Khảo sát điều kiện nhân giống tối ưu và thành phần hóa học của cây khôi tía nuôi trồng in vitro ( ardisia kteniophylla)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG LƯƠNG PHƯƠNG DUNG KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG TỐI ƯU VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÂY KHƠI TÍA NI TRỒNG IN-VITRO (ARDISIA KTENIOPHYLLA) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG LƯƠNG PHƯƠNG DUNG Mã sinh viên: 1501104 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG TỐI ƯU VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÂY KHƠI TÍA NI TRỒNG IN-VITRO (ARDISIA KTENIOPHYLLA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngồi cố gắng thân, nhận nhiều quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ thầy cô, gia đình bạn bè suốt trình nghiên cứu Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Hồng Quỳnh Hoa (Bộ mơn Thực vật Đại học Dược Hà Nội) tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn động viên suốt thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp, đồng thời bồi dưỡng cho kiến thức chuyên môn kinh nghiệm quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt chị Chu Thị Thoa giúp đỡ, bảo tận tình ln đồng hành tơi để hồn thành khóa luận tốt nghiệp môn Đồng thời, muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu, tồn thể thầy, trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt cho để hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Và cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên động viên, ủng hộ, giúp đỡ suốt trình học tập trường, đặc biệt thời gian làm Khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2020 Sinh viên Đặng Lương Phương Dung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Trọng Đũa (Ardisia Sw.) Khơi tía 1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm, phân bố chi Trọng đũa (Ardisia Sw.) 1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Trọng đũa (Ardisia Sw.) 1.1.1.2 Các đặc điểm chi Trọng đũa (Ardisia Sw.) 1.1.1.3 Phân bố đa dạng chi Trọng đũa (Ardisia Sw.) giới Việt Nam…… ………………… ………………………………3 1.1.2 Các lồi mang tên Khơi Việt Nam q trình định danh lồi 1.1.3 Về hóa học 1.1.4 Tác dụng sinh học 11 1.1.5 Công dụng 11 1.2 Tổng quan phương pháp nhân giống vơ tính kĩ thuật nuôi cấy mô 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.2.2 Nguyên tắc chung phương pháp 12 1.2.3 Ưu điểm vi nhân giống 12 1.2.4 Hạn chế vi nhân giống 13 1.2.5 Các nghiên cứu khả nhân giống vơ tính in-vitro Khơi tía (Ardisia gigantifolia Stapf.) 14 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Điều kiện nuôi cấy 17 2.1.3 Địa điểm tiến hành 17 2.1.4 Thời gian tiến hành 17 2.1.5 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 2.1.6 Thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp làm môi trường .18 2.2.1.1 Công thức môi trường 19 2.2.1.2 Các công thức mơi trường theo mục đích thí nghiệm 19 2.2.1.3 Cách pha môi trường 19 2.2.2 Thao tác buồng cấy………………………………….…… 24 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết thực nghiệm 3.1.1 Ảnh hưởng BAP kinetin đến tạo chồi mẫu nghiên cứu… …………………………………………………………………… 25 3.1.2 Khảo sát điều kiện rễ Khơi tía 3.1.2.1 Ảnh hưởng NAA đến hình thành phát triển rễ Khôi… ……………………………………………………………… 27 3.1.2.2 Ảnh hưởng than hoạt tính (AC) đến hình thành phát triển rễ Khơi tía……………………………………………… 27 3.1.3 Chuyển vườn ươm 30 3.1.4 Khảo sát sơ thành phần hóa học Khơi tía F0 F1 sau tháng tách khỏi môi trường nuôi cấy in–vitro 33 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về giai đoạn nhân nhanh 36 3.2.2 Về giai đoạn rễ 38 3.2.3 Về giai đoạn chuyển vườn ươm 41 3.2.4 Về khảo sát sơ thành phần hóa học F0 F1 sau tháng tách bình… 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích AC Than hoạt AST Ánh sáng thường 6-BA - benzyladenine BAP - benzylaminopurine IAA β-indol-acetic acid IBA β-indol-bytyric acid Kinetin N6-furfuryladenine KTST Kích thích sinh trưởng MS Môi trường nuôi cấy MURASHIGE SKOOG MT Môi trường NAA Acid alpha naphthylacetic SKĐ Sắc kí đồ SKLM Sắc kí lớp mỏng ZT Zeatin tb Trung bình DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1 Dẫn chất bergenin phân lập từ loài Ardisia Trang gigantifolia Stapf Bảng 1.2 Một số triterpenoid saponin phân lập từ rễ 10 Khơi tía Bảng 2.1 Công thức pha môi trường MS 18 Bảng 2.2 Tỷ lệ KTST bổ sung vào môi trường MS 19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin đến khả 25 nhân nhanh chồi in-vitro Bảng 3.2 Ảnh hưởng NAA đến hình thành phát 27 triển rễ Khơi tía Bảng 3.3 Ảnh hưởng AC đến hình thành phát 28 triển rễ Khơi tía Bảng 3.4 Quan sát phát triển mẫu rễ sau 60 ngày 28 Bảng 3.5 Bảng số liệu Khơi tía sau chuyển 31 đất trồng 10 Bảng 3.6 So sánh Rf vết lên sau chạy sắc kí quan sát bước sóng 254nm AST sau phun thuốc thử 33 DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên ảnh Trang Hình 1.1 A.gigantifolia Stapf mọc ngồi tự nhiên Hình 1.2 A.kteniophylla A.DC.mọc ngồi tự nhiên Hình 1.3 Mẫu Khơi tía lấy Ba Vì Hình 1.4 Cụm hoa Khơi tía mẫu Ba Vì Hình 2.1 Cơng thức hóa học Bergenin Hình 2.2 Cấu trúc hóa học Triterpenoid saponin từ rễ lồi Ardisia gigantifolia Stapf Hình 2.3 Mẫu Khơi tía nuôi cấy PTN Đại học 20 Dược Hà Nội Hình 3.1 Mẫu ni cấy mơi trường khác sau 26 30 ngày Hình 3.2 Mẫu rễ môi trường khác sau 30 29 ngày 10 Hình 3.3 Ảnh Khơi tía chuyển vườn ươm 30 11 Hình 3.4 Cây Khơi tía ngồi tự nhiên sau 30 ngày 32 12 Hình 3.5 SKĐ dịch chiết F0 F1 34 13 Hình 3.6 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM 35 dịch chiết F0 F1 (254 nm) 14 Hình 3.7 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM dịch chiết F0 F1 AST sau phun thuốc thử 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Khôi tía lồi thuộc chi Ardisia Sw., thuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae), đưa vào sách đỏ Việt Nam [21] Theo y học cổ truyền, Khơi tía vị thuốc có tác dụng chống viêm, làm liền sẹo, giảm gia tăng acid dày sử dụng điều trị bệnh dày, tá tràng Những năm gần đây, bệnh lý liên quan đến dày nhiều nghiên cứu phát hoạt chất có Khơi tía có tác dụng lên tế bào ung thư [25],[32],[39] Chính vậy, Khơi tía dần trở nên phổ biến nhà khoa học nước quan tâm Cũng lồi dược liệu nói chung, Khơi tía tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức, cộng với điều kiện ngày bất lợi môi trường tự nhiên Mặc dù phân bố rộng số lượng cá thể lồi tái sinh hạt Ngồi ra, Khơi tía lồi có khả sinh trưởng, phát triển chậm nên việc phát triển thành nguyên liệu làm thuốc hạn chế, phụ thuộc vào nguồn ngun liệu tự nhiên khơng đảm bảo Do đó, cần phương pháp nhân giống nhanh hiệu thuốc quý Vì vậy, để bảo tồn phát triển loài thực vật quý hiếm, cần ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in-vitro để lưu giữ nguồn gen sản xuất hàng loại giống chất lượng cao Trên sở tiếp nối nghiên cứu ban đầu mô hình nhân giống vơ tính in-vitro Khơi tía, đề tài thực với mục tiêu sau: - Khảo sát môi trường nhân nhanh môi trường sinh rễ Khơi tía in-vitro - So sánh sơ thành phần hóa học Khơi tía sau nhân giống in- vitro (F1) làm nguyên liệu khởi tạo ban đầu (F0) phương pháp sắc kí lớp mỏng + 10 + ++ 11 Tím Xanh 0.70 10’ 0.72 11’ ++ 0.69 Tím Xanh +++ +++ Xanh đen 12 0.72 0.76 12’ ++ 0.75 13’ +++ Xanh đen 0.76 +++ Kí hiệu ++: trung bình +: nhạt +++: đậm ❖ Quan sát hình ảnh sắc kí đồ hình ảnh chồng phổ sắc kí mẫu dịch chiết nước sóng 254 nm AST sau phun dung dịch thuốc thử: F0 F1 A F0 F1 B Hình 3.5 SKĐ dịch chiết F0 F1 quan sát 254 nm AST sau phun dung dịch vanilin - acid sulfuric 34 (Chiều cao peak) 7000 (Rf) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Hình 3.6 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM dịch chiết F0 F1 (254 nm) Chú thích —— Dịch chiết F0 —— Dịch chiết F1 (Chiều cao peak) 8000 6000 4000 2000 (Rf) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Hình 3.7 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM dịch chiết F0 F1 (AST sau phun TT) Chú thích Dịch chiết F0 Dịch chiết F1 35 Qua lần phân tích cặp dịch chiết từ F0 F1, dựa kết sắc kí đồ loại, giá trị Rf vết, màu sắc vết phổ dạng chồng lên diều kiện SKLM, nhận thấy: Trên sắc kí đồ dịch chiết F0, quan sát bước sóng 254nm thấy có vết, quan sát AST sau phun dung dịch vanilin - acid sulfuric thấy sắc kí đồ có 10 vết Trong thấy vết số 7, xuất rõ nét bước sóng 254nm AST sau phun thuốc thử có màu xanh đậm đỏ đậm Trên sắc kí đồ dịch chiết F1, quan sát bước sóng 254nm thấy có vết, sau phun dung dịch vanilin - acid sulfuric thấy sắc kí đồ có 10 vết, có vết số 7’, 11’,13’ xuất rõ nét bước sóng 254nm AST sau phun thuốc thử có màu xanh đậm tím xanh Quan sát sắc kí đồ mẫu sau phun dung dịch vanilin - acid sulfuric thấy có số vết là: – 1’ (tím), – 3’ (tím), - 6’ (vàng-tím), – 7’ (xanh đậm), 11 – 11’ (tím), 12 - 13’ (tím đen) Trong điều kiện ánh sáng trắng, sau phun dung dịch vanilin - acid sulfuric, số vết tách hai lớn (10 vết) số vết trùng lớn (6 vết) Như so với khởi tạo ban đầu (F0), nhân giống in–vitro (F1) có thành phần hố học khơng khác biệt nhiều Sự khác biệt thành phần khác thời gian sinh trưởng tích luỹ chất 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về giai đoạn nhân nhanh Khi xác đinh nồng độ Kinetin (0,5mg/L) thích hợp tiếp tục nghiên cứu xác định nồng độ BAP để tối ưu hóa q trình nhân nhanh mẫu Khơi tía BAP Kinetin chất KTST thuộc nhóm cytokinin Trong ni cấy mơ tế bào thực vật, Cytokinin đóng vai trị quan trọng, cần thiết cho phân chia tế bào phân hóa chồi từ mơ sẹo từ quan, gây tạo phơi vơ tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Chức chủ yếu cytokinin khái quát sau: 36 - Kích thích phân chia tế bào - Tạo nhân callus - Kích thích phát sinh chồi ni cấy mơ - Kích thích phát sinh chồi nách kìm hãm ưu chồi đỉnh - Làm tăng diện tích phiến kích thích lớn lên tế bào - Có thể làm tăng mở khí khổng số loài - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế hình thành rễ - Ức chế kéo dài chồi - Ức chế trình già (vàng rụng) lá, kích thích tạo diệp lục [7] Bởi vậy, nồng độ BAP tăng dần từ 0,25 mg/L đến 1mg/L số lượng chồi tạo thành tăng dần, chiều cao trung bình chồi tăng dần, hệ số nhân chồi tăng dần đạt giá trị cao 7,9 nồng độ BAP mg/L Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ BAP đến 1,5 mg/L số lượng chồi tạo thành giảm dần, hệ số nhân chồi, chiều cao trung bình chồi giảm theo Mặc dù theo lý thuyết việc bổ sung BAP vào mơi trường ni cấy giúp cải thiện hệ số nhân chồi [7] thí nghiệm này, tăng nồng độ BAP cao mg/L lại ức chế trình tạo chồi sinh trưởng chồi Điều giải thích việc bổ sung thêm BAP với nồng độ lớn mg/L vào mơi trường MS có sẵn 0,5 mg/L Kinetin làm kích khả tạo callus mẫu nuôi cấy (bảng 3.1), làm giảm khả tạo thành phát triển chồi nách Không vậy, qua lần chuyển giữ mẫu, làm cho số mẫu ni cấy bị biến dị soma, biến đổi kiểu hình gen…, mà chúng khơng cịn đáp ứng tốt với BAP, Kinetin ban đầu Qua khảo sát, thí nghiệm TNC.3, có nồng độ BAP 1mg/L, cho hệ số nhân chồi 7,9, chiều cao trung bình chồi 4,1cm, chất lượng chồi tốt, khỏe mạnh, đồng số lượng, mơi trường lý tưởng thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh khảo sát Cũng thời gian nghiên cứu tương đương, nhóm nghiên cứu Tang Fengluan tiến hành khảo sát điều kiện nhân giống tối ưu Khơi 37 tía (Ardisia gigantifolia Stapf.) thời gian 50 ngày giai đoạn nhân nhanh Qua khảo sát, nhóm nghiên cứu nhận thấy 6-BA tạo đáp ứng tốt chiều cao, số lượng chồi tìm môi trường tối ưu cho tăng sinh chồi MS + 0,5 mg/L 6-BA + 0,1 mg/L ZT + 0,1 mg/L NAA, với hệ số nhân 4,3 lần, chiều cao trung bình chồi 8,6 cm [40] Cũng sau khoảng thời gian tuần, nhóm nghiên cứu TS Hoàng Quỳnh Hoa đưa điều kiện nhân nhanh chồi tối ưu MS kết hợp với BAP 1,0 mg/L IBA 0,01mg/L cho hệ số nhân chồi 2,28, chiều cao trung bình chồi ghi nhận 4,67 [10] Qua đó, nhận thấy tương đồng nhóm nghiên cứu sử dụng môi trường MS để làm môi trường nuôi cấy Dù vậy, có khác biệt hệ số nhân chồi, chất lượng chồi nhóm nghiên cứu điều giải thích sau: • Mơi trường cấy chuyển có khác nhau: nhóm nghiên cứu Tang Fengluan sử dụng môi trường MS có bổ sung 6-BA, ZT, NAA; nhóm nghiên cứu TS Hồng Quỳnh Hoa sử dụng mơi trường MS có bố sung BAP, IBA • Mẫu nghiên cứu lấy từ địa điểm khác nhau, nơi có vùng khí hậu, điều kiện thổ nhưỡng chăm sóc khác chất mẫu nghiên cứu khác nhau: Mẫu nghiên cứu Tang Fengluan sử dụng mẫu trồng Khu tự trị dân tộc Choang Quảng Tây, Viện thực vật học Quảng Tây, Viện nghiên cứu khoa học Trung Quốc, mẫu nghiên cứu TS Hoàng Quỳnh Hoa thu hái Ba Vì • Điều kiện ni cấy khác nhiệt độ, độ ẩm, thời gian chiếu sáng • Số lần cấy chuyển giữ mẫu khác 3.2.2 Về giai đoạn rễ NAA chất KTST thuộc nhóm auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh Trong ni cấy mơ tế bào thực vật, vai trị NAA khẳng định: - Kích thích mọc rễ cành giâm kích thích phát sinh chồi phụ ni cấy mơ 38 - Kích thích phân chia kéo dài tế bào - Chồi đỉnh cung cấp NAA gây ức chế sinh trưởng chồi bên Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh dẫn đến phát chồi nách - Tạo nhân nhanh mô sẹo (callus) - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) [7] Bởi vậy, thí nghiệm 2, từ kết bảng 3.2, sau 30 ngày theo dõi, tăng dần nồng độ NAA từ đến 0,5 mg/L tỷ lệ rễ, số rễ trung bình cây, chiều dài trung bình rễ tăng dần Ba thông số đạt giá trị cao nồng độ NAA 0,5 mg/L với số rễ 14 tổng số 18 cây, số rễ trung bình 2,8 rễ/cây, chiều dài rễ trung bình 4,7 cm Sau 60 ngày theo dõi, từ kết bảng 3.4, thấy phát triển vượt trội mẫu thuộc mơi trường có bổ sung NAA, số lượng rễ tăng lên, chiều dài rễ tăng nhanh Qua khẳng định vai trị NAA q trình rễ mẫu Khơi tía invitro xác định nồng độ NAA phù hợp cho môi trường rễ 0,5 mg/L Vai trị than hoạt ni cấy mơ tế bào thực vật chủ yếu tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ chất độc chất ức chế sinh trưởng thực vật phenolic, dịch rỉ nâu sinh từ mẫu môi trường ni cấy[7] Theo kết thí nghiệm TNX.3, sử dụng môi trường không bổ sung NAA, rễ hình thành dù số lượng khơng nhiều, thời gian rễ hình thành nhanh (5 ngày) Qua thấy than hoạt tính có khả kích thích q trình mọc rễ Khơi tía in-vitro Tuy nhiên từ kết bảng 3.3., ta thấy chênh lệch tỷ lệ rễ, số rễ trung bình cây, chiều dài trung bình rễ mẫu mơi trường ni cấy có khơng có than hoạt tính Ở mơi trường có bổ sung than hoạt (TNX.2), rễ tạo thành sớm, sau ngày, mẫu có tỷ lệ rễ (78%>55,6%), số rễ trung bình (2,8>2,1), chiều dài trung bình rễ (4,7>2,1) cao so với mẫu môi trường không bổ sung than hoạt (TNX.0) tạo rễ sau 12 ngày Tuy nhiên, qua theo dõi, thấy rễ tạo thành mẫu thuộc thí nghiệm TN X.0 lại có chất lượng tốt hơn, 39 rễ khỏe, mập, cứng cáp, đường kính lớn gần 2,5 lần so với đường kính rễ thuộc thí nghiệm TNX.2 Điều giải thích sau: Bổ sung than hoạt tính (AC) vào mơi trường ni cấy có lợi ích có tác dụng khử độc Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng mặt: hút hợp chất cản, hút chất điều hịa sinh trưởng, làm đen mơi trường Khả kích thích tăng trưởng than hoạt tính kết hợp với hợp chất phenol độc tiết thời gian ni cấy Than hoạt tính (AC) thường bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% AC giúp làm giảm độc tố cách đào thải hợp chất độc (ví dụ: phenol) tạo q trình ni cấy cho phép tế bào sinh trưởng mà khơng bị trở ngại Do kích thích rễ tạo thành phát triển sớm [7] Đơn cử thấy phát triển rễ thí nghiệm TNX.3 Tuy nhiên, người ta cho tác dụng cản tăng trưởng mơ cấy có diện than hoạt tính mơi trường hút chất điều hịa sinh trưởng có mơi trường: NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP chúng có liên kết với than hoạt tính [7] Vì rễ dù có hình thành sớm phát triển nhanh yếu, gầy khơng cung cấp đủ chất dinh dưỡng Qua đó, xác định mơi trường tối ưu cho giai đoạn rễ mẫu Khơi tía in-vitro MS+0,5mg/L NAA Nhóm nghiên cứu Tang Fengluana tiến hành khảo sát tìm mơi trường tối ưu cho cảm ứng rễ mẫu Khơi tía ½ MS + 1,5 mg/L IAA + 1,0 mg/L NAA, tỷ lệ rễ đạt 92,3% hệ thống rễ phát triển, phát triển mạnh [40] Nhóm nghiên cứu TS Hồng Quỳnh Hoa tìm mơi trường rễ thích hợp cho Ardisia gigantifolia Stapf MS kết hợp với IAA 0,5mg/L tạo thành trung bình mẫu 6,38 rễ chiều dài rễ trung bình 11,63 mm sau tuần ni cấy [10] Có khác biệt kết tỷ lệ rễ, số rễ trung bình cây, chiều dài trung bình rễ nhóm nghiên cứu Nguyên nhân khác biệt 40 môi trường nuôi cấy, chất lượng môi trường, chất mẫu nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, tổ hợp nuôi cấy gồm chất thuộc nhóm auxin (NAA,IBA) nên kích thích tạo rễ mạnh so với riêng NAA 3.2.3 Về giai đoạn chuyển vườn ươm Khơi tía sau mơi trường có tỷ lệ sống sót cao (80%) Theo kết từ bảng 3.5, sau tháng chuyển ngồi mơi trường tự nhiên, mẫu Khơi tía phát triển tốt, số lượng nhiều (tb kính lớn (tb ≈ ≈ 9,7 lá/cây), chất lượng tốt, có đường 8,7cm x 4,2cm), thân cứng cáp, chiều dài trung bình xấp xỉ 7,9 (cm), rễ dài (tb ≈ 10,5 cm), khỏe mạnh, cứng cáp, phát triển tốt đáp ứng quy mơ cơng nghiệp Khơi tía thu phương pháp ni cấy mơ thích nghi tốt với mơi trường ngồi tự nhiên: nhiệt độ, thổ nhưỡng,…Mẫu sạch, nhiễm bệnh, nhiễm nấm Cây khỏe mạnh, cứng cáp, đặc biệt, có khả chịu hạn (sống tốt nhiệt độ 37°C), chịu lạnh tốt (sống sót nhiệt độ 15°C) 3.2.4 Về khảo sát sơ thành phần hóa học F0 F1 sau tháng tách bình Bằng phương pháp SKLM tiến hành điều kiện F0 F1 sau tách bình chuyển ngồi tự nhiên tháng, phát dịch chiết F1 có vết giống dịch chiết F0 Với điều kiện SKLM, tiến hành lặp lại lần, hình ảnh SKĐ vết tách từ F0 F1 cho thấy vết có Rf trùng chiếm 50% diện tích pic tổng số vết tách từ F1 chiếm 53% diện tích pic tổng số vết tách từ F0 Do đó, ta sơ kết luận thành phần hóa học Khơi tía thu ni cấy mơ sau tháng tách bình ngồi tự nhiên giống so với F0 Tuy nhiên xuất vết sắc ký khác biệt dịch chiết từ Điều giải thích sau: • Tuổi ảnh hưởng đến hình thành tổng hợp thành phần hóa học Nghiên cứu thực với khác biệt lớn tuổi 41 mẫu, mẫu Khôi in-vitro ngồi mơi trường khoảng tháng nên tích lũy thành phần hóa học chưa nhiều • Cây nuôi cấy môi trường đặc biệt với nhiều chất dinh dưỡng (đa lượng, vi lượng, VTM,… ), môi trường thay đổi tùy theo giai đoạn ni cấy, có đồng điều kiện ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ điều tạo nên khác biệt với mơi trường tự nhiên • Sự khác biệt điều kiện thổ nhưỡng, ánh sáng mặt trời, nhiệt độ, độ ẩm khơng khí so với mơi trường trồng F0 lí dẫn đến khác biệt thành phần hóa học mẫu • Q trình chuyển giữ mẫu gây tượng biến đổi kiểu hình gen, biến dị soma, dẫn đến sai lệch thành phần hóa học F1 F0 Mặc dù tồn nhiều khác biệt, qua kết SKLM, ta thấy thành phần hóa học F1 thu sau tháng tách bình tự nhiên giống so với F0., thời điểm tiến hành thí nghiệm, việc xuất vết trùng SKĐ hai dịch chiết tín hiệu tốt để chứng minh chất lượng mẫu Khơi tía in-vitro Tuy nhiên, kết khảo sát thành phần hóa học mẫu kết nghiên cứu sơ Do điều kiện thực nghiệm hạn chế nên phần khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính nồng độ diện tích pic cặp pic chưa thực hành, mà kết tỷ lệ hàm lượng chất F0 F1 chưa thể hoàn thành 42 KẾT LUẬN Đã khảo sát đưa điều kiện nhân giống in-vitro tối ưu cho Khơi tía sau: - Môi trường nhân nhanh: MS kết hợp với BAP 1,0 mg/L Kinetin 0,5 mg/L - Môi trường rễ: MS kết hợp với NAA 0,5 mg/L Bằng phương pháp SKLM, sơ so sánh thành phần hóa học Khơi tía sau nhân giống in-vitro (F1) khơng có khác biệt nhiều so với làm nguyên liệu khởi tạo ban đầu (F0) Dịch chiết hai mẫu có 6/10 vết tách trùng sắc ký đồ triển khai với hệ dung môi Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (6,5:4:0,25) ĐỀ XUẤT - Tiếp tục khảo sát điều kiện vô trùng, môi trường thích hợp cho giai đoạn tái sinh chồi để hồn thiện hóa quy trình nhân giống in-vitro Khơi tía dựa kết thu từ nghiên cứu nước - Khảo sát điều kiện mơi trường ngồi (đất trồng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng…) thích hợp để tăng khả sống sót Khơi tía mơi trường 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Tuấn Anh (2006), Khảo sát hai lồi Khơi tía Củ dịm có tác dụng chữa đau dày Khu vực Hà Tây Hịa Bình, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr.23 Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín Việt Nam, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr.5,28,29,185 Nguyễn Tiến Bân (2000), THỰC VẬT CHÍ VIỆT NAM, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nxb Y học, Hà Nội, tr.224, 226, 250, 251 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y Học, Hà Nội, tr.623,624 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập I, tr.137-141, 339, 343 ThS Vưu Ngọc Dung (2011), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, tr.65,70,143,144,145 Đại học quốc gia Hà Nội - Trung tâm tài nguyên môi trường (2005), Danh lục loài thực vật Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tập II, tr.489495 Nguyễn Thị Phương Dung (2002), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Khôi, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 10 Hoàng Quỳnh Hoa (2014), Xây dựng mơ hình ni Khơi (Ardisia gigantifolia Stapf.) để phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen in-vitro, Đề tài nghiên cứu cấp Trường, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 11 Nguyễn Thị Hải Hồng (2019), Nghiên cứu tác động dịch chiết Khơi tía (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên biểu gen kiểm soát chu kỳ 44 tế bào tế bào gốc ung thư dày, Luận văn thạc sĩ, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, Thái Nguyên 12 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, TP Hồ Chí Minh, Quyển I , tr.674,685,707-708 13 Trần Hùng (2006), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y dược TP.HCM, TP Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Quốc Huy (2015), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật giám định tên khoa học loài thuộc chi Ardisia Sw thu hái Ba Vì-Hà Nội”, Nghiên cứu dược thơng tin thuốc, Số 1, tr.26-32 15 Đồn Thị Thu Hương, Nguyễn Văn Việt, Nguyễn Thị Huyền, Trần Việt Hà (2019), “Hồn thiện quy trình nhân giống Khơi tía (Ardisia sylvestris Pitard.) kỹ thuật nuôi cấy in-vitro”, Tạp chí khoa học cơng nghệ lâm nghiệp, số 16 Trần Thị Kim Liên (2002), Thực vật chí Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tập IV, Hà Nội, tr.49,55,166-174 17 Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y Học, Hà Nội, tr 481 18 Ngô Ta Nhi (2012), Nghiên cứu thực vật thành phần hóa học Khơi (Ardisia sp.) thu hái huyện Ba Vì, Hà Nội, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 19 Trần Văn Ơn (2003), Góp phần nghiên cứu bảo tồn thuốc vườn quốc gia Ba Vì, Luận án Tiến sĩ, Trung tâm thơng tin – Thư viện, Đại học Dược Hà Nội 20 Nguyễn Viết Thân (2005), Thực tập Dược liệu nhận biết thuốc, vị thuốc, Trung tâm thông tin – Thư viện, Đại học Dược Hà Nội 21 Bộ Khoa học (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, phần II Thực vật, tr 20, 21, 290, 291 22 Lê Anh Sơn, Đỗ Thị Hà, Vũ Thị Diệp, Đậu Bá Thìn, Nguyễn Thị Thảo-(2017), “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa 45 gây độc tế bào ung thư dịch chiết khơi tía”, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 6/2017, tr.346 – 351 23 Văn phòng Quỹ Châu Á Việt Nam Trung tâm Môi Trường Phát triển cộng đồng (2012), Cây thuốc người Dao Ba Vì, The Asia Foundation, p.64 24 Viện Dược liệu (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kĩ thuật, II, Hà Nội, tr.94-95 25 Trịnh Anh Viên (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số lồi Ardisia thuộc họ Myrsinaceae Việt nam, Luận án Tiến sĩ hóa học, Học viện Khoa học Cơng nghệ, Trung tâm Nghiên cứu tài nguyên môi trường Tiếng anh 26 Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants, Second Edition, Springer Science+Business Media B.V 27 Feng J, Huang Z, Mu L, Zhao H, Liu P (2011), “Study on chemical constitients of zhizome of Ardisia gigantifolia”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 36(24), p.3463-6 28 Ge-Han Huang (2017), “Rediscovery of Ardisia gigantifolia and the reinstatement of A kteniophylla (Primulaceae) – finding the correct name for the Chinese medicinal plant ’Zou Ma Tai’”,Nordic Journal of Botany 35, p.628–632 29 Gong Q.Q., Mu L.H., Liu P., Yang S.L., Wang B., & Feng Y.L (2010), “New triterpenoid sapoin from Ardisia gigantifolia Stapf.”, Chinese Chemical Letters, 21(4), p.449-452 30 Guan Y F., Song X., Qiu M H., Luo S H., Wang B J., Van Hung N., Cuong N M., Soejarto D D., Fon H H., Franzblau S G., Li S H., He Z D., Zhang H J (2016), “Bioassay-Guided Isolation and Structural Modification of the Anti-TB Resorcinols from Ardisia gigantifolia”, Chem Biol Drug Des, 88(2), p.293-301 46 31 KONG Xiang-hai (2012), “Induction and Optimal Culture of Callus by Sterilized Seedling of Ardisia Crenata”, Journal of Longyan University, p.2 32 Liu H., Zhao Y., Yang R., Zheng M., Wang M., Zhang X., Qiu F., Wang H., Zhao F (2010), “Four New 1,4-Benzoquinone Derivatives and One New Coumarin Isolated from Ardisia gigantifolia”, Helv Chim Acta 93, p.249–256 33 Liu H., Zhao F., Yang R., Wang M., Zheng M., Zhao Y., Wang H (2009), “Dimeric 1,4-benzoquinone derivatives and a resorcinol derivative from Ardisia gigantifolia”, Phytochemistry, 70(6), p.773-778 34 Mu L H., Wei N Y., & Liu P (2012), “Cytotoxic triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia”, Planta Med, 78(6), p.617-621 35 Mu L H., Feng J Q., & Liu P (2013), “A new bergenin derivative from the rhizome of Ardisia gigantifolia”, Nat Prod Res, 27(14), p.1242-1245 36 Mu L.H., Gong Q.Q., Zhao H.X., & Liu P (2010), “Triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia”, Chem Pharm Bull (Tokyo), 58(9), p.12481251 37 Mu L.H., Huang X.W., Guo D.H., Dong X.Z., & Liu P (2013), “A new triterpenoid saponin from Ardisia gigantifolia.”, J Asian Nat Prod Res, 15 (10), p 1123-9 38 Mu L H., Bai L., Dong X Z., Yan F Q., Guo D H., Zheng X L., Liu P (2014),“Antitumor activity of triterpenoid saponin-rich Adisia gigantifolia extract on human breast adenocarcinoma cells in- vitro and in vivo”, Biol Pharm Bull, 37(6), p.1035-41 39 Li-Hua Mu, Hong Yan, Yu-Ning Wang, Teng-Fei Yu and Ping Liu (2018), “Triterpenoid Saponins from Ardisia gigantifolia and Mechanism on Inhibiting Proliferation of MDA-MB-231 Cells”, Biol.Pharm.Bull.42, p.194–200 47 40 Tang Fengluan, Zhao Jian, Zhao Zhiguo, Xia Ke, Qiu Shuo,(2019), “Tissue Culture and Rapid Propagation of Ardisia gigantifolia[J]”, Blulletin of botany, 54(3), p.378-384 41 Wen P., Zhang X.M., Yang Z., Wang N.L., & Yao X.S (2008), “Four new triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia Stapf and their cytotoxic activity”, J Asian Nat Prod Res, 10(9-10), p.873-880 42 Wu Zheng-yi , Peter H Raven (1996), Flora of China (1996), vol 15, p.1-38 43 Vermeersch M., Foubert K., da Luz R I., Van Puyvelde L., Pieters L., Cos P., Maes L (2009), “Selective antileishmania activity of 13,28epoxy-oleanane and related triterpene saponins from the plant families Myrsinaceae, Primulaceae, Aceraceae and Icacinaceae”, Phytother Res, 23, p.1404–1410 48 ... TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG LƯƠNG PHƯƠNG DUNG Mã sinh viên: 1501104 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG TỐI ƯU VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHƠI TÍA NI TRỒNG IN- VITRO (ARDISIA KTENIOPHYLLA). .. Resorcinol Các dẫn xuất resocinol phân lập từ loài Ardisia gigantifolia Stapf 2-methyl- 5 -( Z-nonadec-14-enyl) resorcinol, 5 -( Z-nonadec-14-enyl) resorcinol, 5 -( 8Z-heptadecenyl) resorcinol 5 -( 8Z-pentadecenyl)... Khảo sát môi trường nhân nhanh môi trường sinh rễ Khôi tía in- vitro - So sánh sơ thành phần hóa học Khơi tía sau nhân giống in- vitro (F1) làm nguyên liệu khởi tạo ban đầu (F0) phương pháp sắc