p phút

7.3.2.4 Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro việc đánh giá nâng cao khả chống chịu trồng

7.3.2.4.1 Cơ sở khoa học kĩ thuật nuôi cấy in vitro

Cơ sở thứ hai mô quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm số lượng lớn tế bào khơng đồng Vì thế, quần thể tế bào ni cấy xem quần thể thực vật mà diễn thay đổi kiểu gen, kiểu hình tuổi Khi tế bào tái sinh thành thể thay đổi mức độ thể Thậm chí có quần thể tế bào phát triển từ tế bào ban đầu suốt trình sinh trưởng phát triển tế bào đến thành thể hồn chỉnh diễn nhiều thay đổi di truyền ảnh hưởng yếu tố môi trường ni cấy, đặc biệt chất điều hồ sinh trưởng Tế bào ni cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn chọn cá thể đột biến nhanh có hiệu so với phương pháp chọn giống thông thường khác áp dụng nguyên vẹn Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào cịn cho phép làm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn tính trạng mong muốn [6], [24], [27]

Những hệ thống nuôi cấy sử dụng chọn dịng tế bào soma: + Ni cấy mơ sẹo

+ Nuôi cấy tế bào huyền phù + Nuôi cấy tế bào trần

Các phương pháp chọn dòng tế bào + Chọn dòng trực tiếp

+ Chọn dòng tổng thể + Chọn dòng tổng thể

nhân phân li theo định luật Mendel sau lai, đột biến DNA quan tử lục lạp ti thể di truyền theo dòng mẹ [27], [30]

7.3.2.4.2.Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả chống chịu trồng

Để nâng cao khả chống chịu trồng, tác giả ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để chọn dịng có khả chống chịu tốt trì dịng chống chịu để làm giống, cải thiện giống gốc khơng có khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi chịu nhiệt độ thấp [16], [24], [37], [38], chịu nóng [23], chịu mặn [13], [15], [29], [37], [39], chịu hạn [20], [21], [25], [26]

Một hướng nghiên cứu quan tâm nghiên cứu thu nhiều thành công đáng kể chuyển gen liên quan đến tính chống chịu vào trồng, sau ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả chống chịu cho [48]

Bằng kỹ thuật tách dịng giải trình tự gen dòng chọn lọc tác giả Lê Xuân Đắc (2007) so sánh có sai khác trình tự nucleotit dịng chọn lọc từ ni cấy mơ kết hợp gây đột biến so với giống gốc[5]

Ở Việt Nam, năm gần có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuyển gen để tạo dịng có khả chống chịu cao với stress môi trường như: chuyển gen kháng virus đốm thuốc lá, kháng thuốc trừ cỏ [9], chuyển gen nâng cao khả chịu mặn chịu hạn lúa [22], đậu tương [11], Lê Tấn Đức cs (2007) thành công chuyển gen kháng sâu cryIA(b) cryIA(c) vào cải hồng Mẫu chuyển gen chuyển lên môi trường nuôi cấy in vitro thu dòng Hồng dòng Cải chuyển gen tái sinh [8] Cao Lệ Quyên cs (2009) nghiên cứu phân lập chuyển gen MtOs DREB2A điều khiển tính chịu hạn vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium [22]

7.3.2.4.2 Một số nghiên cứu nhân tố phiên mã DREB osDREB1F liên quan đến khả chịu lạnh thực vật

Nhân tố phiên mã gen điều khiển phiên mã có khả hoạt hóa ức chế biểu gen chức thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển (cis acting element) vùng khởi động gen (promoter) tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu trình phiên mã gen chức Ngoài nhân tố phiên mã đóng vai trị quan trọng việc điều khiển tồn q trình sinh học thể sống Ngày có nhiều phương pháp nghiên cứu nhân tố phiên mã: nghiên cứu chức gen, nghiên cứu tương tác DNA nhân tố phiên mã [48]

ngoại cảnh bất lợi Trong số yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chống chịu thực vật có số yếu tố tham gia vào q trình phiên mã điều khiển tính chịu lạnh như: AP2/EREBP, DREB, MYB…[43], [48], [50]

Nhân tố phiên mã DREB họ gen tổng hợp protein tìm thấy nhiều tế bào sống thực vật gặp điều kiện bất lợi hạn hán, mặn lạnh Nhiều cơng trình nghiên cứu nhà khoa học giới cho rằng, DREB nhân tố tham gia tích cực vào q trình phiên mã cách kích hoạt nhanh chóng hoạt động gen tham gia trực tiếp chống lại điều kiện bất lợi môi trường hạn hán, mặn lạnh, nhân tố phiên mã DREB hoạt động không cần thông qua tác động ABA, [35], [44], [50]

Nghiên cứu cấu trúc protein họ DREB chúng có chứa vùng bảo thủ để gắn với trình tự DNA đặc hiệu AP2/ ERF, cho phép chúng tương tác với loạt gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA Các miền AP2/ERF bảo thủ yếu tố phiên mã có chứa tìm thấy nhiều lồi thực vật Vùng bảo thủ AP2/ERF protein DREB có khoảng 60 amino acid Thông qua đặc điểm cấu trúc yếu tố phiên mã DREB, chia chúng thành nhóm nhỏ từ A1 đến A6 Các protein DREB nhóm khác giữ nhiều vai

trị thực vật [48],[51]

Khi so sánh trình tự amino acid protein DREB từ nhiều loài khác cho thấy trình tự giống cao vùng AP2/ERF Tuy nhiên, trình tự giống vùng đầu N đầu C protein DREB Các nhóm protein DREB, ngoại trừ thành viên nhóm A4 A5, có mơ hình bảo thủ cao vùng cuối

các trình tự protein, LWSY (A1), GDDGFSLFxY (A2), GSIWDxxDPFF

(A3) KYPSxEIDW (A6) Vùng yếu tố phiên mã DREB có vùng bảo thủ

giàu Ser/thr gần kề vùng AP2/ERF, gắn với DNA chịu trách nhiệm phosphoryl hóa protein DREB điều kiện khử nước [47]

vùng AP2/EREBP gắn với trình tự promoter protein tương tác khác Nhân tố YRG vùng hút nước khu đầu N vùng AP2/EREBP, chứa đựng 19 đến 22 amino acid [47], [48]

Nhóm DREB có trật tự lõi cis acting element: DRY, A/GCCGAC Hai nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã DREB1 DREB2 bám đặc hiệu vào DRY Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn lạnh nhóm DREB2 điều khiển tính chịu hạn [48]

DREB nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ năm 80 kỷ XX, tập trung vào giống trồng hoa cúc, lạc, hướng dương…và thu thành định cho khoa học việc cải thiện khả chống chịu thực vật trước điều kiện môi trường khắc nghiệt biến đổi khí hậu Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… nghiên cứu giải trình tự gen DREB lồi cúc hướng dương, lúa; so sánh trình tự gen loài trồng hoang dại thấy có sai khác chúng từ họ đề xuất phương án cải thiện khả chống chịu thông qua việc cải tiến mức phân tử chế chống chịu điều kiện bất lợi môi trường sống chuyển gen mục tiêu từ lồi chống chịu tốt vào loài chống chịu [36], [48], [52]

Theo Yang đtg (2007) ông phân lập phân họ DREB đối tượng hoa cúc, theo phân họ gồm DmDREBa DmDREBb, gen mã hóa cho hai phân tử protein gồm 191 axit amin có khối lượng phân tử 21,66 20,99 kDa, protein gen biểu hoa cúc bị hạn lạnh [52]

Ở Arabidopsis sở tương tự đặc tính cấu trúc chuỗi axit amin, 10 DREBs phân thành nhóm, nhóm thứ gồm DREB3, DREB4, DREB5; nhóm thứ hai gồm W50, DREB6, DREB7 DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 DREB8; nhóm thứ tư gồm có DREB9 DREB10, nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 ERF2 [53]

hạn hán mặn OsDREB1A biểu kích hoạt gen COR kết tăng cường khả chịu hạn, mặn, lạnh [40]

Trong số phân nhóm DREB nhóm DREB1 có chức điều khiển tính chịu hạn mặn lạnh thực vật, có osDREB1F Qiuyun Wang cs (2008) phân lập từ DNA lúa, có mã số GenBank AY785897 với chiều dài 660 bp, mã hóa cho phân tử protein gồm 219 axit amin (kể axit amin mở đầu) với dự đoán khối lượng phân tử 23,8 kDa [48]

Các phân tích biểu nhân tố phiên mã cho thấy chúng cảm ứng số yếu tố bất lợi mặn, hạn, lạnh ABA, không bị cảm ứng tác nhân gây bệnh, thương tổn oxy hóa Nhân tố phiên mã hoạt động chủ yếu nhân phân tích nấm men cho thấy mã hóa cho tác nhân kích hoạt phiên mã liên kết đặc hiệu với yếu tố dre/crt Phân tích chuyển gen mang nhân tố phiên mã cho thấy tính chống chịu điều kiện bất lợi hạn, mặn lạnh tăng cường lúa cũng arabidopsis [48]

Các phân tích sâu cho thấy, bên cạnh khả kích hoạt gen cor (gen quy định tính trạng chịu lạnh) vùng điều khiển, osDREB1F cịn kích hoạt gen rd29b rab18 Điều cho thấy osDREB1F giữ chức q trình thích ứng điều kiện bất lợi từ mơi trường có phụ thuộc vào ABA [48]

Trong osDREB1F axit amin 48-107 có phạm vi miền AP2 đặc trưng, từ 31 đến 43 chứa tín hiệu định khu hạt nhân axit amin 107 211 có chứa thể hoạt hóa tên miền, tính cho yếu tố phiên mã OsDREB1F mã hoá AP2/EREBP điều khiển gen biểu gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi hạn, lạnh [48]

7.3.3 Xử lý kết tính tốn số liệu

Phân tích tính trạng số lượng theo phương pháp thống kê sinh học Mỗi cơng thức thí nghiệm đối chứng lấy ngẫu nhiên 30 Các giá trị thống kê như: trị số trung bình mẫu (X ), phương sai (2), độ lệch (), sai số trung

kê xử lý máy vi tính chương trình excel, mức ý nghĩa  = 0,05[17], [18], [28]

7.4 Kết thảo luận

7.4.1 Đặc điểm nông học dịng lúa chọn lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh

Các dịng chọn lọc giống gốc sau gieo khay mạ đưa trồng ngồi ruộng có khả sinh trưởng phát triển bình thường (hình 3.1; 3.2) Sau thời gian tiến hành theo dõi, đánh giá tiêu nông học vụ mùa 2017, kết trình bày bảng 3.1

Hình 3.1 Các dịng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống C27

Kết bảng 3.1 cho thấy, có sai khác đáng kể đặc điểm nơng học giống khác nhau, nhiên giống dịng chọn lọc lại khơng biến động nhiều Các tiêu có biến động lớn chiều cao cây,số nhánh hữu hiệu/ khóm, số hạt bông, chiều dài Chiều dài hạt, chiều rộng hạt, khối lượng 1000 hạt tiêu nơng học biến động Hệ số biến động dịng chọn lọc có xu hướng thấp so với đối chứng giống gốc, chứng tỏ đặc điểm nông học theo dõi ổn định dần

- Chiều cao

dần ổn định, thấp dịng R2.04( 2,86%) cao dòng R2.18( 5,78%) Trong số 14 dịng nghiên cứu có 8/14 dịng (chiếm 42,8%) có hệ số biến động nhỏ giống gốc

Tính trạng chiều cao dòng chọn lọc giống nghiên cứu có khác nhau, cụ thể: giống XCH có chiều cao thân dao động 78,56cm đến 87,12cm; từ 85,02 đến 91,09 cm (các dịng có nguồn gốc từ giống C27), từ 90,12 đến 116,52 cm (các dịng có nguồn gốc từ giống U17) Có 2/5 dịng chọn lọc có nguồn gốc từ giống XCH có chiều cao thân thấp giống gốc (cao 81,93cm); có 3/4 dịng giống C27 4/5 dòng giống U17 thấp giống gốc, lại dòng cao giống gốc Như chiều cao thân đa số dịng chọn lọc có xu hướng thấp giống gốc, mức độ ổn định nhiều dòng lại cao so với giống gốc

Hình 3.2 Các dịng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống XCH

Sự sai khác chiều cao dòng chọn lọc so với giống gốc kiểm tra hàm t– Test Two sample For Mean chương trình Exel (α = 0,05) ( Bảng 3.2) Kết cho thấy, sai khác chiều cao 80% số dòng giống XCH,75% số dòng giống C27, 80% số dịng giống U17 có ý nghĩa (Ttn> Tα) giảm chiều cao dịng cịn lại so với giống gốc khơng có ý nghĩa (Ttn< Tα)

Chiều dài bơng thay đổi tùy theo dịng nguồn gốc dịng Từ bảng 3.1 chúng tơi thấy, chiều dài dao động từ 25,78 cm đến 27,15 cm giống XCH; từ 23,34cm đến 24,01 cm giống C27; từ 24,07 cm đến 26,30 cm giống U17 Tất dịng có nguồn gốc từ giống XCH dài so với giống gốc ( dài 5,74 cm); 3/4 dòng giống C27 dài so với giống gốc ( dài 1,15 cm); có 1/5 dịng giống U17 có chiều dài bơng với giống gốc, lại tất dòng dài so với giống gốc ( dài 4,82 cm) Kiểm tra hàm t– Test Two sample For Mean chương trình Exel (α = 0,05) ( Bảng 3.2) cho thấy 85,71% số dịng có chiều dài bơng tăng có ý nghĩa (Ttn> Tα) Chiều dài bơng có hệ số biến động thấp dịng R2.44 ( 1,18%) cao dịng R2.08 (6,73%), có 11/14 dịng có hệ số biến động nhỏ so với giống gốc Điều chứng tỏ có ổn định nhanh tính trạng chiều dài bơng dịng chọn lọc hệ R2

- Kích thước hạt

Kích thước hình dạng hạt liên quan trực tiếp đến suất lúa, từ kết thu được, chúng tơi thấy kích thước hạt lúa tính trạng tương đối ổn định Chiều dài hạt dòng chọn lọc dao động khoảng 7,65mm – 8,97mm giống XCH; từ 7,91mm - 8,42 mm giống C27; từ 7,02mm - 8,05mm giống U17 Hệ số biến động chiều dài hạt không cao dao động khoảng 1,38% đến 2,92% Các dịng có nguồn gốc từ C27 có chiều dài hạt tăng so với giống gốc Dòng R2.06 R2.38 giống XCH có chiều dài hạt giảm so với giống gốc 1,16 mm; dịng R2.09 giống U17 có chiều dài hạt giảm so với giống gốc 0,23 mm Sự sai khác chiều dài hạt dòng chọn lọc so với giống gốc kiểm tra hàm t- Test Two sample For Mean ( bảng 3.2) cho thấy 78,57 % sai khác có ý nghĩa ( Ttn> Tα)

100% số dòng giống C27 60% số dòng giống U17 có chiều rộng hạt tăng so với giống gốc

Như qua nghiên cứu chúng tơi thấy đa số dịng chọn lọc có xu hướng tăng kích thước hình dạng hạt so với giống gốc cịn hệ số biến động lại có xu hướng giảm Kiểm tra hàm t- Test Two Sample For Mean ( Bảng 3.2) cho thấy sai khác 71,42% chiều rộng hạt tăng có ý nghĩa (Ttn>Tα)

- Số nhánh hữu hiệu/khóm

24

Bảng 3.1 Đặc điểm nông học mức độ biến dị dòng chọn lọc hệ R2 (n = 30, α = 0,05)

Các dòng/giống

Thời gian ST (ngày)

Chiều cao (cm) Chiều dài (cm)

Chiều dài hạt (mm)

Chiều rộng hạt(mm)

Số nhánh

hữuhiệu/khóm Số hạt chắc/bơng

Khối lượng

1000hạt (g) Năng suất (g/m2)

X ± sx Cv(%) X ± sx Cv(%) X ± sx Cv(%) X ± sx Cv(%) X ± sx Cv(%) X ± sx Cv(%) X ± sx Cv(%)

- Số hạt chắc/bông

Số hạt chắc/bông liên quan đến chiều dài xếp hạt/bơng dịng Tỉ lệ hạt chắc/ dao động từ 131,67 đến 160,35 giống XCH; từ 93,06 đến 102,8 giống C27 ; từ 90,72 đến 121,24 giống U17.Trong đó, giống XCH có 4/5 dịng có số hạt chắc/ bơng nhiều giống gốc (nhiều 62,76); giống C27 có 100% dịng có số hạt chắc/ bơng nhiều giống gốc (nhiều 30,25); giống U17 có 3/5 dịng có số hạt chắc/ nhiều giống gốc (nhiều 56,86) Trong số 14 dịng nghiên cứu dịng R2.44 có nguồn gốc từ giống XCH có số hạt chắc/ bơng tăng nhiều (tăng 24,93hạt/ bơng); dịng R2.09 có nguồn gốc từ giống U17 có số hạt chắc/ bơng giảm so với đối chứng (giảm 10,72 hạt/ bông) Kiểm tra hàm t- Test Two Sample For Mean (Bảng 3.2) cho thấy sai khác 85,71% số hạt chắc/ bơng tăng có ý nghĩa (Ttn> Tα) Số hạt chắc/bơng có hệ số biến động dao động thấp dòng R2.04 (12,92%), cao dòng R2.20 (23,86%) Trong 14 dịng nghiên cứu có 11 dịng có hệ số biến động nhỏ so với giống gốc

- Khối lượng 1000 hạt

Các dịng có nguồn gốc từ giống XCH khối lượng 1000 hạt dao động từ 27,18g đến 29,77g; từ 18,61g đến 24,47g giống C27; từ 26,42g đến 28,25g giống U17 Có 60% số dịng có nguồn gốc từ giống U17 C27 có khối lượng 1000 hạt cao giống gốc, giống XCH có 75% số dịng có khối lượng 1000 hạt cao giống gốc Trong 14 dịng nghiên cứu có dịng R2.44 có khối lượng 1000 hạt tăng cao 29,77g tăng 1,9g so với đối chứng (27,87g), dịng R2.06 có khối lượng 1000 hạt thấp 26,42g giảm 0,92g so với đối chứng (18,76g) Hệ số biến động khối lượng 1000 hạt dòng chọn lọc giống gốc dao động khơng lớn, có 64,2% số dịng chọn lọc có hệ số biến động thấp so với đối chứng Chứng tỏ ổn định nhanh dòng

Năng suất khóm dao động từ 1067,05g/m2 đến 1288,48g/m2 giống XCH; từ 823,78g/m2 đến 957,19g/m2 giống C27; từ 812,76g/m2 đến 987,46g/m2 giống U17 Trong14 dịng nghiên cứu có dịng có suất khóm cao giống gốc, dịng R2.44 có suất khóm cao 1288,48 g/m2 tăng 183,02 g/m2 so với giống gốc (1105,46g/m2), dịng R2.09 có suất khóm thấp 812,76 g/m2 giảm 60,17 g/m2 so với đối chứng(872,93g/m2)

Bảng 3.2 Giá trị Tα, Ttn số đặc điểm nông học của dòng chọn lọc hệ R2(α = 0,05)

Dịng Ttn Tα Chiều cao Chiều dài bơng Chiều dài hạt Chiều rộng hạt

Số nhánh hữu hiệu/khóm

Số hạt chắc/bông

R2.06 2,15 1,94 2,03 3,25 2,17 2,07

2,04

R2.13 2,26 2,07 2,17 2,74 2,78 2,63

R2.20 2,05 3,56 3,24 2,91 4,87 6,42

R2.38 1,96 2,01 3,06 1,87 2,67 2,11

R2.44 3,14 2,55 2,25 3,57 2,45 3,77

R2.03 1,87 5,89 2,89 1,82 3,29 2,45

R2.08 2,34 4,45 5,17 2,09 3,67 2,05

R2.16 4,67 3,47 1,92 2,14 1,95 3,89

R2.18 8,15 2,75 2,67 3,72 5,34 4,23

R2.01 1,92 2,09 2,58 4,15 4,78 5,68

R2.04 3,37 3,45 3,15 1,94 2,81 2,97

R2.05 2,54 2,34 4,36 3,08 3,08 2,67

R2.09 5,87 2,87 2,73 1,85 2,87 1,89

R2.11 2,01 3,25 2,46 2,58 2,65 2,85

- Thời gian sinh trưởng

Kết bảng 3.1 cho thấy, thời gian sinh trưởng vụ mùa đối tượng nghiên cứu dao động từ 85 – 150 ngày Trong tất dịng có nguồn gốc từ giống XCH có thời gian sinh trưởng ngắn so với giống gốc từ 13 – 17 ngày; có 2/4 dịng thuộc giống C27 có thời gian sinh trưởng ngắn giống gốc 12 ngày, dịng cịn lại có thời gian sinh trưởng với giống gốc(100 ngày); có 2/5 dịng thuộc giống U17 có thời gian sinh trưởng ngắn giống gốc 19 ngày, 3/5 dịng cịn lại có thịi gian sinh trưởng cao so với giống gốc từ ngày Thời gian sinh trưởng ngắn có ý nghĩa lớn công tác chọn lọc giống trồng nhằm rút ngắn thời gian sản xuất tăng suất, sản lượng trồng

* Nhận xét đặc điểm nơng học dịng chọn lọc hệ R2

(1) Qua theo dõi đặc điểm nông học dòng chọn lọc hệ R2 tơi nhận thấy dịng chọn lọc có số tiêu nơng học số nhánh hữu hiệu/ khóm, số hạt chắc/ bơng hệ số biến động cịn cao dần ổn định, đặc điểm nông học cịn lại chiều cao cây, chiều dài bơng, khố lượng 1000 hạt có hệ số biến động có xu hướng nhỏ so với giống gốc

(2) Tơi chọn số dịng có đặc điểm bật Từ giống XCH thu dòng R2.13 R2.44; từ giống C27 thu dòng R2.08; từ giống U17 thu dịng R2.05 Các dịng có nhiều tính trạng bật so với dịng khác chiều cao thấp hơn, đẻ nhánh tốt, chiều dài bông, số hạt chắc/ bông, khối lượng 1000 hạt cao hệ số biến động nhỏ so với giống gốc

7.4.2 Kết đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R3 7.4.2.1 Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R3 giai đoạn mạ phương pháp gây lạnh nhân tạo

A B

C D

Hình 3.3 Các dịng chọn lọc R3 giai đoạn mạ thời điểm trước trước sau xử lý lạnh (A, B: Trước xử lý lạnh; C, D: Sau 32 xử lý lạnh)

Để đánh giá khả chịu lạnh số dòng lúa hệ R3 giai đoạn non, tiến hành xử lý mạ nhiệt độ 40C ± 0,50C thời gian 32

giờ, sau ni phục hồi nhiệt độ phịng (250C- 30oC) Khi mạ bắt đầu có tượng héo tiến hành đánh giá khả chịu lạnh Khả chịu lạnh xác định tỷ lệ thiệt hại lạnh gây Kết trình bày bảng 3.3

dịng R3.44 có tỷ lệ chết thiệt hại thấp (14,35% ; 44,05%) so với giống gốc ( 31,33%; 64,80%) Có 100% dịng thuộc giống XCH có tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại thấp so với giống gốc Trong 14 dịng nghiên cứu có 11/14 dịng có tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại thấp giống gốc Như qua nghiên cứu chúng tơi nhận thấy đa số dịng có xu hướng thấp so với giống gốc tỉ lệ chết tỉ lệ thiệt hại Chứng tỏ dịng chọn lọc có khả chịu lạnh tốt so với giống gốc giống nghiên cứu giai đoạn mạ có khả chịu lạnh mức độ khác

Bảng 3.3 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C

32 giai đoạn mạ dòng chọn lọc hệ R3 Dòng giống gốc Tỷ lệ chết(%) Tỷ lệ thiệt hại (%)

XCH 31,33 ± 0, 21 64,80 ± 0,35

R3.06 25,41 ± 1,32 60, 02 ± 0,62 R3.13 17,00 ± 1,05 45,37 ± 0,37 R3.20 26,67 ± 0,45 56,93 ± 0,29 R3.38 22,65 ± 0,23 55,07 ± 0,32 R3.44 14,35 ± 1,09 44,05 ± 0,63

C27 35,15 ± 0,34 61,02 ± 1,03

R3.03 24,37 ± 1,09 46,75 ± 0,62 R3.08 22,56 ± 0,45 53,35 ± 0,25 R3.16 25,24 ± 0,28 63,08 ± 0,52 R3.18 37,68 ± 1,05 56,72 ± 0,47

U17 31,08 ± 0,57 74,68 ± 1,05

R3.01 35,42 ± 0,25 69,74 ± 1,34 R3.04 25,17 ± 0,83 48,92 ± 0,92 R3.05 24,64 ± 1,12 51,25 ± 0,53

R3.09 27,29± 0,85 75,34 ± 1,05

Kết rằng, giống có tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại thấp giống có khả chịu lạnh tốt ngược lại, giống có tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại cao giống có khả chịu lạnh Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu tính chịu lạnh [1], chịu nóng [23], tính chịu mặn lúa [29] ( giống có tỉ lệ chết tỉ lệ thiệt hại cao giống có khả chịu nóng, chịu mặn ngược lại)

7.4.2.2 Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R3 giai đoạn mạ thông qua xác định hàm lượng diệp lục

Diệp lục thành phần quan trọng máy quang hợp Hàm lượng diệp lục ảnh hưởng lớn đến hoạt động quang hợp nên số nhiều tài liệu sử dụng để đánh giá tính chống chịu thực vật mơi trường bất lợi, có stress lạnh Để tìm hiểu ảnh hưởng lạnh đến lúa, tiến hành phân tích hàm lượng diệp lục lúa giai đoạn mạ ba sau xử lý lạnh 12oC ± 0,5oC Kết phân tích trình bày bảng 3.4

Số liệu bảng 3.4 cho thấy, hàm lượng diệp lục dịng chọn lọc có biến động rõ rệt Cây mạ sinh trưởng điều kiện nhiệt độ phù hợp 25oC - 30oC hàm lượng diệp lục tăng dần theo thời gian phát triển tất

các dòng

Hàm lượng diệp lục cao ngày R3.44 thuộc giống XCH 18,35 mg/g tươi ngày tăng lên 19,63 mg/g tươi Hàm lượng diệp lục thấp ngày giống gốc U17 16,24mg/g tươi tăng lên 17,01 mg/g tươi ngày

Bảng 3.4 Hàm lượng diệp lục sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C giai đoạn mạ

3 dòng chọn lọc hệ R3 Dòng

giống gốc

Thời gian xử lý(ngày)

Hàm lượng diệp lục(mg/g tươi)

Không xử lý Xử lý lạnh % so với không xử lý

XCH 16,34 ± 0,14 10,32 ± 0,12 63,15

5 18,01 ± 0,06 4,51 ± 0,15 25,04

R3.06 16,51 ± 0,15 10,83 ± 0,06 65,60

5 17, 87 ± 0,12 5,46 ± 0,15 30,55

R3.13 18,72 ± 0,03 11,49 ± 0,02 64,62

5 19,36 ± 0,05 8,45 ± 0,03 43,65

R3.20 16,25 ± 0,05 10,36 ± 0,18 63,75

5 17,34 ± 0,12 6,91 ± 0,07 39,85

R3.38 17,78 ± 0,14 10,38 ± 0,07 58,38

5 19,04 ± 0,04 6,87 ± 0,09 36,08

R3.44 18,35 ± 0,12 12,58 ± 0,24 68,56

5 19,63 ± 0,03 8,65 ± 0,27 44,07

C27 16,76 ± 0,34 9,92 ± 0,03 59,19

5 17,89 ± 0,34 5,74 ± 0,15 31,92

R3.03 16,83 ± 0,36 10,36 ± 0,11 61,56

5 18,15 ± 0,16 5,61 ± 0,13 30,91

R3.08 17,34 ± 0,05 10,97 ± 0,15 63,26

5 18,36 ± 0,21 7,52 ± 0,14 40,96

R3.16 16,75 ± 0,42 10,25 ± 0,02 61,19

5 17,63 ± 0,33 5,09 ± 0,15 28,87

R3.18 16,78 ± 0,04 9,51 ± 0,15 56,67

5 17,19 ± 0,29 6,89 ± 0,18 40,08

U17 16,24 ± 0,14 9,36 ± 0,29 57,63

5 17,01 ± 0,3 5,82 ± 0,11 34,21

R3.01 17,76 ± 0,11 10,19 ± 0,06 57,38

5 18, 09 ± 0,04 6,06 ± 0,13 33,50

R3.04 17,21 ± 0,12 10,52 ± 0,09 61,13

5 18,35 ± 0,17 7,25 ± 0,04 39,50

R3.05 16,79 ± 0,18 10,41 ± 0,02 62

5 18,11 ± 0,2 6,75 ± 0,03 37,27

R3.09 17,65 ± 0,03 10,51 ± 0,15 59,55

5 17,33 ± 0,35 6,45 ± 0,12 35,19

R3.11 17,34 ± 0,13 9,89 ± 0,07 57,04

Khi xử lý lạnh, hàm lượng diệp lục tất dòng giảm cách nhanh chóng Sau ngày xử lý lạnh, hàm lượng diệp lục dòng dao động từ dòng R3.44 có nguồn gốc từ XCH có hàm lượng diệp lục giảm 14 dịng nghiên cứu ( 12,58 mg/g tươi) 68,56% so với đối chứng; hàm lượng diệp lục giảm nhiều dòng R3.18 ( 9,51mg/g tươi) có nguồn gốc từ C27 thấp so với giống gốc ( 9,92mg/g tươi) 56,67% so với đối chứng Có 92,86% số dịng chọn lọc có hàm lượng diệp lục cao giống gốc sau ngày xử lý lạnh nhân tạo Có 100% số dịng giống XCH U17 có hàm lượng diệp lục giảm so với giống gốc

Sau ngày xử lý lạnh hàm lượng diệp lục giảm xuống thấp dòng R3.16 giống C27 5,09 mg/g tươi, 28,87% so với đối chứng giảm mạnh 14 dòng nghiên cứu, dòng R3.44 có nguồn gốc từ giống XCH có hàm lượng diệp lục giảm tất dịng (8,65mg/g tươi) 44,47% so với đối chứng Có 12/14 dịng có hàm lượng diệp lục cao so với giống gốc sau xử lý lạnh, có dịng có nguồn gốc từ C27 R3.03 (5,61mg/g tươi) R3.16 (5,09mg/g tươi) có khả chịu lạnh so với giống gốc (5,74mg/g tươi) đồng thời chịu lạnh 14 dòng nghiên cứu

Kết bảng 3.4 cho thấy, nhiệt độ môi trường thấp ảnh hưởng lớn đến hàm lượng diệp lục cây, giai đoạn non Nhiệt độ môi trường giảm xuống thấp làm cho diệp lục bị phá hủy cách nhanh chóng, mạ bị vàng Nếu thời gian lạnh kéo dài, mạ bị bạch tạng tham gia quang hợp để tổng hợp chất hữu cần thiết, làm cho mạ bị héo chết Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu trước [1]

7.4.2.3 Mối tương quan tỷ lệ thiệt hại hàm lượng diệp lục dòng chọn lọc hệ R3 giai đoạn mạ

Khi nghiên cứu tỷ lệ thiệt hại hàm lượng diệp lục mạ cho thấy, giống gốc dòng chịu ảnh hưởng lạnh mức độ khác

Bảng 3.5 Tương quan hàm lượng diệp lục mức độ thiệt hại Dòng giống gốc Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R

XCH Y = - 1,92X + 0,67 0,93

R3.06 Y = - 1,27X + 0,82 0,91

R3.13 Y = - 1,85X+ 0,72 0,98

R3.20 Y = - 1,84X + 0,58 0,89

R3.38 Y = - 1,89X + 0,94 0,87

R3.44 Y = - 1,96X + 0,75 0,97

C27 Y= - 1,86X + 0,77 0,85

R3.03 Y= - 1,92X + 0,68 0,88

R3.08 Y = - 1,15X + 0,87 0,94

R3.16 Y = - 2,16X + 0,85 0,86

R3.18 Y = - 1,12X + 0,94 0,95

U17 Y = - 1,25X + 0,81 0,86

R301 Y = - 2,04X + 0,79 0,88

R3.04 Y = - 1,73X + 0,63 0,96

R3.05 Y = - 1,62X + 0,98 0,92

R3.09 Y = - 1,49X + 0,96 0,87

R3.11 Y = - 1,57X + 0,88 0,89

* Nhận xét khả chịu lạnh giai đoạn mạ dòng lúa nghiên cứu hệ R3

(1) Tiến hành xử lý lạnh mạ 4oC ± 0,5oC 32 giờ, kết

cho thấy, tỷ lệ chết thiệt hại dịng khác Dịng R3.11 có nguồn gốc từ giống U17 có tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại cao dịng R3.44 có nguồn gốc từ XCH có tỷ lệ chết thiệt hại thấp

(2) Khi gây lạnh mạ giống 12oC ± 0,5oC thời gian ngày, hàm lượng diệp lục dịng nghiên cứu giảm xuống nhanh chóng theo thời gian xử lý Ở ngày ngày hàm lượng diệp lục giảm nhiều dòng R3.16 R3.18 có nguồn gốc từ giống C27, giảm dịng R3.44 có nguồn gốc từ XCH Các dịng nghiên cứu có xu hướng giảm hàm lượng diệp lục so với giống gốc sau xử lý lạnh

(3) Tỉ lệ thiệt hại hàm lượng diệp lục có mối tương quan nghịch chặt chẽ 7.4.3 Đánh giá chất lượng hạt số dịng chọn lọc R3 có nguồn gốc từ giống XCH thơng qua số tiêu hóa sinh

Để đánh giá chất lượng hạt tiến hành nghiên cứu số tiêu hóa sinh hạt tiềm sinh Kết trình bày bảng 3.6

Bảng 3.6 cho thấy hàm lượng lipit dòng chọn lọc giống gốc nghiên cứu dao động từ 3,45% đến 6,28% Tất dòng chọn lọc có hàm lượng lipit cao so với giống gốc Trong đó, dịng R3.44 có hàm lượng lipit cao với 6,28%, tăng so với giống gốc 2,83% Dịng R3.24 có hàm lượng lipit tăng thấp nhất, tăng 0,71% so với giống gốc (3,45%) Như vậy, dịng chọn lọc từ giống XCH có thay đổi so với giống gốc hàm lượng lipit theo hướng tăng

Bảng 3.6 Một số tiêu hố sinh dịng chọn lọc R3 thuộc giống XCH

(Đơn vị: % KLK)

Giống gốc

và dòng R3 Hàm lượng lipit Hàm lượng protein

Hàm lượng đường khử

XCH 3,45±0,01 4,15±0,32 2,02±0,06

R3.06 4,72±0,07 7,17±0,65 2,35±0,03

R3.13 5,94±0,03 8,42±0,29 2,43±0,02

R3.20 4,48±0,06 5,83±0,23 2,28±0,04

R3.24 4,16±0,08 5,74±0,31 2,13±0,05

R3.38 5,63±0,09 8,12±0,57 2,39±0,03

R3.44 6,28±0,02 8,91±0,02 2,51±0,02

Hàm lượng đường dao động từ 2,02% đến 2,51% Hàm lượng đường cao dòng R3.44 với 2,51%, sau R3.13 với 2,43%, tiếp đến dòng R3.38 với 2,39%; R3.06 với 2,35%; R3.20 với 2,28% R3.24 với 2,13% Tất dịng chọn lọc R3 có hàm lượng đường cao so với giống gốc(2,02%)

Những dịng lúa có hàm lượng lipit, hàm lượng protein, hàm lượng đường hạt tiềm sinh cao dịng có chất lượng hạt tốt Qua phân tích cho thấy dịng chọn lọc hệ R3 có hàm lượng lipit, hàm lượng protein hàm lượng đường hạt tiềm sinh cao so với giống gốc Chứng tỏ dịng có chất lượng hạt tốt so với giống gốc

Như vậy, dòng chọn lọc dòng có chất lượng hạt tốt R3.44 l, chất lượng hạt dòng giống gốc xếp theo thứ tự tăng dần sau:

7.4.4 Phân lập tách dòng gen OsDREB1F liên quan đến khả chịu lạnh lúa

Qua nghiên cứu đặc điểm nông học hệ R2, đặc điểm hoá sinh khả chịu lạnh dòng chọn lọc so với giống gốc thể hệ R3 chọn giống lúa Xuân Châu Hương hai dòng R3.13 R3.44 có đặc điểm bật (thời gian sinh trưởng ngắn, chiều dài tăng, số nhánh hữu hiệu/khóm, số hạt bơng, khối lượng 1000 hạt suất cao so với đối chứng dòng khác), để tiến hành phân lập tách dòng gen liên quan đến khả chịu lạnh

7.4.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số dòng chọn lọc R3.13 R3.44 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh

DNA tổng số vật liệu khởi đầu cho nghiên cứu cấp độ phân tử Chất lượng DNA tổng số có vai trị quan trọng định thành cơng thí nghiệm Tơi tiến hành tách chiết DNA tổng số hai dịng lúa nước R3.13 R3.44 có nguồn gốc từ giống XCH theo phương pháp Foolad cs (1995) [41] Sau tách DNA tổng số, tiến hành kiểm tra chất lượng nồng độ DNA tổng số cách điện di gel agarose 1% đệm TAE 1X, nhuộm gel ethydium bromide soi ánh đèn cực tím cho thấy mẫu DNA thu có chất lượng tốt, DNA tập trung băng khơng bị đứt gãy (hình 3.4) Đo OD 260nm 280nm, xác định hàm lượng DNA dung dịch R3.13 115,3µg/ml R3.44 145,62µg/ml Như chất lượng hàm lượng dòng lúa đủ điều kiện để thực phản ứng

7.4.4.2 Nhân gen OsDREB1F kỹ thuật PCR

Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen OsDREB1F với cặp mồi thiết kế dựa trình tự DNA phân lập từ lúa cơng bố Qiuyun Wang cs (2008), có mã số GenBank AY785897 [48] Gen OsDREB1Fcó chiều dài 660 bp mã hóa cho phân tử protein gồm 219 axit amin với khối lượng phân tử 23,8 kDa.Trên sở xác định nồng độ DNA khuôn tối ưu cho phản ứng PCR, tiến hành nhân gen OsDREB1F dịng lúa có khả chịu lạnh tốt R3.13 R3.44 có nguồn gốc từ XCH

Phản ứng PCR để nhân gen thực máy PCR với cặp mồi đặc hiệu DREB1F DREB1R Nhiệt độ gắn mồi 54oC, kích thước đoạn gen cần nhân ước tính khoảng 570bp Kết nhân gen thể hình 3.5

M

Hình 3.5 Kết nhân gen osDREB1F mẫu lúa M: marker; 1: R3.13; 2: R3.44

Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen DREB1F hình 3.5 cho thấy, mẫu nghiên cứu xuất phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước gần theo tính tốn lý thuyết khoảng 570bp, hàm lượng sản phẩm đủ lớn để sử dụng cho việc tách dòng gen.Tiến hành tinh phân đoạn DNA theo Kit hãng Bioneer ( AccuPrep PCRPurification Kit) để thu nhận đoạn gen mong muốn trước biến nạp để chuẩn bị cho bước tách dòng gen

7.4.4.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chọn dòng plasmit tái tổ hợp mang gen osDREB1F

Gen quan tâm sau nhân lên nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tinh nối vào vector tách dịng pBT Trình tự gen quan tâm nối vào vị trí MCS (multiple conoling site) trình tự gen GUS có pBT

Sau vector pBT biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α cấy trải mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin, chất X-gal, chất cảm ứng IPTG Sau tế bào ni 370C 16

Hình 3.6 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Khi có khuẩn lạc xanh khuẩn lạc trắng mọc môi trường chọn lọc chứng tỏ chúng mang vector pBT Trong Những khuẩn lạc xanh xuất vector pBT lac-operon hoạt động bình thường, khơng có đoạn gen lạ xen vào, có chất cảm ứng IPTG tổng hợp enzim  -galactosidase, enzym chuyển hoá chất X-gal thành hợp chất có màu

khơng tổng hợp enzym  -galactosidase khơng xảy chuyển hố X-gal Lac operon bị bất hoạt đoạn DNA ngoại lai xen vào promoter operon gen lacZ Chính lac operon khơng thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên khơng có dịch mã thành enzym

Để kiểm tra xem dòng khuẩn lạc trắng có mang gen quan tâm khơng, tiến hành phản ứng conoly PCR với cặp mồi pUC18 Kết thể hình 3.7

M

Hình 3.7 Kết conoly PCR từ dòng khuẩn lạc trắng (M: marker; 1-2: dòng khuẩn lạc mẫu R3.13; 3-5: dòng khuẩn lạc mẫu R3.44)

Vì pUC mồi thiết kế chung cho vector tách dòng nên kiểm tra sản phẩm colony-PCR vừa dịng hố kích thước sản phẩm cao đoạn gen mã hóa osDREB1F Kết kiểm tra cho thấy kích thước gen quan tâm vị trí tăng 180 bp so với PCR với mồi pUC18 Kết hình 3.7 cho thấy giếng từ đến xuất vạch vị trí khoảng 750 bp, phù hợp với tính tốn lý thuyết kích thước gen quan tâm PCR với mồi pUC18 Có thể kết luận ban đầu dịng khuẩn lạc tương ứng mang gen quan tâm Các dịng mang plasmid có gen osDREB1F nhân lên để tách plasmid

750 bp

7.4.4.4.Tách DNA plasmid tái tổ hợp

Nuôi khuẩn lạc trắng chọn colony-PCR mang gen osDREB1F 3ml môi trường LB lỏng tách phục vụ cho việc xác định trình tự Tế bào thu cách ly tâm, hoà tan TELT, lysozym bổ sung nhằm phá vỡ màng tế bào vi khuẩn Bổ sung izopropanol làm kết tủa DNA, protein Làm DNA cồn 80% Sau ủ với Ribonuclease để loại hết RNA Cuối cùng, plasmit tiếp tục tinh để đọc trình tự nucleotit Plasmit tinh điện di kiểm tra gel agrarose 0,8%

M

Hình 3.8 Kết tách chiết plasmid dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp M: marker; 1, 2: plasmid mang gen tương ứng mẫu R2.13, R2.44

Kết tách chiết plasmid hình 3.8 cho thấy, mẫu DNA plasmit tinh đạt kết tốt, có băng vạch rõ nét gọn chứng tỏ plasmid không bị đứt gẫy có hàm lượng lớn đủ điều kiện cho bước giải trình tự

Để khẳng định lại plasmit cần tìm có gắn đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chọn DNA plasmit tinh mẫu thí nghiệm để tiến hành cắt enzym giới hạn BamHI 37oC Vị trí enzym

trong vector nằm hai đầu đoạn gắn Vì trình tự gen osDREB1F liệu NCBI có điểm cắt enzym giới hạn vị trí khoảng 430 bp Kết cắt thể hình 3.9

M

Hình 3.9 Kết cắt plasmid dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp M: marker; 1, 2: plasmid mang gen tương ứng mẫu R2.13, R2.44

Trên hình 3.10 cho thấy giếng có băng băng có kích thước khoảng 2500 bp plasmid pBT băng gen osDREB vị trí tính tốn lý thuyết xấp xỉ 430 bp Như lấy plasmid đem đọc trình tự

8 NHỮNG THƠNG TIN CẦN BẢO MẬT (NẾU CÓ) 9 CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC HIỆN

Sáng kiến kinh nghiệm: “Đánh giá số dòng lúa chọn lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh tỉnh Vĩnh Phúc” áp dụng xã Đại Đồng, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh phúc thời gian năm, để sáng kiến có hiệu cao cần có thêm điều kiện sau:

- Việc đánh giá dòng lúa phải thực phạm vi diện tích lớn để đảm bảo tính xác, khoa học

- Để đánh giá khả chịu lạnh dòng lúa cần tiến hành thời gian số vụ khác

- Cần có tạo điều kiện thời gian, hỗ trợ vật chất giống, phân bón quan, đơn vị địa bàn tỉnh : sở nông nghiệp phát triển nông thôn, sở giáo dục đào tạo, trường THPT Nguyễn Thị Giang…

2500 bp

10 ĐÁNH GIÁ LỢI ÍCH CỦA VIỆC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN

Sau thời gian nghiên cứu đề tài “Đánh giá số dòng lúa chọn lọc hệ R2 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh tỉnh Vĩnh Phúc” đề tài thu số hiệu sau:

1 Các dịng chọn lọc hệ R2 có nhiều đặc điểm bật so với giống gốc (chiều cao cao, chiều dài bơng, số nhánh hữu hiệu/khóm, khối lượng 1000 hạt ) Mức độ biến động nhiều tính trạng nơng học có ổn định hệ R2 cho phép rút ngắn thời gian chọn lọc

2 Ở giai đoạn mạ có 74,2% dịng chọn lọc có gia tăng khả chịu lạnh so với giống gốc, đặc biệt dòng R3.13, R3.04 R3.44 Sau xử lý lạnh có 12/14 dịng chọn lọc có hàm lượng diệp lục cao giống gốc Sự giảm sút hàm lượng diệp lục có mối tương quan nghịch với khả chịu lạnh dòng nghiên cứu

3 Thu 100% dòng chọn lọc hệ R3 có nguồn gốc từ giống XCH có chất lượng hạt tốt so với giống gốc R3.44 tốt

4 Đã khuếch đại, tách dòng thành cơng osDREB1F hai dịng chọn lọc có nguồn gốc từ giống lúa XCH R3.13 R3.44

5 Từ dòng chọn lọc qua hệ chọn dòng bật R3.13 R3.44 có nguồn gốc từ giống lúa XCH có đặc điểm suất cao khả chịu lạnh cao so với giống gốc

6 Đề nghị:

Dịng R3.13 R3.44 có nguồn gốc từ giống XCH có khả chịu lạnh tốt số dịng lúa nghiên cứu, tuyển chọn cho vùng trồng lúa thường xuyên xảy lạnh giá

11 DANH SÁCH NHỮNG TỔ CHỨC, CÁ NHÂN THAM GIA ÁP DỤNG THỬ HOẶC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN LẦN ĐẦU:

STT Tên tổ chức/ cá nhân

Địa Phạm vi, lĩnh vực áp dụng sáng kiến Phùng Thị Quảng Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường-

Vĩnh Phúc

Thử áp dụng lần đầu

2 Nguyễn Thị Sen Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc

Thử áp dụng lần đầu

3 Nguyễn Thị Tư Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc

Thử áp dụng lần đầu

4 Nguyễn Thị Liễu Xã Đại Đồng- huyện Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc

Thử áp dụng lần đầu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Vĩnh Tường, ngày 12 tháng năm 2019 P.Hiệu trưởng phụ trách CM

Lê Hoàng Hiệp

Vĩnh Tường, ngày 12 tháng năm 2019 Tác giả sáng kiến

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1 Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả chịu lạnh chịu khô mức độ mơ sẹo lúa giống có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí Sinh học, 17 (1), tr 25 – 29

2 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu

ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội

3 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối

với thiệt hại môi trường lúa, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ

Chí Minh

4 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành

hoá sinh học, NXB Giáo dục, tr 54 - 55

5 Lê Xuân Đắc (2007), Nghiên cứu biện pháp công nghệ sinh học thực vật nhằm cải biến tính trạng chiều cao lúa, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội

6 Lê Xuân Đắc (1998), “Sự dụng công nghệ tế bào thực vật vào việc cải tiến

một số đặc điểm nông học giống lúa C71 nếp TK90” Luận văn thạc sĩ

Sinh học, viện Công Nghệ Sinh Học Việt Nam

7 Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình lúa, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh

8 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), ‘‘Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu ứng dụng tạo trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens’’, Hội nghị Khoa học

Công nghệ 2007, tr 345 - 350

9 Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), ‘‘Tạo thuốc kháng thuốc trừ cỏ côn trùng ’’, Hội nghị Khoa học

Công nghệ 2007, tr 351 - 357

10 Nguyễn Thị Thu Hoài (2005), Nghiên cứu khả chịu hạn mối quan hệ

di truyền số giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại

11 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS

liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên

12 INGER, IRRI (1996), Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, Xuất lần thứ 4, Tài liệu dịch Viện Khoa học kỹ thuật Việt Nam, 59 trang

13 Nguyễn Thị Hồng Liên (2010), Đánh giá khả chịu mặn tạo vật liệu

khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn từ giống lúa OM4498, VND95 - 20, IR64, CR203 kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại

học Thái Nguyên

14 Lê Doãn Liên cs (2001), “ Nghiên cứu chất lượng lúa Việt Nam”, Hội

thảo quốc tế Sinh học Hà Nội, tr 61- 68

15 Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl chịu nước

thuốc (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó Tiến sĩ Sinh học, Viện Cơng

nghệ Sinh học Hà Nội

16 Tăng Thị Ngọc Mai (2011), Đánh giá khả chịu lạnh tạo nguồn vật

liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ số giống lúa kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại Học Sư Phạm, Đại học

Thái Nguyên

17 Chu Văn Mẫn (2001), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội

18 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại

chọn giống trồng, Nxb Đại học Sư phạm Thái Nguyên

19 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội, tr.34- 39

20 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu

hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện

Công nghệ Sinh học, Hà Nội

21 Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995), Sử dụng cơng nghệ tế bào thực vật để chọn dịng chịu nước lúa”, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh

22 Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn tú, Phạm Xuân Hội (2009), “Nghiên cứu phân lập và chuyển gene MtOsDREB2A điều khiển tính chịu hạn vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium”, Tạp chí Sinh học, Viện Khoa học Cơng

nghệ Việt Nam, 31(2),tr 79-88

23 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu

nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện

Công nghệ Sinh học, Hà Nội

24 Nguyễn Thị Tâm, Tăng Thị Ngọc Mai, Chu Hoàng Mậu(2011), ‘‘Đánh giá khả chịu lạnh giống lúa Xuân Châu Hương, Q5, C27, Khang Dân, U17 Nhị Ưu 63 kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Ngun, số 6, tập 82, tr 103 - 108

25 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thu Giang (2008), ‘‘Đánh giá đa hình ADN của số dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo nước’’, Tạp chí Khoa học

Công nghệ Thái Nguyên, số 4, tập 1, tr 58 - 64

26 Nguyễn Thị Tâm, Phạm Thị Thu Thuỳ, Nguyễn Thị Thu Hoài, Chu Hồng Mậu (2005), “Ứng dụng kỹ thuật ni cấy in vitro vào việc đánh giá khả chịu hạn số giống lúa cạn địa phương” Báo cáo khoa học Hội nghị toàn

quốc - Nghiên cứu khoa học sống Nxb Khoa học Kỹ

thuật, Hà Nội, 1370-1372

27 Nguyễn Đức Thành (2000), “Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu

ứng dụng”, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội

28 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), “ Xử lý kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính”, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 29 Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994), Chọn dịng chịu

muối lúa công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật, Kỉ yếu Viện Công nghệ

Sinh học, Hà Nội, tr 19 - 27

31 Viện Nơng hóa thổ nhưỡng (1998), Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón,

trồng, Nxb Nông nghiệp

32 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1999), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội

Tài liệu tiếng Anh

33 Adkins S W., Shiraishi T., Kunanuvatchaidach R., Godwin I D (1995), Somaclonal variation in rice drought - tolerance and other agrnomic characters, Aust J Bot 4, pp 201 - 209

34 Alia, Hayashi H., Sakamoto A., Murata N (1998), “Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine”, Plant J 16 (2), pp 155 - 161

35 Agarwal P, Agarwal PK, Nair S, Sopory SK, Reddy MK (2007), “Stress-inducible DREB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is a phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA-binding activity”, Mol Genet Genomics, 277(2), pp 189-98

36 Benze Xiao (2007), “Over - expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field condition”, Theor Appl Genet, 115, pp 35 - 46

37 Bouharmont J, Dekeyser A (1989), “In vitro selection for cold and salt tolerance in rice”, Review of Advance in Plant Biotechnology, 1985 - 88 IMWIC & IRRI, pp 308 - 313

38 Bertin P., Kinet J M., Bouharmont J (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”,

Aust J Bot, 44, pp 91-105

39 Dang Minh Tam, Nguyen Thi Lang (2003), In vitro selecsion for salt tolerance in rice, Omonrice, pp 68-73

41 Foolad M.R., Siva A., and Rodriguez L R (1995), Application of

polymerase chain reaction (PCR) to plant genome analysis, In: Tissue and

organ culture, Fundamental method, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, pp 281- 298

42 Honghong Hu., Xiong Lizhong (2004), “Transcription factor gene OsNACx from rice and use thereof for improving plant tolerance to drought and salt”,

Patent Application Publication

43 Liu, Nanming Zhao, K Yamaguch-Shinozaki and K Shinozaki (2000), “Regulatory role of DREB transcription factors in plant drought, salt and cold tolerance”, Chinese Science Bulletin, 45, pp 970-975

44 Lifeng Zhao,Yibing Hu, Kang Chong, and Tai Wang (2010), “ ARAG1, an ABA-responsive DREB gene, plays a role in seed germination and drought tolerance of rice”, Journal List, v.105(3), pp 401- 409

45 Mundy J., Chua H N (1998), “Abcisis acid and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp 2279 - 2286

46 Nakamura T., Yokota S., Muramoto Y., (1997), “Expression of a betaine aldehyde dehydrogenase gene in rice, a glycine betaine nonaccumulator and possible localization of its protein in peroxisomes”, Plant J 11, pp 1115 - 1120

47 Pradeep K Agarwal, Parinita Agarwal, M K Reddy and Sudhir K Sopory (2006), ”Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants”, Plant Cell Reports, 25, pp 1263-1274

48 Qiuyun Wang, Yucheng Guan, Yaorong Wu, Honglin Chen, Fan Chen, Chengcai Chu (2008), “Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought, and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice”,

Plant Mol Biol, 67, pp 589 - 602

50 Shinozaki et al,(2003) “OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in Drought-, high-salt-and cold-responsive gene expressio”, The Plant Journal, v.33, Issue 4, pp 751-763 51 S Mizuno, Y Hirasawa, M Sonoda, H Nakagawa (2006),” Isolation and

characterization of three DREB/ERF-type transcription factors from melon”,

Plant Science, 170, pp 1156–1163

52 Yang SM, Zeng YW, Du J, Pu XY, Yang T, Tai LM, Cui H, Zhu GB, Yi JH (2007) “Analysis of cold tolerance at the seedling stage of backcross hybrids of Indica with core revenue for rice in Yunnan Landrace”, Ecology and

Environment Bot 16, pp.1754-1758

53 Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2002), “DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression”, Biochem Biophys Res Commun, 290(3), pp 998-1009 Trang web

54 http://www.baomoi.com/San-xuat-lua-gao-nam-nay-ra-sao/45/5703715.epi 55 http://fao.org.vn

56 http://nongnghiep1.com/cay-lua/

57 http://www.agro.gov.vn/news/newsdetail.aspx?targetid=18467

58.https://petrotimes.vn/xuat-khau-gao-viet-nam-dung-thu-3-the-gioi-517376.html

59 http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=430&idmid=3