Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ rong đỏ gracilaria eucheumatoides

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỖ THỊ KIỀU VY NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ GRACILARIA EUCHEUMATOIDES ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học) Nha Trang – Năm: 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỖ THỊ KIỀU VY NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ GRACILARIA EUCHEUMATOIDES ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học) GVHD: TS LÊ ĐÌNH HÙNG Nha Trang – Năm: 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên: Đỗ Thị Kiều Vy MSSV: 55134401 Lớp: 55CNHH Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ rong đỏ Gracilaria eucheumatoides” Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo: Hiện vật: NHẬN XÉT: KẾT LUẬN: Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ký ghi rõ họ tên) CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc PHIẾU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG ĐỀ TÀI Họ tên sinh viên: Đỗ Thị Kiều Vy MSSV: 55134401 Lớp: 55CNHH Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ rong đỏ Gracilaria eucheumatoides” Số chương: Số trang: Tài liệu tham khảo: Hiện vật: NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Kết luận Điểm phản biện Bằng số Bằng chữ Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017 CÁN BỘ PHẢN BIỆN (Ký ghi rõ họ tên) _ Điểm phản biện Bằng số Bằng chữ Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký ghi rõ họ tên) i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Nha Trang tận tình truyền đạt kiến thức năm học vừa qua Với vốn kiến thức tiếp thu trình học không nền tảng cho trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học mà hành trang quý báu để định hướng công việc mai sau Cảm ơn anh chị Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển- Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang- Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ trình thực đồ án tốt nghiệp đại học Đặc biệt cảm ơn thầy TS Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Công Nghệ Sinh Học Biển-Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang) sự giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy suốt trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ trình học tập hoàn thiện đồ án Trong trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học, trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp quý thầy cô Đồ án tốt nghiệp đại học thực từ đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ chức năng, cấu trúc hoạt tính sinh học lectin liên kết high-mannose từ rong đỏ Việt Nam” Quỹ Khoa học Công Nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số:106-YS-2015.16 Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên ĐỖ THỊ KIỀU VY ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong biển .3 1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển .3 1.1.2 Phân loại rong biển 1.1.3 Rong đỏ Gracilaria eucheumatoides 1.2 Tổng quan về lectin .6 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 1.2.2 Sự phân bố lectin sinh giới 1.2.2.1 Lectin giới thực vật .7 1.2.2.2 Lectin giới động vật 1.2.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật 1.3 Lectin từ rong biển 1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin giới nước 1.3.2 Cấu tạo lectin từ rong biển 10 1.3.3 Một số tính chất vật lý, hóa sinh học lectin từ rong biển 13 1.3.3.1 Tính tan kết tủa 13 1.3.3.2 Sự tương tác lectin từ rong biển với loại đường dẫn xuất 13 1.3.3.3 Khả gây ngưng kết tế bào 13 1.3.3.4 Ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt độ lectin 14 1.4 Ứng dụng lectin từ rong biển 15 1.5 Phương pháp thu nhận lectin .17 1.5.1 Các kỹ thuật chiết lectin 17 1.5.2 Các kĩ thuật tinh chế lectin 18 iii CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu .20 2.2 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu .20 2.2.1 Đối tượng 20 2.2.2 Hóa chất 20 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu .21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Xác định hoạt độ lectin phương pháp ngưng kết hồng cầu 22 2.3.2 Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry (1951) 23 2.3.3 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển 25 2.3.3.1 Phương pháp xác định điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 26 2.3.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết (TN1) .27 2.3.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) (TN2) 28 2.3.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) (TN3) .29 2.3.3.5 Khảo sát tác nhân tủa ammonium sunfate (NH4)2SO4 nồng độ tủa (%) thích hợp để thu chế phẩm lectin .30 2.3.4 Tinh lectin phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose 31 2.3.5 Tinh lectin phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 32 2.3.6 Kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử lectin phương pháp điện di SDS-PAGE 33 2.3.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides .35 2.3.7.1 Khảo sát nhiệt độ hoạt động thích hợp 35 2.3.7.2 Khảo sát pH hoạt động thích hợp 35 2.3.8 Phương pháp khảo sát khả liên kết carbohydrate lectin 36 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết điều kiện tách chiết lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 38 3.1.1 Ảnh hưởng dung môi đến hoạt độ NKHC lectin có rong đỏ G eucheumatoides .38 iv 3.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC lectin có rong đỏ G eucheumatoides 39 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ NKHC lectin có rong đỏ G eucheumatoides 40 3.2 Kết tinh lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 41 3.2.1 Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 để kết tủa lectin 41 3.2.2 Tinh lectin sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose 43 3.2.3 Tinh lectin sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 44 3.2.4 Kiểm tra độ tinh xác định trọng lượng phân tử từ lectin phương pháp điện di SDS-PAGE .45 3.2.5 Kết tổng hợp trình tinh lectin từ rong đỏ G eucheumatoides .46 3.3 Kết xác định tính chất lý, hóa sinh học lectin từ rong đỏ G eucheumatoides .48 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 48 3.3.2 Ảnh hưởng pH 49 3.3.3 Khả ngưng kết loại hồng cầu khác lectin .50 3.4 Khả liên kết carbohydrate lectin rong đỏ G eucheumatoides 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .54 KẾT LUẬN .54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 60 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A : Độ hấp thu (Absorbance) APS : Ammonium persulfate DC : Dịch chiết G eucheumatoides : Gracilaria eucheumatoides HA : Hoạt độ ngưng kết hồng cầu HC : Hồng cầu HĐR : Hoạt độ riêng HĐTS : Hoạt độ tổng số NKHC : Ngưng kết hồng cầu OD : Mật độ quang học (Optical density) PB : Phosphate buffer (đệm phosphate) PBS : Phosphate buffered saline (đệm phosphat chứa NaCl 0,15M) PL : Phụ lục TEMED : Tetra methylethylenediamine vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Trình tự xếp axit amin đầu tận N rong đỏ Kappaphycus striatum [21] loài rong thuộc chi Eucheuma [29, 30] 12 Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả diệt côn trùng 16 Bảng 2.1: Các máy móc thiết bị chính sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.2: Khảo sát khả liên kết lectin với số loại đường glycoprotein 36 Bảng 3.1: Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 % đến HĐTS, HĐR hiệu suất thu hồi lectin 41 Bảng 3.3: Kết tinh lectin từ rong đỏ G eucheumatoides (100 g rong tươi) .46 Bảng 3.4: Khả gây ngưng kết loại hồng cầu khác lectin 50 Bảng 3.5: Nồng độ đường glycoprotein nhỏ có khả ức chế hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 51 Bảng PL 1: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (μg/ml) 60 Bảng PL 2: Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn 60 Bảng PL 3: Ảnh hưởng dung môi chiết đến MAC, HĐTS HĐR lectin 60 Bảng PL 4: Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) đến MAC, HĐTS HĐR lectin 61 Bảng PL 5: Ảnh hưởng thời gian chiết (giờ) đến MAC, HĐTS HĐR lectin 61 Bảng PL 6: Kết đo A 280 nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose 62 Bảng PL 7: Kết đo A 280 nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau sắc lọc gel cột nhựa Sephacryl S-200 63 Bảng PL 8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 64 Bảng PL 9: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides 64 50 3.3.3 Khả ngưng kết loại hồng cầu khác lectin Bảng 3.4: Khả gây ngưng kết loại hồng cầu khác lectin Thỏ Tự nhiên (HU/ml) - Xử lý trypsin (HU/ml) 28 Xử lý papain (HU/ml) 210 Cừu 24 29 29 Gà - 27 27 Nhóm máu A - - 25 Nhóm máu B - - 25 Nhóm máu O - - 24 Hồng cầu “-“: Lectin khả gây NKHC Kết từ bảng 3.4 cho thấy, lectin từ DC rong G eucheumatoides có khả gây ngưng kết tế bào hồng cầu động vật cao hẳn nhóm máu người Đặc biệt với hồng cầu thỏ xử lý enzyme trypsin papain khả gây ngưng kết hồng cầu đều cao nhiều so với hồng cầu tự nhiên Còn lại nhóm máu người lectin từ DC rong G eucheumatoides có khả gây ngưng kết với hồng cầu xử lý papain Sở dĩ có tượng hồng cầu xử lý với enzyme (trypsin, papain) chính enzyme thủy phân giới hạn số protein bề mặt tế bào hồng cầu, làm bộc lộ nhóm đường nó, lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, gây nên tượng ngưng kết tế bào làm cho hoạt độ lectin tăng lên Kết khảo sát khả gây ngưng kết loại hồng cầu khác 42 loài rong vùng biển Ninh Thuận TS Lê Đình Hùng cộng sự năm 2012 [25] cho thấy, hầu hết loài rong đều có khả gây ngưng kết với hồng cầu thỏ cừu, khả gây ngưng kết loại hồng cầu lại ngựa, gà người đều cho tỷ lệ thấp, đặc biệt hồng cầu người Kết nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC lectin tăng lên rõ rệt hồng cầu xử lý enzyme Không có khả gây ngưng kết nhóm máu người đặc hiệu, lectin từ rong đỏ G eucheumatoides công cụ xác định nhóm máu giống số lectin từ rong khác Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B hay Codium fragile ngưng kết với hồng cầu máu A xử lý papain [40] Tuy nhiên, việc không gây ngưng kết tế bào hồng cầu người tự nhiên đồng nghĩa với việc lectin 51 không gây độc với người, nghiên cứu sử dụng chúng để bổ sung vào thực phẩm hay dược phẩm cho người cần thiết 3.4 Khả liên kết carbohydrate lectin rong đỏ G eucheumatoides Khảo sát khả liên kết carbohydrate lectin với số loại đường trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Nồng độ đường glycoprotein nhỏ có khả ức chế hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides Cmin Mẫu HI (mM), (µg/ml) D-glucose - - D-mannose - - D-galactose - - L-rhamnose - - Đường L-fucose - - (100mM) D-xylose - - N-acetyl-D-glucosamine 21 50,0 N-acetyl-D-galactosamine 21 50,0 N-acetyl-D-mannosamine - - N-acetylneuraminic acid - - Transferrin 22 500,0 Asialo-transferrin 24 125,0 Fetuin 24 125,0 Asialo-fetuin 27 15,6 Yeast mannan - - 25 62,5 23 250,0 Asialo-bovine submaxillary mucin 23 250,0 Porcine stomach mucin (Type III) 26 31,25 Asialo-Porcine stomach mucin 28 7,8 Trypsin-treated Porcine stomach mucin 27 15,6 Glycoprotein Thyroglobulin (2000µg/ml) Bovine submaxillary mucin 52 “-“: Đường 100 mM hay glycoprotein 2000 µg/ml khả gây ức chế hoạt độ NKHC lectin “HI”: khả gây ức chế hoạt độ NKHC “Cmin”: nồng độ nhỏ đường (mM) glycoprotein (µg/ml) có khả gây ức chế hoạt độ NKHC Kết từ bảng 3.5 cho thấy, hoạt độ NKHC lectin từ rong G eucheumatoides bị ức chế sự có mặt 2/10 loại đường đơn khảo sát N-acetyl-D-glucosamine N-acetyl-D-galactosamine Nghĩa lectin có khả liên kết với loại đường Bên cạnh đó, khảo sát khả liên kết lectin với glycoprotein cho thấy, lectin không liên kết với Yeast mannan, 10/11 loại glycoprotein lại liên kết với lectin nồng độ khác Đặc biệt, glycoprotein Asialofetuin, Porcine stomach mucin (Type III), Asialo- Porcine stomach mucin, Trypsintreated Porcine stomach mucin có khả làm ức chế hoạt tính NKHC lectin với nồng độ thấp, với nồng độ tương ứng 15,6; 31,25; 7,8; 15,6 (µg/ml) Theo kết nghiên cứu Hori cộng sự năm 1990 [17], hầu hết lectin từ rong biển không tương tác với đường đơn đường đa mà tương tác với glycoprotein Trong đó, lectin thu nhận từ thực vật bậc cao lại có khả tương tác mạnh với loại đường đơn [28] Từ kết xác định đặc tính lectinvới glycoprotein cho thấy lectin từ rong đỏ G eucheumatoides có khả tương tác với glycoprotein dạng Nglycan Transferrin, Asialo-transferrin, Fetuin, Asialo-fetuin, Thyroglobulin Oglycan Bovine submaxillary mucin, Asialo-bovine submaxillary mucin, Porcine stomach mucin (Type III), Asialo- Porcine stomach mucin, Trypsin-treated Porcine stomach mucin Đặc biệt, hàng loạt lectin có khả liên kết với glycoprotein N-glycan dạng high manose như: lectin ESA_2 rong đỏ Eucheuma sera [19], lectin từ rong đỏ Griffithsia sp [18] , lectin KAA_2 rong đỏ Kappaphycus alvarezii [41], lectin KSA2 từ rong Kappaphycus striatum [27], lectin từ rong Eucheuma denticulatum [22] 53 có khả ngưng kết với bề mặt tế bào có glycoprotein dạng high manose, đặc biệt lớp vỏ virus HIV, HBV số loại virus gây bệnh khác [28] Trong đó, lectin từ loài rong nghiên cứu, ứng dụng thành công lĩnh vực y sinh như: chữa trị số bệnh ung thư, bệnh virus hay vi khuẩn gây [15, 31, 41] Đây tiền đề quan trọng thuận lợi bước đầu để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng lectin từ rong G eucheumatoides cho lĩnh vực khác 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  KẾT LUẬN Từ kết thu qua thí nghiệm đề tài, xin rút kết luận cho quy trình tách chiết, tinh khảo sát số tính chất lectin từ rong đỏ G.aeucheumatoides sau: Các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ G eucheumatoides - Dung môi chiết: PBS 0,02 M, NaCl 0,15M, pH 7,5 - Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v): 1:10 - Thời gian chiết: - Nhiệt độ chiết: oC Kết tinh lectin từ rong đỏ G eucheumatoides - Tinh lectin phương pháp kết tủa với muối amonium sunfate (NH4)2SO4 70%, nhiệt độ tủa oC thời gian tủa - Sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose thu chế phẩm có HĐTS 13440 HU, HĐR đạt 488,55 HU/mg, nồng độ nhỏ gây NKHC 2,05 μg/ml, độ tinh 3,5 lần - Sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 thu chế phẩm có HĐTS 4480 HU, HĐR đạt 1400,44 HU/mg, nồng độ nhỏ gây NKHC 0,71 μg/ml, độ tinh 10,04 lần Trọng lượng phân tử lectin chiết tách từ rong đỏ G eucheumatoides khoảng 17.600 ± 200 Da lectin tồn dạng monomer Nghiên cứu bước đầu xác định số tính chất đặc trưng lectin từ rong đỏ G eucheumatoides bao gồm: - Lectin bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động rộng từ 20 đến 50 oC Nhiệt độ hoạt động ổn định lectin (duy trì 100% hoạt tính sau 30 phút phản ứng) 20 đến 50 oC - Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH đến 10 không phụ thuộc vào sự có mặt cation hóa trị II Ca2+ [24] - Lectin khả ngưng kết với loại HC tự nhiên người, thỏ gà (trừ HC cừu) Tuy nhiên, với HC xử lý trypsin lectin lại có khả gây ngưng kết với HC thỏ, cừu, gà lại không liên kết nhóm máu người Còn HC xử lý papain, lectin đều ngưng kết nhóm máu người động vật 55 - Lectin có khả liên kết với 2/10 loại đường là: N-acetyl-D-glucosamine N-acetyl-D-glactosamine Đối với glycoprotein liên kết với 10/11 loại glycoprotein nồng độ khác là: Transferrin, Asialo-transferrin, Fetuin, Asialo-fetuin, Thyroglobulin, Bovine submaxillary mucin, Asialo-bovine submaxillary mucin, Porcine stomach mucin (Type III), Asialo- Porcine stomach mucin, Trypsintreated Porcine stomach mucin  KIẾN NGHỊ Để sản phẩm lectin có khả ứng dụng, có kiến nghị sau đây: Đánh giá số hoạt tính sinh học (khả kháng khuẩn, khả phân bào ) lectin Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm sau tinh Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ rong đỏ G eucheumatoides lĩnh vực y học, nông nghiệp số lĩnh vực khác 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt [1] Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyên Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, et al Cơ sở công nghệ sinh học- Tập 2: Công nghệ hóa sinh NXB Giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng 2009 [2] Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh Tách tinh chế số tính chất Lectin từ hạt chay A.tonkinenis Tạp chí khoa học 1991;(13(2)):20-7 [3] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa Chế biến rong biển Giáo trình Đại Học Nha Trang [4] Trương Văn Châu Một số tính chất hóa sinh lectin mít na Tạp chí khao học- ĐHSP Hà Nội 2004;(4):83-7 [5] Võ Thị Diệu Trang Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Kapphycus striatum khảo sát khả ứng dụng [Thạc sĩ kỹ thuật]: Đại học Bách Khoa Hà Nội; 2011 Tài Liệu Tiếng Anh [6] Allen NK, Brillantine L A survey of hemagglutinins in various seeds J Immunol 1969;(102):1295-9 [7] Balzarini J, Scholls D, Neyts J, Van Damme E, Peumans W, De Clercq E Alpha- (1,3)- and alpha-(1,6)- D-mannose- specific plant lectin are markedly inhibitory to human immunodeficiency virus and cytomegalovirus infections in vitro Antimicrob Agents Chemother 1991;(35(3)):410-6 [8] Benevides NMB, Holanda ML, Melo FR, Freitas ALP, Sampaio AH Purification and Partial Characterization of the Lectin from the Marine red alga Enantiocladia duperreyi (C Agardh) Falkenberg Botanica Marina 1998;(41):521-5 [9] Boyd WC, Almodovar LR, Boyd LG Agglutinins in marine algea for human erythrocytes Transfusion (Philadelphia) 1966;(6):82-3 [10] Calvete JJ, Costa FHF, Saker-Sampaio S, Murciano MP, Nagano CS, Cavada BS, et al The amino acid sequence of the agglutinin isolated from the red marine algae Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure Cell Mol Life Sci 2000;(57):343–50 [11] Fabregas J et al A comparative study of seafish erythrocytes and agglutinins from seaweeds Comp Biochem Physiol 1992;(103A No.2):307-13 57 [12] Goldstein IJ, Hughes RC, Monsigny M, Osawa T, Sharon N What should be call a letin Nature (London) 1980;(285):66 [13] Han JW, Yoon KS, Klochkova TA, Hwang MS, Kim GH Purification and characterization of a lectin, BLP-3, from the marine green alga Bryopsis plumose J Appl Phycol 2011;(23):745-53 [14] Harvey WH Characters of new algae, chiefly from Japan and adjacent regions, collected by Charles Wright in the North Pacific Exploring Expedition under Captain James Rodgers Proceedings of the American Academy of Arts and Sciences 1860;(4):327-35 [15] Hirayama M, Shibata H, Imamura K, Sakaguchi T, Hori K High-Mannose Specific Lectin and Its Recombinants from a Carrageenophyta Kappaphycus alvarezii Represent a Potent Anti-HIV Activity Through High-Affinity Binding to the Viral Envelope Glycoprotein gp120 Mar Biotechnol 2016;(18):144–60 [16] Hori K, Keisuke M, Keiji I Preliminary characterization of agglutinins from seven marine algal species Bull Jpn Soc Sci Fish 1986;(55(2)):323-31 [17] Hori K, Keisuke M, Keiji I Some common properties of lectins from marine algae Hydrobiologia 1990;(204/205):561-6 [18] Hori K, Oiwa C, Miyazawa K, Ito K Evidence for wide distribution of Agglutinins in Marine Algae Botanica Marina 1988;(31):133-8 [19] Hori K, Sato Y, Ito K, Fujiwara Y, Iwamoto Y, Makino H, et al Strict specificity for high-mannose type N-glycans and primary structure of a red alga Eucheuma serra lectin Glycobiology 2007;(17 no5):479–91 [20] Huesing JE, Murdock LL, Shade RE Rice and stinging nettle lectins: Insecticidal activity similar to wheat germ agglutinin Phytochemistry 1991;(30 No11):3565-8 [21] Hung LD, Hirayama M, Ly BM, Hori K Biological activity, cDNA cloning and primary structure of lectin KSA-2 from the cultivated red alga Kappaphycus striatum (Schmitz) Doty ex Silva Phytochemistry letters 2015;(14):99 – 105 [22] Hung LD, Hirayama M, Ly BM, Hori K Purification, primary structure, and biological activity of the high-mannose N-glycan-specific lectin from cultivated Eucheuma denticulatum J Appl Phycol 2015;(27):1657–69 58 [23] Hung LD, Hori K Purification and preliminary characterization of lectins from three color strains of the red marine alga, Kappaphycus alvarezii (doty) doty ex silva Journal of biotechnology 2007;(5(4)):453-61 [24] Hung LD, Hori K, Nang HQ Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae J Appl Phycol 2009a;(21):89-97 [25] Hung LD, Ly BM, Trang VTD, Ngoc NTD, Hoa LTH, Trinh PTH A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae J Appl Phycol 2012;(24):227-35 [26] Hung LD, Sato T, Shibata H, H K Biochemical comparisonof lectins among three different color strains of the red alga, Kappaphycus alvarezii FishSci 2009b;(75):723-30 [27] Hung LD, Sato Y, Hori K High-mannose N-glycan-specific lectins from the red alga Kappaphycus striatum (Carrageenophyte) Phytochemistry 2011;(72):855-61 [28] Hung LD, Trang VTD, Ngoc NTD High-manose type N-glycan specific lectins from red marine algae, caragenophytes Biotechnology 2011;(9(1)):87-98 [29] Kawakubo A, Makino H, Hibohara H, Horri K The Marine red alga Eucheuma serra J Agardh, a high yielding source of two isolectins J Appl Phycol 1997;(9):3318 [30] Kawakubo A, Makino H, Ohnishi J, Hibohara H, Horri K Occurrence of highly yielded lectin homologous within the genus Eucheuma Journal of Applied Phycology 1999;(11):149-56 [31] Kocourek J Molecular Biology Chapter 1: Historical Background 1986:1-26 [32] Kumar S, Barros U Isolation of human erythrocyte agglutinins from marine algae Journal of Natural Pharmaceuticals 2012;(1):51-4 [33] Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 2007 1970:680-5 [34] Leite YF, Silva LM, Amorim RC, Freire EA, de Melo Jorge DM, Grangeiro TB, et al Purification of lectin from the marine red alga Gracilaria ornata and its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) Biochim Biophys Acta 2005;(1724):137-45 [35] Lima ME, Carneiro ME, Nascimento AE, Grangeiro TB, Holanda ML, Amorim RC, et al Puriffication of lectin from marine red alga Gracilaria cornea and its effect 59 on the cattle tick Boophilus microolus (Acari: Ixodidae) J Agric Food Chem 2005;(53):6414-9 [36] Lowry OH et al Protein measurement with folin-phenol reagent JBiol Chem 1951;(193):256-7 [37] Ofek I, Beachey EH Mannose binding and epothelial cell adherence of Escherichia coli Infect Immun 1987;(22(1)):247-54 [38] Peumans WJ, Van Damme EJ The role of lectins in plant defence Histochem J 1995;(27):253-71 [39] R Melo FR, Benevides NMB, Pereira MG, Holanda ML, Mendes FNP, Oliveira SRM Silva Purification and partial characterisation of a lectin from the red marine alga Vidalia obtusiloba C Agardh Rev bras Bot 2004;(27):263-9 [40] Rogers DJ, Fish Marine algal lectins Lectin Reviews 1991;(1): 129-42 [41] Sato Y, Morimoto K, Hirayama M, Hori K High mannose-specific lectin (KAA2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus infection in a strain- independent manner Biochemical and Biophysical Research Communications 2011;(405):291-6 [42] Sharon N, Lis H Lectins Chapman & Hall London 1989 [43] Stelio RMO, Antonia EN, Maria EPL, Yaskara FMML, Norma MBB Purification and characterization of a lectin from the red alga Pterocladiella capillacea (S.G Gmel.) Sentel &Hommers Revista Brasil Bol 2002;(25(4)):397-403 60 PHỤ LỤC Bảng PL 1: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (μg/ml) Nồng độ BSA (μm/ml) ̅̅̅̅ 𝐎𝐃750 nm 20 0,05095 40 0,09995 80 0,20295 120 0,29145 160 0,39495 200 0,49995 Bảng PL 2: Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn Trọng lượng phân tử M(Da) Khoảng cách di chuyển vạch protein D (cm) Rf lg M 75000 0,75 0,12 4,88 58000 0,16 4,76 46000 1,4 0,23 4,66 32000 0,33 4,51 25000 2,65 0,43 4,4 22000 3,3 0,54 4,34 17000 3,7 0,61 4,23 11000 4,7 0,77 4,04 Bảng PL 3: Ảnh hưởng dung môi chiết đến MAC, HĐTS HĐR lectin Dung môi Thể tích (ml) HA (HU/ml) Protein tổng (mg) MAC (μg/ml) HĐTS (HU) HĐR (HU/mg) Ethanol 20% 20 256 24,8 96,88 5120 206,45 PBS 20 256 16,6 64,84 5120 308,43 61 Bảng PL 4: Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) đến MAC, HĐTS HĐR lectin Tỷ lệ Thể tích (ml) HA (HU/ml) Protein tổng (mg) MAC (μg/ml) HĐTS (HU) HĐR (HU/mg) 1:4 16 5,96 372,5 128 21,48 1:6 12 32 9,78 305,63 384 39,26 1:8 16 256 19,2 75 4096 213,33 1:10 20 512 25 48,83 10240 409,6 1:12 24 256 28,44 111,1 6144 216,03 1:14 28 128 30,1 235,16 3584 119,07 Bảng PL 5: Ảnh hưởng thời gian chiết (giờ) đến MAC, HĐTS HĐR lectin Thời gian (giờ) Thể tích (ml) HA (HU/ml) Protein tổng (mg) MAC (μg/ml) HĐTS (HU) 20 64 14 218,75 1280 91,43 20 128 14,9 116,41 2560 171,81 20 512 24,2 47,27 10240 423,14 20 512 25,3 49,41 10240 404,74 10 20 512 27,5 53,71 10240 372,36 12 20 512 29.7 58.01 10240 344.78 HĐR (HU/mg) 62 Bảng PL 6: Kết đo A 280 nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau sắc ký trao đổi ion DEAE- sepharose STT A 280 nm Hoạt độ ngưng kết STT A 280 nm Hoạt độ ngưng kết 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 0,013 0,273 0,36 0,25 0,171 0,12 0,051 0,032 0,02 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 0,012 0,557 0,4 0,055 0,018 0,006 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 256 128 16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 63 Bảng PL 7: Kết đo A 280 nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau sắc lọc gel cột nhựa Sephacryl S-200 STT A 280 nm Hoạt độ ngưng kết STT A 280 nm Hoạt độ ngưng kết 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,002 0,023 0,018 0,008 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 256 64 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 0,003 0,001 0,001 0,002 0,004 0,006 0,002 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 Bảng PL 8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides Nhiệt độ (0C) 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % 100 100 100 100 50 25 6,25 3,13 1,56 Hoạt độ NKHC HU/ml 28 28 28 28 27 26 24 23 22 Bảng PL 9: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ G eucheumatoides pH Hoạt độ NKHC % HU/ml 100 28 100 28 100 28 100 28 100 28 100 28 100 28 10 100 28 ... Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ rong đỏ Gracilaria eucheumatoides  Mục tiêu nghiên cứu: - Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết, tinh lectin từ rong đỏ G eucheumatoides. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỖ THỊ KIỀU VY NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ GRACILARIA EUCHEUMATOIDES. .. 55CNHH Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học Đề tài: Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ rong đỏ Gracilaria eucheumatoides Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo: Hiện