Nghiên cứu định tính, định lượng cao đặc phương thuốc tiêu dao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DIỆU LINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TIÊU DAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DIỆU LINH Mã sinh viên : 1501277 NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TIÊU DAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Bùi Hồng Cường DS Lưu Cơng Bình Nơi thực hiện: Bộ mơn Dược học cổ truyền HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khố luận, em nhận giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu bạn bè gia đình Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phịng Đào tạo Đại học tồn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ bảo cho em suốt năm học qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường – người thầy tận tình hướng dẫn, quan tâm bảo sát tạo điều kiện thuận lợi cho em trình nghiên cứu thực khố luận Em xin chân thành cảm ơn DS Lưu Cơng Bình – học viên cao học khoá 23, Trường Đại học Dược Hà Nội chia sẻ, giúp đỡ hướng dẫn em tận tình thời gian em thực khố luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Trường Đại học Dược Hà Nội, Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế WINSACOM cung cấp dược liệu, chất chuẩn hỗ trợ kinh phí nghiên cứu Em xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em trình làm thực nghiệm Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới Ba Mẹ, gia đình, người thân bạn bè bên cạnh, quan tâm ủng hộ em suốt trình học tập mái trường Đại học Dược Hà Nội Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân cịn hạn chế, nên khố luận cịn có thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khố luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Diệu Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh trầm cảm 1.1.1 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học đại 1.1.2 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học cổ truyền 1.2 Phương thuốc “Tiêu dao” 1.2.1 Công thức 1.2.2 Công năng, chủ trị phương thuốc 1.2.3 Định tính, định lượng phương thuốc Tiêu dao 1.3 Thông tin vị thuốc 1.3.1 Bạch thược 1.3.2 Sài hồ 1.3.3 Đương quy 1.3.4 Bạch truật 10 1.3.5 Bạch linh 12 1.3.6 Cam thảo 13 1.3.7 Bạc hà 15 1.3.8 Sinh khương 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Thiết bị, máy móc 19 2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Định tính vị dược liệu cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lớp mỏng 20 2.2.2 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Định tính vị dược liệu cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lớp mỏng 25 3.1.1 Định tính dược liệu Bạch thược cao đặc Tiêu dao SKLM 25 3.1.2 Định tính dược liệu Sài hồ cao đặc Tiêu dao SKLM 27 3.1.3 Định tính dược liệu Đương quy cao đặc Tiêu dao SKLM 29 3.1.4 Định tính dược liệu Bạch truật cao đặc Tiêu dao SKLM 30 3.1.5 Định tính dược liệu Bạch linh cao đặc Tiêu dao SKLM 32 3.1.6 Định tính dược liệu Cam thảo cao đặc Tiêu dao SKLM 34 3.2 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao 37 3.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 37 3.2.2 Thẩm định quy trình định lượng 37 3.2.3 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao 42 CHƯƠNG BÀN LUẬN 43 4.1 Định tính vị dược liệu cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lớp mỏng 43 4.2 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.1.1 Định tính vị dược liệu cao đặc phương thuốc Tiêu dao 46 5.1.2 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao 47 5.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AST Aspartat Transaminase ALT Alanin Amino Transferase BL Bạch linh BT Bạch thược BTr Bạch truật CT Cam thảo DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam ĐQ Đương quy HPLC P-BL Cao đặc placebo Bạch linh PAE High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) Paeoniflorin P-BTr Cao đặc placebo Bạch truật P-BT Cao đặc placebo Bạch thược P-SH Cao đặc placebo Sài hồ P-CT Cao đặc placebo Cam thảo SKĐ Sắc kí đồ P-ĐQ Cao đặc placebo Đương quy SKLM Sắc kí lớp mỏng PL Phụ lục TD Tiêu dao SH Sài hồ YHHĐ Y học đại YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Công thức bào chế mẫu cao đặc placebo 19 Bảng 3.1 Kết SKLM định tính Bạch thược cao đặc Tiêu dao 26 Bảng 3.2 Kết SKLM định tính Sài hồ cao đặc Tiêu dao 28 Bảng 3.3 Kết SKLM định tính Đương quy cao đặc Tiêu dao 30 Bảng 3.4 Kết SKLM định tính Bạch truật cao đặc Tiêu dao 32 Bảng 3.5 Kết SKLM định tính Bạch linh cao đặc Tiêu dao 34 Bảng 3.6 Kết SKLM định tính Cam thảo cao đặc Tiêu dao 36 Bảng 3.7 Kết độ thích hợp hệ thống 39 Bảng 3.8 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng paeoniflorin 39 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ lặp lại độ xác trung gian 40 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ phương pháp 41 Bảng 3.11 Hàm lượng paeoniflorin cao đặc Tiêu dao 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Các vị dược liệu phương thuốc Tiêu dao 18 Hình 3.1 SKĐ định tính Bạch thược sau phun thuốc thử vanilin 2,5% ethanol acid sulfuric 26 Hình 3.2 SKĐ định tính Sài hồ sau phun thuốc thử vanilin 2,5% ethanol acid sulfuric 28 Hình 3.3 SKĐ định tính Đương quy soi bước sóng 366 nm 30 Hình 3.4 SKĐ định tính Bạch truật soi bước sóng 254 nm 32 Hình 3.5 SKĐ định tính Bạch linh soi bước sóng 254nm 34 Hình 3.6 SKĐ định tính Cam thảo soi bước sóng 366 nm 36 Hình 3.7 Sắc kí đồ mẫu nghiên cứu 37 Hình 3.8 Phổ mẫu thử mẫu chuẩn paeoniflorin 38 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ PAE 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Trầm cảm thể bệnh tâm thần, thuộc phạm vi chứng điên cuồng YHCT [9], bệnh xuất từ lâu Trong xã hội đại với nhiều áp lực bệnh trầm cảm trở nên phổ biến có xu hướng ngày gia tăng Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến tháng 01/2020, có khoảng 264 triệu người bị ảnh hưởng bệnh trầm cảm tồn cầu, tỉ lệ phụ nữ mắc phải nhiều so với nam giới, xảy lứa tuổi, đa số độ tuổi trưởng thành [52] Ở Việt Nam, theo Bệnh viện Tâm thần Trung ương 1, tỷ lệ mắc 10 chứng rối loạn tâm thần phổ biến năm 2014 14,2%, rối loạn trầm cảm chiếm 2,45% [53] Trầm cảm nguyên nhân hàng đầu gây tình trạng khuyết tật toàn giới tác nhân gây gánh nặng bệnh tật tồn cầu Hậu nghiêm trọng trầm cảm hành vi tự sát [38] Phương thuốc Tiêu dao có xuất xứ từ sách “Thái Bình huệ dân hồ tễ cục phương” với công sơ can giải uất, kiện tì hồ dinh [12], chủ trị can uất huyết hư làm cho hai bên sườn đau đớn, lúc rét lúc sốt, đau đầu mờ mắt, miệng táo họng khô, tinh thần mệt mỏi, ăn ít, kinh nguyệt khơng đều, bầu vú căng chướng, mạch huyền hư [12] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu dược lí đại cho biết thuốc có nhiều tác dụng bảo vệ gan [20], hạ huyết áp [46], tăng cường tiêu hoá [37] Phương thuốc Tiêu dao sử dụng rộng rãi, phổ biến điều trị bệnh trầm cảm Trung Quốc, sử dụng kết hợp với thuốc chống trầm cảm khác để điều trị cho hiệu tốt tác dụng phụ [25], [37] Ngày nay, với nhịp sống đại, việc sử dụng thuốc đông dược theo cách sắc truyền thống bất tiện Cao đặc Tiêu dao bán thành phẩm trung gian để sản xuất dạng bào chế đại tiện dụng thuốc cốm, viên nén, viên nang Tuy nhiên, cao đặc Tiêu dao chưa có tiêu chuẩn chất lượng Chính vậy, việc khảo sát số tiêu chất lượng cao đặc nhằm tiêu chuẩn hoá dạng bào chế cần thiết Từ lí trên, đề tài “Nghiên cứu định tính, định lượng cao đặc phương thuốc Tiêu dao” nghiên cứu với mục tiêu: - Khảo sát định tính vị thuốc cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lớp mỏng - Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh trầm cảm 1.1.1 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học đại 1.1.1.1 Định nghĩa Trầm cảm trạng thái bệnh lý cảm xúc, biểu q trình ức chế tồn hoạt động tâm thần: chủ yếu ức chế cảm xúc, ức chế tư duy, ức chế vận động [2] 1.1.1.2 Nguyên nhân Trầm cảm nhiều nguyên nhân gây ra, chia thành nguyên nhân chính: - Trầm cảm nội sinh (hay gọi trầm cảm chưa rõ nguyên nhân): trầm cảm phân liệt cảm xúc, trầm cảm rối loạn cảm xúc lưỡng cực, - Trầm cảm tân sinh: trầm cảm xuất sau sang chấn tâm thần hay hoàn cảnh xung đột, trầm cảm phản ứng, - Trầm cảm thực tổn: trầm cảm bệnh thực tổn não bệnh toàn thân khác, trầm cảm nhiễm độc ma tuý, rượu, [2] 1.1.2 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học cổ truyền - Các bệnh tâm thần YHCT mô tả phạm vi chứng điên cuồng Điên trạng thái trầm tĩnh, đần độn tương ứng với thể trầm cảm; hoang tưởng ảo giác thể trầm cảm; thể kéo dài [9] - Nguyên nhân gây bệnh: Do tinh thần bị kích động lo nghĩ, giận độ gây rối loạn hoạt động tạng tâm, can, tỳ phát sinh đàm, đàm khí uất kết sinh chứng trầm cảm (điên) Bệnh phân loại thể chu kì thể kéo dài, có biểu trầm cảm kèm hoang tưởng, ảo giác [9] 1.2 Phương thuốc “Tiêu dao” 1.2.1 Công thức [3], [12], [17] Sài hồ 100 g Bạch linh 100 g Đương quy 100 g Cam thảo 80 g Bạch thược 100 g Bạc hà 20 g Bạch truật 100 g Sinh khương 100 g Phương thuốc có xuất xứ từ sách “Thái Bình huệ dân hoà tễ cục phương” Trần Sư Văn – danh y Trung Quốc thời nhà Tống [12] 25 Jing L L., Zhu X X., et al (2015), "Effect of Xiaoyaosan on major depressive disorder", Chin Med, 10, tr 18 26 Lee S R., Lee S., et al (2017), "Bioactivity-guided isolation of antiinflammatory triterpenoids from the sclerotia of Poria cocos using LPSstimulated Raw264.7 cells", Bioorg Chem, 70, tr 94-99 27 Li D Q., Zhou L., et al (2016), "Neuroprotective oleanane triterpenes from the roots of Bupleurum chinense", Bioorg Med Chem Lett, 26(6), tr 1594-1598 28 Li D.Q., Yue D.D., et al (2019), "Chemical constituents from Bupleurum chinese and their chemotaxonomic significance", Biochemical Systematics and Ecology, 86, tr 103929 29 Li J., Mu Z., et al (2019), "Effectiveness and safety of Chinese herbal medicine Xiaoyao san for the treatment of insomnia: Protocol for a systematic review and meta-analysis", Medicine (Baltimore), 98(29), tr e16481 30 Li X., Ma L., et al (2019), "Molecular basis for Poria cocos mushroom polysaccharide used as an antitumor drug in China", Prog Mol Biol Transl Sci, 163, tr 263-296 31 Liao C C., Li J M., et al (2019), "Effect of Paeonia lactiflora, a traditional Chinese herb, on migraines based on clinical application and animal behavior analyses", Biomed Pharmacother, 118, tr 109276 32 Liu E H., Qi L W., et al (2009), "High-speed separation and characterization of major constituents in Radix Paeoniae Rubra by fast high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detection and time-of-flight mass spectrometry", Rapid Commun Mass Spectrom, 23(1), tr 119-30 33 Liu Y., Hu M., et al (2019), "The anti-inflammatory and anti-oxidant properties of the aerial part of Atractylodes macrocephala and the active constituents' analysis by HPLC-ESI-MS/MS", South African Journal of Botany, 125, tr 8691 34 Makkar M K., Sharma S., et al (2018), "Evaluation of Mentha arvensis essential oil and its major constituents for fungitoxicity", J Food Sci Technol, 55(9), tr 3840-3844 35 Nam K N., Yae C G., et al (2013), "Paeoniflorin, a monoterpene glycoside, attenuates lipopolysaccharide-induced neuronal injury and brain microglial inflammatory response", Biotechnol Lett, 35(8), tr 1183-9 36 Nath B N., Subarna S., et al (2014), "Antioxidant, antimicrobial, cytotoxic and analgesic activities of ethanolic extract of Mentha arvensis L", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 4(10), tr 792-797 37 Qin F., Huang X., et al (2009), "Chinese herbal medicine modified xiaoyao san for functional dyspepsia: meta-analysis of randomized controlled trials", J Gastroenterol Hepatol, 24(8), tr 1320-5 38 Reddy M S (2010), "Depression: the disorder and the burden", Indian J Psychol Med, 32(1), tr 1-2 39 Song D., Cao Z., et al (2018), "Poria cocos polysaccharide attenuates RANKLinduced osteoclastogenesis by suppressing NFATc1 activity and phosphorylation of ERK and STAT3", Arch Biochem Biophys, 647, tr 76-83 40 Tian J S., Peng G J., et al (2016), "A GC-MS urinary quantitative metabolomics analysis in depressed patients treated with TCM formula of Xiaoyaosan", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1026, tr 227235 41 Tian R T., Xie P S., et al (2009), "Evaluation of traditional Chinese herbal medicine: Chaihu (Bupleuri Radix) by both high-performance liquid chromatographic and high-performance thin-layer chromatographic fingerprint and chemometric analysis", J Chromatogr A, 1216(11), tr 2150-5 42 Tong H., Tian D., et al (2013), "Polysaccharides from Bupleurum chinense impact the recruitment and migration of neutrophils by blocking fMLP chemoattractant receptor-mediated functions", Carbohydr Polym, 92(2), tr 1071-7 43 Wang N., Zhang Y., et al (2016), "Antioxidant property of water-soluble polysaccharides from Poria cocos Wolf using different extraction methods", Int J Biol Macromol, 83, tr 103-110 44 Wei W L., Zeng R., et al (2016), "Angelica sinensis in China-A review of botanical profile, ethnopharmacology, phytochemistry and chemical analysis", J Ethnopharmacol, 190, tr 116-41 45 Wu K., Fan J., et al (2018), "Hepatoprotective effects exerted by Poria Cocos polysaccharides against acetaminophen-induced liver injury in mice", Int J Biol Macromol, 114, tr 137-142 46 Xiong X., Wang P., et al (2019), "Efficacy and safety of Chinese herbal medicine Xiao Yao San in hypertension: A systematic review and metaanalysis", Phytomedicine, 61, tr 152849 47 Yu X Q., Xue C C., et al (2008), "In vitro and in vivo neuroprotective effect and mechanisms of glabridin, a major active isoflavan from Glycyrrhiza glabra (licorice)", Life Sci, 82(1-2), tr 68-78 48 Yu X Y., Lin S G., et al (2007), "Role of P-glycoprotein in limiting the brain penetration of glabridin, an active isoflavan from the root of Glycyrrhiza glabra", Pharm Res, 24(9), tr 1668-90 49 Zhang W., Chen L., et al (2018), "Antidepressant and immunosuppressive activities of two polysaccharides from Poria cocos (Schw.) Wolf", Int J Biol Macromol, 120(Pt B), tr 1696-1704 50 Zhao D D., Jiang L L., et al (2016), "Chemical Components and Pharmacological Activities of Terpene Natural Products from the Genus Paeonia", Molecules, 21(10), tr 1362 51 Zhao W., Li J J., et al (2012), "Antioxidant activity and hepatoprotective effect of a polysaccharide from Bei Chaihu (Bupleurum chinense DC)", Carbohydr Polym, 89(2), tr 448-52 Trang web 52 https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/depression Time: 15h - D - 11/04/2020 53 https://www.who.int/vietnam/vi/health-topics/mental-health Time: 20h - D - 11/04/2020 PHỤ LỤC Phụ lục Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng Phụ lục Phiếu kiểm nghiệm dược liệu cao đặc Tiêu dao Phụ lục Hình ảnh vị dược liệu chuẩn trong cao đặc Tiêu dao PHỤ LỤC SẮC KÍ ĐỒ SẮC KÍ LỚP MỎNG Phụ lục 1.1 Sắc kí đồ định tính Bạch thược bước sóng 254 nm 366 nm Hệ dung môi khai triển: Cloroform – ethyl acetat – methanol – amoniac (8:1:4:1) SKĐ soi bước sóng 254 nm SKĐ soi bước sóng 366 nm Phụ lục 1.2 Sắc kí đồ định tính Sài hồ bước sóng 254 nm 366 nm Hệ dung môi khai triển: Ethyl acetat - ethanol – nước (8:2:1) SKĐ soi bước sóng 254 nm SKĐ soi bước sóng 366 nm Phụ lục 1.3 Sắc kí đồ định tính Đương quy bước sóng 254 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu Hệ dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) Phụ lục 1.4 Sắc kí đồ định tính Bạch truật bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu Hệ dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (8:4:1) Phụ lục 1.5 Sắc kí đồ định tính Bạch linh bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu Hệ dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:5:1) Phụ lục 1.6 Sắc kí đồ định tính Cam thảo bước sóng 254 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu Hệ dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (6:4:1) PHỤ LỤC PHIẾU KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CAO ĐẶC TIÊU DAO Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Sài hồ Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Bạch thược Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Bạch linh Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Bạch truật Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Cam thảo Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đương quy PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CÁC VỊ DƯỢC LIỆU CHUẨN TRONG CAO ĐẶC TIÊU DAO Bạch thược Bạch truật Bạch linh Cam thảo Đương quy Sài hồ ... tài ? ?Nghiên cứu định tính, định lượng cao đặc phương thuốc Tiêu dao? ?? nghiên cứu với mục tiêu: - Khảo sát định tính vị thuốc cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lớp mỏng - Định lượng. .. truật cao đặc Tiêu dao SKLM 30 3.1.5 Định tính dược liệu Bạch linh cao đặc Tiêu dao SKLM 32 3.1.6 Định tính dược liệu Cam thảo cao đặc Tiêu dao SKLM 34 3.2 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương. .. 43 4.1 Định tính vị dược liệu cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lớp mỏng 43 4.2 Định lượng paeoniflorin cao đặc phương thuốc Tiêu dao phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao