NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH TRONG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HÀ LY NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM CHỨA HÀ THỦ Ô ĐỎ (FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON) TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: Hóa Phân tích MÃ SỐ: 62440118 DỰ THẢO TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Khoa Hố Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Tạ Thị Thảo PGS TS Phương Thiện Thương Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận Án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm Luận án tiến sĩ họp Vào hồi…… giờ…… ngày…… Tháng…… năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Luận án Hà thủ đỏ vị thuốc quí Việt Nam Theo Y học cổ truyền, Hà thủ đỏ có nhiều tác dụng q bổ huyết, điều hồ khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng Y học đại cịn chứng minh Hà thủ đỏ có tác dụng làm giảm lượng đường máu, có tác dụng tốt trường hợp suy nhược thần kinh bệnh thần kinh, làm tăng hoạt động tim, làm tăng co bóp ruột, có tác dụng chống viêm Do đó, Hà thủ đỏ sử dụng rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống người từ xưa đến Tuy nhiên, thị trường, vị thuốc quý bị giả mạo số loại rễ củ như: Hà thủ ô trắng, Củ nâu, Củ cọc tình trạng người sử dụng mua phải dược liệu “rác” bị chiết hết hoạt chất, gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người bệnh quyền lợi người tiêu dùng Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất lượng tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ vấn đề cần thiết Ở Việt Nam, chuyên luận Hà thủ ô đỏ Dược Điển Việt Nam V (2018) quy định hàm lượng chất chiết etanol 30% hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo emodin physicon) Qua khảo sát số mẫu cho kết hầu hết mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam không đạt theo yêu cầu DĐVN V, nguyên nhân chất lượng thực mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam kém, tiêu quy định phương pháp đánh giá DĐVN V chưa phù hợp Vì vậy, cần thiết thực nghiên cứu phân tích thành phần hóa học đối tượng Hà thủ đỏ trồng Việt Nam, từ xây dựng tiêu chí định lượng phù hợp dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng Việt Nam, giúp cho cơng tác kiểm sốt chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam chặt chẽ Mục tiêu Luận án - Nghiên cứu phát triển xây dựng phương pháp định lượng số thành phần hóa học có dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam - Đánh giá hàm lượng thành phần hóa học mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng vùng khác Việt Nam số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ thị trường Nội dung nghiên cứu: - Phát triển phương pháp HPLC-UV phân tích định lượng 2,3,5,4′tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin physcion dược liệu Hà thủ ô đỏ thành phương pháp chuẩn tham chiếu (sử dụng phổ MS/MS đánh giá độ đặc hiệu phương pháp) - Xây dựng phương pháp phân tích định lượng thành phần hóa học có dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam số kỹ thuật sắc ký: TLCscanner Densitometry, HPLC-FLD (có so sánh với phương pháp chuẩn tham chiếu) - Phân tích đánh giá hàm lượng hoạt chất mẫu dược liệu số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ thị trường - Sơ phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa thành phần hoá học kết hợp phương pháp thống kê Những đóng góp Luận án - Nghiên cứu Việt Nam xây dựng phương pháp TLCscanner Densitometry phân tích định lượng THSG, emodin (EM) physcion (PS) Hà thủ ô đỏ - Nghiên cứu Việt Nam xây dựng phương pháp HPLCFLD phân tích định lượng chất 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid (THSG), resveratrol (RES), piceid (PC), emodin (EM) physcion (PS) Hà thủ ô đỏ - Nghiên cứu bước đầu phân loại nguồn gốc dược liệu Hà thủ đỏ dựa thành phần hố học Cấu trúc luận án Luận án gồm chương, 59 bảng, 22 hình, sơ đồ phụ lục, 85 tài liệu tham khảo Luận án gồm 134 trang, gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (28 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị phương pháp nghiên cứu (18 trang); Kết nghiên cứu bàn luận (83 trang); Kết luận Kiến nghị (3 trang) NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Hà thủ ô đỏ 1.1.1 Cây Hà thủ ô đỏ Hà thủ đỏ có tên khoa học Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), Cẩm chướng (Caryophyllales) Hà thủ ô đỏ dây leo, sống nhiều năm, thân thảo, mềm nhẵn, leo quấn vào khác Bộ phận dùng rễ củ màu nâu, hình trụ trịn, dùng thân (Dạ giao đằng) 1.1.2 Dược liệu Hà thủ ô đỏ Dược liệu Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) phần rễ củ phơi hay sấy khô Hà thủ đỏ 1.1.3 Thành phần hóa học dược liệu Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ chứa khoảng 1,7% anthraquinon (emodin, chrysophanol, rhein, physcion,…); 1,1% protid, 45,2% tinh bột, 3,1% lipid, 4,5% chất vô cơ, 26,4% chất tan nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin), 2,3,5,4’tetrahydroxytiben-2-O-β-D-glucosid (THSG) Hàm lượng hoạt chất thay đổi rõ rệt sau chế biến Lúc chưa chế, HTO chứa 7,68% tanin, 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do, 0,8058% dẫn chất anthraquinon tồn phần Sau chế, cịn 3,82% tanin, 0,1127% dẫn chất anthraquinon tự 0,2496% dẫn chất anthraquinon tồn phần Stilben anthraquinon hai nhóm chất đặc trưng cho Hà thủ ô đỏ, nghiên cứu giới nước quan tâm, đặc biệt Dược điển số nước dùng làm chất đối chiếu kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ 1.1.4 Công dụng dược liệu Hà thủ ô đỏ Trong Y học cổ truyền, Hà thủ đỏ có vị đắng chát, ngọt, tính bình; có tác dụng bổ huyết giữ tinh, điều hồ khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân xương, nhuận tràng Trong y học đại, Hà thủ đỏ có tác dụng giảm lượng đường máu, chống viêm, lợi tiểu, điều kinh, hạ sốt, kích thích tiêu hóa, làm tăng hoạt động tim, làm tăng co bóp ruột 1.2 Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thành phần hóa học Hà thủ đỏ 1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích Dƣợc điển Một số Dược điển giới có qui định chuyên luận dược liệu Hà thủ ô đỏ DĐTQ, DĐHK, DĐ Mỹ Trong DĐTQ (2015) DĐ Mỹ qui định sử dụng phương pháp HPLC-UV để định lượng THSG, anthraquinon dạng dẫn xuất mẫu Hà thủ đỏ, DĐHK qui định hàm lượng THSG Mức hàm lượng qui định tiêu Dược điển khác Ở Việt Nam, DĐVN V (2018), chuyên luận Hà thủ ô đỏ bổ sung tiêu định lượng anthraquinon dạng kết hợp (tính theo EM, PS) phương pháp HPLC-UV 1.2.2 Các nghiên cứu khác xác định thành phần hóa học Hà thủ đỏ 1.2.2.1 HPLC-UV HPLC-UV phương pháp phổ biến, áp dụng nhiều phân tích đánh giá chất lượng dược liệu nói chung, dược liệu Hà thủ đỏ nói riêng Rất nhiều nghiên cứu giới áp dụng kỹ thuật xây dựng phương pháp định tính, định lượng đánh giá chất lượng dược liệu Hà thủ đỏ 1.2.2.2 HPLC-FLD HPLC-FLD có phạm vi ứng dụng hẹp HPLC-UV số it chất có khả phát huỳnh quang Với Hà thủ đỏ, nhóm chất anthraquinon stilben có khả phát huỳnh quang Tuy nhiên, giới Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng HPLC-FLD phân tích hợp chất stilben đối tượng dược liệu Hà thủ ô đỏ 1.2.2.3 LC-MS/MS LC-MS/MS phương pháp phân tích có độ xác cao Bên cạnh ý nghĩa phân tích định lượng, LC-MS/MS cịn cung cấp thơng tin liệu phổ khối tín hiệu chất phân tích, từ đánh giá độ tinh khiết pic dự đốn cấu trúc hóa học tín hiệu chất phân tích Với đối tượng Hà thủ đỏ, có nhiều nghiên cứu áp dụng LC-MS/MS LC-MS phân tích thành phần hóa học, đánh giá chất lượng dược liệu phân tích xác định chất điểm đánh giá nguồn gốc mẫu 1.2.2.4 TLC-scanner Densitometry TLC phương pháp sử dụng nhiều kiểm nghiệm dược liệu, dùng tiêu định tính có mặt hầu hết chuyên luận dược liệu Dược điển nước Trên giới Việt Nam, chưa có nghiên cứu cơng bố định lượng hợp chất dược liệu Hà thủ ô đỏ TLC-scanner Một số nghiên cứu giới áp dụng kỹ thuật TLC-scanner định lượng anthraquinon đối tượng khác CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Dược liệu Hà thủ ô đỏ Dược liệu Hà thủ ô đỏ Radix Fallopia multiflora dùng cho thí nghiệm khảo sát mẫu dược liệu đối chiếu Viện Dược liệu Một số mẫu Hà thủ ô đỏ thu hái vùng khác Việt Nam Mẫu lấy phận rễ củ Hà thủ ô đỏ, rửa sạch, thái lát mỏng, phơi, sấy 60oC đến khô bảo quản túi nilon kín 2.1.2 Mẫu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ Đối tượng sản phẩm lựa chọn đánh giá chất lượng Hà thủ đỏ chế Ngồi ra, số sản phẩm khác từ Hà thủ ô đỏ sản phẩm viên nang Hà thủ ô Công ty Cổ phần Dược phẩm TRAPHACO, kí hiệu T-HTO-TPC mẫu trà Hà thủ đỏ Tuấn Anh, kí hiệu Trà-HTO-TA 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phát triển xây dựng phương pháp phân tích định lượng Bước 1: Tối ưu hóa hệ thống phân tích sắc ký: tiến hành khảo sát thơng số: bước sóng, dung mơi, chương trình rửa giải, nhiệt độ cột, thể tích mẫu tiêm,… Bước 2: Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích: - Tính chọn lọc, đặc hiệu độ tinh khiết pic: nghiên cứu sử dụng phổ MS để xác định độ tinh khiết pic - Xác định KTT, dựng đường chuẩn đánh giá đường chuẩn: - Tính thích hợp hệ thống - Độ lặp lại ngày khác ngày - Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp: - Độ (hiệu suất thu hồi) - Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ) 2.2.2 Phương pháp xây dựng qui trình xử lý mẫu 2.2.2.1 Dung mơi chiết xuất - MeOH, EtOH hỗn hợp chúng với nước (tỷ lệ từ 0%-100%) 2.2.2.2 Phương pháp chiết xuất - Chiết siêu âm chiết hồi lưu 2.2.2.3 Nhiệt độ chiết 2.2.2.4 Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/dược liệu: - Khoảng khảo sát từ 20/1 (ml/gam) đến 150/1 (ml/gam) 2.2.2.5 Thời gian chiết số lần chiết - Khảo sát chiết lần lần với thời gian chiết khác CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu xác định hàm lƣợng số thành phần hóa học có dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam HPLC-UV 3.1.1 Phát triển phương pháp HPLC-UV định lượng số thành phần hóa học có dược liệu Hà thủ đỏ Việt Nam 3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện tách hệ sắc ký HPLC  Khảo sát bước sóng phân tích định lượng Quét phổ UV-VIS dung dịch chuẩn THSG, EM PS Từ xác định giá trị λmax Abs tương ứng với λmax chất Tính tốn hệ số ԑ (hay logԑ) Kết hợp số tài liệu, lựa chọn bước sóng 320 nm để định lượng THSG 254 nn để định lượng EM, PS  Khảo sát thành phần pha động chương trình rửa giải Khảo sát số loại pha động gồm: MeOH/nước, ACN/nước, ACN/axit formic 0,5% với chương trình rửa giải khác Từ kết thu được, lựa chọn hệ dung môi rửa giải ACN axit formic 0,5%, với chương trình dung mơi rửa giải khác để phân tích riêng THSG, EM PS: + Đối với EM PS, sử dụng chương trình rửa giải gồm ACN/axit formic 0,5% (80/20, v/v), tốc độ rửa giải ml/phút + Đối với THSG, sử dụng chương trình rửa giải Bảng 3.1, tốc độ rửa giải ml/phút Bảng 3.1 Chương trình dung mơi rửa giải Thời gian (phút) ACN Axit formic 0,5% 0-22 16 84 22-45 16-34 84-66 45-60 34-38 66-62 60 Stop Stop  Khảo sát ảnh hưởng pH pha động, loại axit dùng pha động Tiến hành khảo sát loại axit khác nhau: axit axetic, axit photphoric axit formic Kết thu cho thấy axit formic với pH=3 cho kết thu tín hiệu pic phân tích THSG, EM PS đạt tốt Kiếm tra dung dịch axit formic có pH=3, tương ứng với nồng độ axit formic 0,5%  Khảo sát nhiệt độ lị cột Nhiệt độ khơng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu tách sắc ký cột Từ đó, lựa chọn nhiệt độ lị cột cho q trình phân tích sắc ký nhiệt độ phịng (khoảng 250C-350C)  Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu tiêm vào cột Thể tích mẫu tiêm vào cột ảnh hưởng rõ rệt đến kết phân tích Nếu lượng mẫu tiêm vào cột lớn 20 μl pic THSG, EM PS không đối xứng tốt dẫn đến sai số Vì lựa chọn thể tích mẫu tiêm vào cột 10 μl Từ kết khảo sát trên, lựa chọn điều kiện tối ưu cho q trình phân tích thành phần THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ  Điều kiện HPLC-UV tối ưu phân tích THSG: + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Detector UV: 320 nm + Tốc độ dòng: ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (250C-350C) + Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl + Hệ dung mơi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5% + Chương trình rửa giải: 0-22 phút (16%ACN); 22-45 phút (16-34%ACN); 45-60 (34-38%ACN)  Điều kiện HPLC-UV tối ưu phân tích EM PS: + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Detector UV: 254 nm + Tốc độ dòng: ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (250C-350C) + Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl + Hệ dung môi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5%, tỷ lệ 80 – 20 (v/v) a B Hình 3.1 SKĐ HPLC-UV phân tích THSG, EM PS tối ưu (a-phân tích THSG: 1-THSG; 2,3-các mẫu Hà thủ đỏ; b-phân tích EM PS: 1-PS; 2-EM; 3-Hà thủ đỏ) 3.1.1.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn Các giá trị Pvalue thu lớn 0,05, chứng phương pháp xây dựng không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi sai số hệ thống khơng đổi) Từ đó, xác định CDL CDQ đường chuẩn Bảng 3.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn THSG, EM PS phương pháp HPLC-UV THSG EM PS Khoảng tuyến 0,015-0,24 mg/ml 15,6-700 µg/ml 43,8-700 µg/ml tính Phương trình y = 10^8.x y= 43226.x y= 33383.x hồi quy 20832 29619 24210 SD = Sy 20389 31359 25531 b 10^8 43226 33383 CDL (ppm) 0,61 2,17 2,29 CDQ (ppm) 2,01 7,18 7,57 3.1.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Bảng 3.3 Ảnh hưởng dung môi chiết THSG, EM PS Dung môi chiết Hàm lƣợng THSG (%) EM (mg/g) PS (mg/g) EtOH 100% 1,271 ± 0,03 1,13 ± 0,04 0,44 ± 0,03 EtOH 80% 2,441 ± 0,02 0,85 ± 0,03 0,33 ± 0,02 EtOH 60% 2,520 ± 0,02 0,63 ± 0,03 0,33 ± 0,04 EtOH 50% 0,60 ± 0,03 0,31 ± 0,04 3,193 ± 0,02 EtOH 40% 2,352 ± 0,02 0,56 ± 0,01 0,21± 0,02 EtOH 20% 2,611 ± 0,03 0,35 ± 0,01 0,05 chứng tỏ kết hai phương pháp đạt nhau, sai khác khơng có ý nghĩa thống kê * Đối với hàm lượng PS: Pvalue= 0,677 >0,05 chứng tỏ kết hai phương pháp đạt nhau, sai khác khơng có ý nghĩa thống kê 3.2.4.2 So sánh phương pháp theo đường hồi qui tổng quan THSG EM PS Hình 3.8 Các đường hồi qui tương quan so sánh hàm lượng THSG, EM PS TLC-scanner Densitometry HPLC-UV Kết xử lý thống kê chứng tỏ khơng có khác có nghĩa hai tập số liệu 3.2.5 Kết luận phương pháp xây dựng - Đây công trình Việt Nam nghiên cứu xây dựng phương pháp TLC-scanner Densitometry định lượng đồng thời chất THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ (vẫn sử dụng phương pháp xử lý mẫu khác nhau) 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng số thành phần dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam HPLC-FLD Điều kiện xử lý mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ áp dụng theo phương pháp xử lý mẫu xây dựng Điều kiện phân tích sắc ký HPLC áp dụng theo phương pháp HPLC-UV xây dựng phân tích hợp chất THSG, EM PS Detector huỳnh quang (FLD) cài đặt bước sóng quan sát định lượng phù hợp với chất theo số tài liệu tham khảo 3.3.1 Điều kiện phân tích sắc ký HPLC-FLD 3.3.1.1 Phân tích EM PS + Hệ thống: HPLC hãng Shimadzu, Nhật Bản + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Hệ dung môi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5% 14 + Chương trình dung mơi rửa giải lựa chọn là: ACN- axit formic 0,5% (tỷ lệ 70-30, v/v) + Tốc độ dòng: ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (nên giữ khoảng từ 250C-350C) + Detector FLD: λEx= 435 nm λEm= 515 nm 3.3.1.2 Phân tích THSG, RES PC + Hệ thống: HPLC hãng Shimadzu, Nhật Bản + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Hệ dung mơi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5% + Chương trình dung môi rửa giải lựa chọn là: 0-22 phút (16%ACN); 22-45 phút (16-34%ACN); 45-60 (34-38%ACN) + Tốc độ dòng: ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (nên giữ khoảng từ 250C-350C) + Detector FLD: λEx= 315 nm λEm= 395 nm 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn Các giá trị Pvalue giá trị a thu lớn 0,05, chứng tỏ sai khác giá trị a (trong Y = a + b.X) giá trị khơng có ý nghĩa thống kê, hay nói cách khác, phương pháp xây dựng khơng mắc sai số hệ thống Từ đó, xác định CDL CDQ đường chuẩn Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính đường chuẩn THSG, RES, PC, EM PS phương pháp HPLC-FLD THSG RES PC EM PS Khoảng 1,5-60 1-40 1-40 3,9-62,5 1,36-43,75 tuyến tính µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml Phương Y= Y= Y= y= trình y= 10^6.x 6.10^6.x + 2.10^7.x – 7.10^6.x + 3.10^6.x đường -3.10^6 2.10^6 4.10^6 64250 4.10^6 chuẩn SD = Sy 258298 580085 242643 82215 176888 3.106 b 6.106 2.107 7.106 106 CDL 0,129 0,087 0,104 0,246 0,176 (ppm) CDQ 0,426 0,287 0,343 0,814 0,584 (ppm) 15 3.3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 3.3.3.1 Độ đặc hiệu (tính chọn lọc) Hình 3.9 SKĐ HPLC-FLD đánh giá tính đặc hiệu EM PS Hình 3.10 SKĐ HPLC-FLD đánh giá tính đặc hiệu THSG, RES PC (1-mẫu blank MeOH, 2-hỗn hợp chuẩn EM PS, 3-dược liệu Hà thủ ô đỏ; 4-mẫu Hà thủ ô chế) (1-mẫu blank EtOH 50%; 2-hỗn hợp PC, THSG RES; 3- Hà thủ ô đỏ; 4-mẫu Hà thủ ô chế ) 3.3.3.2 Tính thích hợp hệ thống: Các giá trị %RSDr nhỏ 3%, chứng tỏ phương pháp phân tích có phù hợp hệ thống tốt 3.3.3.3 Độ lặp lại ngày khác ngày: giá trị độ lệch chuẩn lặp lại (%RSDr) hợp chất định phân tích nhỏ 2% Độ lệch chuẩn tái lặp (%RSDR) THSG nhỏ 2%, chất lại (ứng với mức hàm lượng thấp) nhỏ 5% Chứng tỏ phương pháp phân tích có độ chụm tốt 3.3.3.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp (MDL, MQL) Bảng 3.8 MDL, MQL THSG, RES, PC, EM PS HPLC-FLD Chất MDL MQL THSG 61,1 ng/g 202,1 ng/g RES 45,2 ng/g 149,2 ng/g PC 50,5 ng/g 166,6 ng/g EM 100,8 ng/g 332,64 ng/g PS 125,4 ng/g 413,82 ng/g 3.3.3.5 Độ (hiệu suất thu hồi): hiệu suất thu hồi trung bình năm chất PC, THSG, RES, EM PS nằm khoảng 90-110% Vậy kết luận phương pháp phân tích xây dựng có độ xác cao, dùng để phân tích định lượng hợp chất THSG, RES, PC, EM PS mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 3.3.3.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ): ĐKĐBĐ phương pháp phân tích PD 1,52 µg/g, THSG 0,023 g/100g RES 0,5 µg/g, EM 4,19 µg/g, PS 2,83 µg/g 16 3.3.4 Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC-FLD Sơ đồ 3.6 Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC-FLD Sơ đồ 3.7 Qui trình phân tích định lượng EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC-FLD 3.3.5 Kết luận phương pháp xây dựng - Đây nghiên cứu Việt Nam xây dựng phương pháp HPLC-FLD phân tích định lượng đồng thời THSG, RES, PC phân tích đồng thời EM, PS dạng tự dược liệu Hà thủ ô đỏ - Phương pháp HPLC-FLD xây dựng có ưu điểm vượt trội so với phương pháp HPLC-UV độ nhạy: MQL giảm 50 lần THSG, giảm 90 lần EM giảm 110 lần PS 3.3.6 Phân tích định lượng THSG, EM, PS, RES PC mẫu dược liệu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ HPLC-FLD 3.3.6.1 So sánh hai phương pháp HPLC-UV HPLC-FLD phân tích THSG, EM PS  So sánh phƣơng pháp theo cặp * Đối với hàm lượng THSG: Pvalue= 0,321 >0,05 chứng tỏ kết hai phương pháp đạt sai khác khơng có ý nghĩa thống kê 17 * Đối với hàm lượng EM: Pvalue= 0,431 >0,05 chứng tỏ kết hai phương pháp đạt nhau, sai khác khơng có ý nghĩa thống kê * Đối với hàm lượng PS: Pvalue= 0,677 >0,05 chứng tỏ kết hai phương pháp đạt nhau, sai khác ý nghĩa thống kê  So sánh phƣơng pháp theo đƣờng hồi qui tổng quan THSG EM PS Hình 3.15 Các đường hồi qui tương quan so sánh kết phân tích hàm lượng THSG, EM PS HPLC-UV HPLC-FLD Kiểm tra thống kê, chứng tỏ khác có nghĩa hai tập số liệu 3.3.6.2 Phân loại nguồn gốc mẫu phương pháp thống kê Scree Plot of C1, , C5 Dendrogram Single Linkage, Euclidean Distance 3.0 2.5 76.37 Eigenvalue Similarity 2.0 84.24 1.5 1.0 92.12 0.5 0.0 100.00 Component Number 13 19 14 16 15 21 30 20 24 27 23 17 10 25 28 43 11 12 18 29 26 44 45 22 48 37 40 38 39 41 47 46 42 31 35 34 36 33 32 Observations A Hình 3.11 Đồ thị CA mẫu Hà thủ đỏ B Hình 3.12 Đồ thị PCA mẫu Hà thủ ô đỏ (a-Scree plot; b-Score plot) - Nhóm mẫu 1: mẫu Hà thủ trồng vùng đồng phía Bắc: có thành phần hóa học tương đối giống nhau, có thành phần THSG, PC, EM PS Điểm tạo nên khác biệt nhóm mẫu với nhóm mẫu khác có thành phần anthraquinon (gồm EM, PS) - Nhóm mẫu 2: mẫu thu tự nhiên Hà Giang: có thành phần THSG, EM , PS PC, hàm lượng THSG cao nhóm mẫu - Nhóm mẫu nhóm mẫu 4: mẫu thu hái tự nhiên có nguồn gốc Sơn La Lai Châu (2 tỉnh miền núi Tây Bắc giáp nhau): có mẫu thuộc nhóm mẫu thành phần RES Thông tin gợi ý cho nghiên cứu truy xuất nguồn gốc cho dược liệu Hà thủ ô đỏ Sơn La Lai châu 18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận phƣơng pháp phân tích Đã phát triển xây dựng phương pháp phân tích sau: - Phát triển phương pháp HPLC-UV định lượng thành phần THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ thành phương pháp phân tích chuẩn tham chiếu - Xây dựng phương pháp TLC-scanner Densitometry định lượng thành phần THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ - Xây dựng phương pháp HPLC-FLD định lượng thành phần THSG, RES, PC, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ Các phương pháp chứng minh khác khơng có ý nghĩa thống kê, sử dụng phương pháp thay cho nhau, tùy vào mục đích, trang thiết bị yêu cầu độ xác kết đạt được: + TLC-scanner Densitometry phương pháp đơn giản thao tác thí nghiệm trang thiết bị, ưu điểm phân tích đồng thời nhiều mẫu (từ đến 20 mẫu) nên giảm thời gian chi phí phân tích Vì vậy, kiến nghị nên sử dụng phương pháp TLC-scanner Densitometry số thí nghiệm như: định tính khẳng định tính dược liệu, so sánh sơ chất lượng dược liệu sản phẩm từ dược liệu + HPLC-UV phương pháp phân tích phổ biến lĩnh vực kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Kiến nghị nên sử dụng HPLC-UV để định lượng hợp chất THSG, EM PS Hà thủ ô đỏ Phương pháp nên đưa vào chuyên luận Dược điển Tiêu chuẩn sở Hà thủ đỏ nhằm kiểm sốt chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ + HPLC-FLD phương pháp có độ nhạy cao nên phù hợp để phân tích thành phần có hàm lượng thấp mẫu, nên áp dụng nghiên cứu cần độ nhạy cao nghiên cứu dược động học, nghiên cứu tích lũy sinh học hoạt chất Hà thủ đỏ, cho kết xác hơn, phát EM, PS mẫu có hàm lượng thấp 4.2 Kết luận nội dung đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ - Hàm lượng THSG, EM PS mẫu Hà thủ ô khác khác rõ rệt, đặc biệt vùng có vị trí địa lý khác hẳn Các mẫu trồng vùng núi cao thường có hàm lượng THSG cao mẫu trồng vùng có độ cao thấp Đề xuất nên đưa tiêu hàm lượng THSG Hà thủ ô đỏ Việt Nam vào chuyên luận Dược điển TCCS, mức yêu cầu nên quy định không thấp 2% - Tại số vùng có khảo sát mẫu trồng theo năm tuổi thấy rằng, hàm lượng hoạt chất THSG, EM PS mẫu năm lớn rõ rệt so với mẫu năm, đến năm hàm lượng hoạt chất THSG, EM PS 19 tăng tăng chậm so với năm Từ đó, kiến nghị nên sử dụng dược liệu Hà thủ đỏ từ năm tuổi 4.3 Kết luận đánh giá chất lƣợng số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ - Đối với mẫu Hà thủ ô đỏ chế, hàm lượng THSG đạt khoảng từ 0,6-1,1%, thấp nhiều so với mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ, đặc biệt đối chiếu cặp HTO-38 HTO-Chế-1, HTO-15 HTO-Chế-2, hàm lượng THSG mẫu chế giảm khoảng lần so với mẫu dược liệu sống - Đối với mẫu sản phẩm thuốc công ty Traphaco Trà Hà thủ ô Tuấn anh, khơng có thành phần EM PS, mẫu Trà Hà thủ khơng có THSG, THSG mẫu thuốc Công ty Traphaco đạt 20,41 mg/viên 4.4 Đã áp dụng phƣơng pháp phân tích đa biến để phân loại mẫu vào nhóm tƣơng ứng, làm sở để giúp phân biệt mẫu HTOĐ theo nguồn gốc khác nhau: - Phân loại mẫu theo kết định lượng: phân loại mẫu theo nhóm mẫu Hà Giang, Sơn La, Lai Châu, vùng đồng phía mẫu có nguồn gốc từ Trung Quốc - Từ kết phân loại theo CA PCA cho thấy hai phương pháp sử dụng cho kết đáng tin cậy, xác có ý nghĩa Kết phân loại phương pháp tương đối giống nhau, điều chứng tỏ nghiên cứu thành công phân loại nguồn gốc HTOĐ thành phần hoá học Tuy nhiên, việc phân loại cần phải cải thiện, cần có nghiên cứu sâu hơn, bao gồm thực nghiệm nhiều mẫu cần thiết sử dụng máy phân tích khối lượng phân giải cao 20 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen Thi Ha Ly, Phuong Thien Thuong, Ta Thi Thao, Nguyen Thi Phuong (2017), “HPTLC quantitative analysis of two stilbenoids in Radix Fallopiae multiflorae collected from different geographical region of Vietnam”, Journal of Medicinal Materials 22(5), pp 306-310 Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Thị Hà Ly (2017), “Điều tra phân bố đánh giá chất lượng nguồn gen Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) phục vụ công tác bảo tồn phát triển Việt Nam”, Tạp chí Khoa Học Đại học Quốc Gia Hà Nội, Số 1, tập 33, trang 24-31 Nguyen Thi Ha Ly, Phuong Thien Thuong, Ta Thi Thao, Phan Van Truong (2018), “Development of RP-HPLC-fluorescence method for silmutaneous quantitative determination of anthraquinones in Radix Fallopiae multiflorae”, Tạp chí Hóa học, 56(3E12) 290-295 Nguyen Thi Ha Ly, Ta Thi Thao, Phuong Thien Thuong (2018), “Distribution of the contents of active components in Radix Fallopiae multiflorae in Vietnam”, World Journal of Pharmaceutical and Life Sciences, Vol 4, Issue 12, 7-12 Nguyen Thi Ha Ly, Phan Van Truong, Ta Thi Thao, Phuong Thien Thuong (2019), “Study on fingerprint of radix Fallopiae multiflorae by HPLC-DADMS”, World Journal of Pharmaceutical and Life Sciences, Vol 5, Issue 2, 8892 Nguyen Thi Ha Ly, Ta Thi Thao, Phuong Thien Thuong (2019), “Quality Evaluation of Fallopia multiflora in Vietnam Based on HPLC-FLD and Chemometrics”, Tạp chí Dược liệu, số 3, 131-138 Nguyễn Thị Phương, Nguyễn Thị Hà Ly, Phương Thiện Thương (2018), “Lựa chọn chất đối chiếu kiểm nghiệm chất lượng dược liệu sản phẩm từ dược liệu: số đóng góp từ nghiên cứu khoa học”, Báo cáo hội nghị khoa học Bộ Y tế tháng 7/2018 “Nâng cao lực nghiên cứu, kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu thuốc từ dược liệu” Đà Nẵng 21 ... chất phân tích, từ đánh giá độ tinh khiết pic dự đốn cấu trúc hóa học tín hiệu chất phân tích Với đối tượng Hà thủ ô đỏ, có nhiều nghiên cứu áp dụng LC-MS/MS LC-MS phân tích thành phần hóa học, đánh. .. chẽ Mục tiêu Luận án - Nghiên cứu phát triển xây dựng phương pháp định lượng số thành phần hóa học có dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam - Đánh giá hàm lượng thành phần hóa học mẫu dược liệu Hà thủ... QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu xác định hàm lƣợng số thành phần hóa học có dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam HPLC-UV 3.1.1 Phát triển phương pháp HPLC-UV định lượng số thành phần hóa học có dược