Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt biển stylissa flexibilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÕ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học) Nha Trang – Năm: 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÕ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học) GVHD: TS LÊ ĐÌNH HÙNG Nha Trang – Năm: 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên: Võ Thị Hảo MSSV: 55134649 Lớp: 55CNHH Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis” Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo: Hiện vật: NHẬN XÉT: KẾT LUẬN: Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ký ghi rõ họ tên) CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc PHIẾU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG ĐỀ TÀI Họ tên sinh viên: Võ Thị Hảo MSSV: 55134649 Lớp: 55CNHH Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis” Số chương: Số trang: Tài liệu tham khảo: Hiện vật: NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Kết luận Điểm phản biện Bằng số Bằng chữ Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017 CÁN BỘ PHẢN BIỆN (Ký ghi rõ họ tên) _ Điểm phản biện Bằng số Bằng chữ Nha Trang, ngày… tháng… năm 2017 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Đình Hùng - Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang CN Đinh Thành Trung người tận tình dìu dắt hướng dẫn suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Nha Trang tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập vừa qua Với vốn kiến thức tiếp thu trình học không tảng cho trình nghiên cứu đồ án tốt nghiệp mà hành trang quý báu để có kinh nghiệm tốt cho đường tới vững tự tin Cảm ơn anh chị Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển - Viện nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang nhiệt tình giúp đỡ trình thực luận văn Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ trình học tập hoàn thiện luận văn Trong trình nghiên cứu, trình làm luận văn tốt nghiệp, trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp của quý thầy cô Luận văn tốt nghiệp thực từ đề tài “Nghiên cứu định hướng sử dụng hemagglutinin từ sinh vật biển” Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tài trợ với mã số: VAST06.04/16-17 Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Võ Thị Hảo LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu của sự bảo của thầy cô hướng dẫn giúp đỡ của tập thể cán nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu kết quả nêu luận văn trung thực chưa công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Chữ ký sinh viên Võ Thị Hảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ viii MỞ ĐẦU .1 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỌT BIỂN .3 1.1.1 Giới thiệu chung bọt biển 1.1.2 Cấu tạo của bọt biển 1.1.3 Phân loại bọt biển 1.1.4 Bọt biển Stylissa flexibilis 1.1.5 Tiềm hoạt tính sinh học từ bọt biển .5 1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 1.2.2 Sự phân bố của lectin sinh giới .7 1.3 LECTIN TỪ BỌT BIỂN 1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ bọt biển nước nước .8 1.3.2 Phân loại lectin từ bọt biển .9 1.3.3 Cấu tạo của lectin từ bọt biển 1.3.4 Một số tính chất lý hóa sinh học của lectin từ bọt biển 10 1.3.5 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN 11 1.4 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN .12 1.4.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin 12 1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .14 2.2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 14 2.2.1 Vật liệu 14 2.2.2 Hóa chất 14 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Quy trình sàng lọc lectin từ động vật bọt biển 16 2.3.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC) .16 2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) 17 2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ BỌT BIỂN S FLEXIBILIS 19 2.4.1 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ bọt biển 19 2.4.2 Xác định điều kiện chiết thích hợp để thu nhận lectin từ bọt biển S flexibilis 20 2.4.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ CaCl2 (mM) ảnh hưởng đến hoạt độ NKHC (TN1) 20 2.4.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) (TN2) 21 2.4.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) (TN3) 22 2.4.4 Tinh bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 23 2.4.5 Tinh bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 .24 2.4.6 Kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 24 2.4.7 Phương pháp khảo xác khả liên kết carbohydrate của lectin từ bọt biển S flexibilis .27 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC LECTIN TỪ BỌT BIỂN .29 3.2 CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾT LECTIN TỪ BỌT BIỂN 30 3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC của lectin có bọt biển S flexibilis .30 3.2.2 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của lectin có bọt biển S flexibilis 31 3.2.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ NKHC của lectin có bọt biển S flexibilis .32 3.3 TINH CHẾ LECTIN .33 3.3.1 Tinh lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 33 3.3.2 Tinh lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 34 3.3.3 Kiểm tra độ tinh xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 34 3.3.4 Kết quả tổng hợp trình tinh lectin từ bọt biển S flexibilis 35 3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN S FLEXIBILIS 37 3.4.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin .37 3.4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin 38 3.4.3 Khả liên kết carbohydrate của lectin .38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 KẾT LUẬN .41 KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DC : dịch chiết HA : hoạt độ ngưng kết hồng cầu HC : hồng cầu HĐR : hoạt độ riêng HĐTS : hoạt độ tổng số NKHC : ngưng kết hồng cầu OD : mật độ quang TBS : Tris Bufer Saline CPKT : Chế phẩm kỹ thuật EDTA : Axit Ethylenediaminetetraacetic SDS-PAGE : Kỹ thuật điện di gel polyacrylamide có sự diện của SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 36 độ NKHC, độ tinh Bảng 3.2 Kết tinh lectin từ bọt biển S flexibilis (40 g) Protein tổng (mg) HĐTS (HU) HĐR (HU/mg) MAC* (µg/HU) Độ tinh (lần) Dịch thô 150,3 3840 25,55 0,039 Dịch sau sắc ký ion 60,5 3200 52,90 0,019 2,05 Dịch sau lọc gel G-200 6,84 480 70,17 0,014 2,79 *MAC (minimum agglutination concentration): nồng độ nhỏ gây NKHC Qua bước tinh sạch, nhận thấy, HĐTS protein tổng số của chế phẩm thu giảm đáng kể từ 3840 HU 150,3 mg xuống 480 HU 6,84 mg tương ứng Điều giải thích sự tổn thất biến tính bất thuận nghịch của số phân tử protein suốt trình tinh Kết quả từ bảng phụ lục bảng phụ lục cho thấy dựa nguyên tắc phân đoạn của sắc ký trao đổi ion DEAE - Sepharose sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 cho phép thu phân tử có protein cao kết quả xác định hoạt độ NKHC phân đoạn, loại bỏ tạp chất protein có kích thước nằm giới hạn hoạt độ NKHC nên HĐR của lectin sau tinh hệ số tinh giai đoạn cao, sắc ký trao đổi ion (HĐR 52,90 HU/ml; hệ số tinh 2,05 lần) sắc ký gel (HĐR 70,17 HU/mg; hệ số tinh 2,79 lần) Kết quả minh chứng rõ hơn, nồng độ protein nhỏ tạo nên đơn vị hoạt độ NKHC giảm dần qua bước tinh sạch: MAC dịch thô 0,039 µg/HU sau qua sắc ký trao đổi ion giảm 0,019 µg/HU sau sắc ký lọc gel giá trị 0,014 µg/HU 37 3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN S FLEXIBILIS 3.4.1 Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin Để khảo sát nhiệt độ của lectin từ bọt biển, lectin xử lý mức nhiệt độ khác từ 20 oC đến 80 oC vòng 30 phút, sau làm lạnh nhanh đá xác định hoạt độ NKHC của lectin với hồng cầu nhóm máu A xử lý enzyme trypsin Kết quả trình bày bảng phụ lục hình 3.7 Hình 3.7 Kết ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ NKHC lectin từ bọt biển S flexibilis Ở nhiệt độ 20 oC HĐTS của lectin đạt giá trị cực đại Khi tăng dần nhiệt độ từ 20 đến 60 oC HĐTS của lectin không thay đổi (256 HU) Nhưng nhiệt độ vượt 60 oC HĐTS bắt đầu giảm dần Ở nhiệt độ 70 oC, HĐTS 16 HU hoàn toàn nhiệt độ tăng đến 80 oC Nguyên nhân nhiệt độ tăng cao làm cấu trúc của lectin thay đổi, đặc biệt cấu trúc trung tâm hoạt động của lectin, làm khả liên kết với gốc đường bề mặt tế bào hồng cầu máu A người, từ làm ảnh hưởng đến khả ngưng kết của lectin 38 3.4.2 Kết ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin Để tìm khoảng pH thích hợp cho hoạt động của lectin từ bọt biển, tiến hành thẩm tích lectin nhiệt độ phòng với loại đệm có pH khác từ đến 10 Sau tiến hành thẩm tích lần với NaCl 0,15M + CaCl2 50 mM để loại bỏ sự ảnh hưởng của pH Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ bọt biển trình bày bảng phụ lục hình 3.8 Hình 3.8 Kết ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ bọt biển S flexibilis Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC của lectin từ bọt biển bị ảnh hưởng sự thay đổi của pH, môi trường axit kiềm Trong môi trường pH = 4, HĐTS lúc 64 (HU) tiếp tục tăng pH từ đến HĐTS ổn định 256 (HU), tiếp tục tăng lên pH pH 10 HĐTS giảm xuống 128 (HU) Chứng tỏ lectin từ bọt biển không bị ảnh hưởng của pH nằm môi trường trung tính từ pH đến pH 3.4.3 Khả liên kết carbohydrate lectin Khảo sát khả liên kết carbohydrate của lectin với số loại đường glycoprotein bằng cách: cho lectin tương tác với đường glycoprotein với nồng độ khác vòng 60 phút Sau đó, tiến hành bổ sung hồng cầu nhóm máu A xử lý enzyme trypsin vào hỗn hợp để đánh giá khả gây ức chế hoạt độ NKHC của lectin Từ đó, tìm giá trị nồng độ nhỏ của đường glycoprotein mà 39 lectin liên kết Giá trị tính theo công thức đề cập tới mục 2.4.7 Bảng 3.3 Nồng độ đường glycoprotein nhỏ có khả ức chế hoạt độ NKHC lectin từ bọt biển Mẫu Đường (100Mm) HI Cmin (mM), (µg/ml) D-glucose - - D-glactose 25 3,125 D-mannose - - N-acetyl-D-glucosamine 26 1,562 25 3,125 - - 29 0,195 Mucin - - Asilo Mucin - - Fetuin - - Asialo Fetuin - - N-acetyl-Dglactosamine N-acetyl-mannose N-acetyl Neuraminic axit Glycoprotein “-“: Đường 100 mM hay glycoprotein 2000 µg/mL khả gây ức chế hoạt độ NKHC lectin “HI”: khả gây ức chế hoạt độ NKHC “Cmin”: nồng độ nhỏ đường (mM) glycoprotein (µg/mL) có khả gây ức chế hoạt độ NKHC Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy, lectin từ bọt biển S flexibilis liên kết với 4/7 loại đường đơn gồm D-glactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-glactosamine, N- 40 acetyl Neuraminic axit mà không liên kết với glycoprotein sử dụng nghiên cứu Trong đó, loại đường có khả ức chế hoàn toàn hoạt độ NKHC của lectin nồng độ khác nhau, đó, D-glactose, N-acetyl-D-glactosaine có khả ức chế hoàn toàn hoạt độ NKHC của lectin nồng độ 3,125 mM, Nacetyl-D-glucosamine nồng độ 1,562 mM N-acetyl Neuraminic axit nồng độ 0,195 mM Theo kết quả nghiên cứu lectin từ bọt biển giới cho thấy, lectin từ bọt biển chủ yếu liên kết với loại đường đơn dẫn xuất của mà liên kết với loại glycoprotein Trong số loại đường đơn, lectin bọt biển luôn nhận diện galactose N-acetyl-D-glactosamine, số ít loại lectin từ bọt biển nhận diện N-acetyl-D-glactosamine mà không nhận diện galactose Còn glycoprotein, lectin từ bọt biển chủ yếu liên kết mạnh với mucin Procine stomach mucin (PSM) loại glycoprotein chứa nhiều galactose N-acetyl-Dglactosamine Do đó, khả liên kết của lectin bọt biển với PSM giải thích khả nhận diện của lectin với N-acetyl-D-glactosamine Chỉ số lectin từ bọt biển có khả liên kết đặc hiệu với PSM lectin CaL từ loài bọt biển Craniella australiensis, Hallilectin-2 -3 từ loài bọt biển Haliclona caerulea 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  KẾT LUẬN Từ kết quả thu qua thí nghiệm của đề tài, xin rút kết luận cho quy trình tách chiết, tinh khảo sát số tính chất của lectin từ bọt biển S flexibilis sau: Các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ bọt biển: - Nồng độ CaCl2 : 20 mM - Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v): 1:1 - Thời gian chiết: Tinh lectin bằng phương sắc ký ion DEAE-Sepharose thu chế phẩm có HĐTS đạt 3200 HU, HĐR đạt 52,90 HU/mg, nồng độ nhỏ gây NKHC 0,019 µg/HU, độ tinh 2,05 lần Tinh bằng phương sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 thu chế phẩm có hoạt độ tổng 480 HU, HTR đạt 70,17 HU/mg, nồng độ nhỏ gây NKHC 0,014 µg/HU, độ tinh 2,79 lần Trọng lượng phân tử lectin chiết tách từ bọt biển S flexibilis điều kiện chất khử 64000 ± 200 Da, ngược lại điều kiện có chất khử 2mercaptoethanol khối lượng phân tử khoảng 32000 ± 200 Da rằng lectin tồn dạng dimer có cầu nối disulfide Nghiên cứu xác định số tính chất lý hóa của lectin từ bọt biển bao gồm: - Lectin bền nhiệt, nhiệt độ hoạt động ổn định của lectin (duy trì 100% hoạt tính sau 30 phút phản ứng) 20 đến 60 oC - Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH đến - Hoạt tính của lecin phụ thuộc vào sự có mặt của cation hóa trị 2: Ca2+ - Lectin có khả liên kết với loại đường D-glactose, N-acetyl-Dglucosamine, N-acetyl-D-glactosamine, N-acetyl-Neuraminic axit mà không liên kết với glycoprotein nồng độ khác là: Fetuin , Asialo- Fetuin, Mucin Asialo mucin  KIẾN NGHỊ Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm sau tinh Nghiên cứu đánh giá số khả kháng khuẩn người vi sinh vật khác Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ bọt biển lĩnh vực y học, nông nghiệp số lĩnh vực khác 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ❖ Tài liệu Tiếng Việt [1] Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, et al Cơ sở công nghệ sinh học_Tập 2: Công nghệ hóa sinh NXB Giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng 2009 [2] Đỗ Ngọc Liên, TT Quỳnh, Tách tinh chế số tính chất của Lectin từ hạt chay A tonkinensis Tạp chí khoa học 1991 (13):20-7 [3] Nguyễn Thị Thịnh, Lê Doãn Diên, Nguyễn Quốc Khang, Phan Huy Bảo Kết quả điều tra Lectin số giống đậu Việt Nam Tạp chí sinh học, 1983 (5):11-8  Tài liệu tiếng anh [4] Allen.NK, Brillantine.L A survey of hemagglutinins in various seeds J Immunol, 1969 (102):1295-9 [5] Balzarini Alpha-(1-3)- and alpha-(1-6)-D-mannose- specific plant lectins are markedly inhibitory to human immunodeficiency virus and cytomegalovirus infections in vitro Antimicrob Agents Chemother 1991 (35)(410) [6] Barondes.SH, Cooper.DN, Gitt.MA, Leffler.H Galectin: Structure and function of a large family of animal lectin J Biol Chem 1994 (269): 20807-10 [7] Funayama.N, Nakatsukasa.M, Kuraku.S, Takechi.K, Dohi.M, Iwabe.N, et al Isolation of Ef silicatein and Ef lectin as molecular markers for sclerocytes and cells involved in innate immunity in the freshwater sponge Ephydatia fluviatilis Zool Sci 2005 (22):1113–22, [8] Goldstein.LJ, Hughes.RC, Monsigny.M, Osawa.T, Sharon.N What should be call a letin? Nature (London) 1980 (285):66 [9] Halina.L, Nathan.S History of lectin: from hemmagglutinin to biological recongnition molecules Glycobiology 2004 (14):53R-62R [10] Hirabayashi.J, Kasai.K The family of metazoan metal-independent betagalactoside-binding lectins: Structure, function and molecular evolution Glycobiology, 1993 (3):297–308 [11] Hung Le Dinh, Ly B.M, Trang Vo Thi Dieu, Ngoc N.T.D., Hoa L.T.H., T P.T.H A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae J Appl Phycol 2012 (24):227-35 43 [12] Hung Le Dinh, T V.T.D., N N.T.D High-manose type N-glycan specific lectins from red marine algae, carragenophytes Biotechnol 2011 (9): 87–98 [13] Ishag.H, Li.C, Huang.L, Sun.M, Wang.F, Ni.B, et al Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo Arch Viro 2013 (158):349–58 [14] Judd.WJ The role of lectin in blood group serology CRC Crit Rev Clin Lab Sci 1980 (12):171-214 [15] Mebs.D, Weiler.I, Heinke.HF Bioactive proteins from marine sponges: Screening of sponge extracts for hemagglutinating, hemolytic, ichthyotoxic and lethal properties and isolation and characterization of hemagglutinins Toxicon 1985 (23):955–62 [16] Müller W.E, Blumbach B, Wagner-Hülsmann.C, Lessel.U Galectins in the phylogenetically oldest metazoa, the sponge (Porifera) Trends Glycosci Glycotechnol 1997 (45):123–40, [17] Ofek.I, Beachey.EH Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli Infect Immun 1987 (22):247–54 [18] Peuman.WJ, V ẸJ The role of lectins in plant defence Histochem J 1995 (27): 253-71 [19] Schröder.H, Ushijima.H, Krasko.A, Gamulin.V, Thakur.V, Diehl-Seifert.D, et al Emergence and disappearance of an immune molecule, an antimicrobial lectin, in basal metazoa A tachylectin-related protein in the sponge Suberites domuncula J Biol Chem 2003 (278): 32810–7 [20] Sharon.N, Lis.H Lectins”, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands 2003 [21] Vasta.G, Ahmed.H, Bianchet.M, Fernández-Robledo.L, A Amzel.J Diversity in recognition of glycans by F-type lectins and galectins: Molecular, structural, and biophysical aspects, Ann N Y Acad Sci 2012 (1253):14-26 [22] B W.C, Almodavar L.R, B L.G Agglutinins in marine algae for human erythrocytes Transfusion (Philadelphia) 1966 (6):82-3 [23] Y Sato, K Morimoto, M Hirayama, K Hori High mannose-specific lectin (KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus infection in a strain-independent manner Biochem Biophys Res Commun 2011 (405): 291–6 44 [24] Ron.JD, Slifkin Methods in enzymology Academic Press 1997 (310):145-51  Tài liệu internet 25 http://vnexpress.net/tin-tuc/khoa-hoc/hai-mien-la-dong-vat-dau-tien-tren-the-gioi2052086.html 26 http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/7377598 27 https://en.wikipedia.org/wiki/Sponge 28 ttp://documents.tips/documents/nganh-than-lo.html 29 http://www.marinespecies.org/porifera/porifera.php?p=taxdetails&id=558522 30 https://en.wikipedia.org/wiki/Sponge#Overview 31 www.thuvienkhoahoc.com 45 PHỤ LỤC Bảng PL Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (μg/ml) Nồng độ BSA (μg/ml) OD750 20 0,050 40 0,099 80 0,202 120 0,291 160 0,395 200 0,499 Bảng PL Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn Trọng lượng phân tử M (Da) Khoảng cách di chuyển vạch protein D (cm) Rf lg M 100000 0,9 0,15 75000 1,2 0,2 4,88 58000 1,5 0,25 4,76 46000 0,33 4,66 32000 2,6 0,43 4,51 25000 3,2 0,52 4,40 22000 3,8 0,62 4,34 17000 4,1 0,67 4,23 11000 4,8 0,79 4,03 46 Bảng PL Kết ảnh hưởng nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC lectin Nồng độ CaCl2 (mM) Hoạt độ NKHC 32 10 64 20 128 30 128 40 128 50 128 Bảng PL Kết ảnh hưởng tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS HĐR lectin Tỷ lệ chiết Thể tích (mL) HĐTS (HU) Protein tổng số (mg) HĐR (HU/mg) 1:01 128 30,4 4,21 1:02 128 51,8 2,47 1:03 96 49,5 1,94 1:04 64 40,8 1,57 Bảng PL Kết ảnh hưởng thời gian chiết đến HĐTS HĐR lectin Thời gian (giờ) Thể tích (mL) HĐTS (HU) Protein tổng số (mg) 2 64 25,9 HĐR (HU/mg) 2,47 64 26,2 2,44 128 27,2 4,71 64 26,4 2,42 10 64 26,9 2,38 47 Bảng PL Kết đo A 280 nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau chạy sắc ký ion DEAE-Sepharose STT A 280 nm Hoạt độ Hoạt độ STT A 280 nm 51 0,012 0,002 52 0,007 1,001 53 0,009 1,83 54 0,007 1,455 55 0,007 1,452 56 0,007 1,399 57 0,006 1,218 58 00,076 0,816 59 0,953 10 0,625 60 1,842 32 11 0,44 61 1,804 32 12 0,254 62 0,589 13 0,165 63 0,267 14 0,131 64 0,178 15 0,124 65 0,141 16 0,114 66 0,117 17 0,113 67 0,104 18 0,102 68 0,092 19 0,095 69 0,084 20 0,086 70 0,076 21 0,076 71 0,071 22 0,068 72 0,068 23 0,06 73 0,062 24 0,055 74 0,056 25 0,053 75 0,054 26 0,05 76 0,05 27 0,042 77 0,049 ngưng kết ngưng kết 48 28 0,04 78 0,043 29 0,038 79 0,041 30 0,037 80 0,04 31 0,036 81 0,038 32 0,035 82 0,036 33 0,032 83 0,033 34 0,03 84 0,031 35 0,028 85 0,03 36 0,027 86 0,029 37 0,026 87 0,028 38 0,025 88 0,027 39 0,024 89 0,026 40 0,023 90 0,025 41 0,02 91 0,024 42 0,01 92 0,022 43 0,009 93 0,021 44 0,009 94 0,02 45 0,008 95 0,016 46 0,008 96 0,014 47 0,008 97 0,011 48 0,008 98 0,01 49 0,018 99 0,008 50 0,012 100 0,006 49 Bảng PL Kết đo A 280 nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau chạy sắc ký lọc gel cột nhựa Sephadex S-200 STT A 280 nm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 0 0 0 0 0 0 0 0,276 0,51 0,596 0,385 0,291 0,187 0,148 0,12 0,097 0,215 Hoạt độ ngưng kết 0 0 0 0 0 0 0 4 2 0 0 STT A 280 nm 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 0,244 0,199 0,125 0,09 0,063 0,047 0,037 0,032 0,025 0,23 0,017 0,016 0,014 0,011 0,009 0,005 0,003 0 0 0 0 Hoạt độ ngưng kết 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 Bảng PL Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ bọt biển S flexibilis Nhiệt độ (0C) Hoạt độ NKHC % 100 100 100 100 100 25 20 30 40 50 60 70 80 HU/mL 27 27 27 27 27 25 Bảng PL Kết ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ bọt S flexibilis pH Hoạt độ NKHC % HU/mL 25 25 25 25 100 27 100 27 100 27 100 27 50 26 10 50 26 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÕ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS. .. tách chiết, tinh lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis 2 - Xác định tính chất hóa lý của lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis  Nội dung nghiên cứu Tách, tinh chế lectin - Nghiên cứu sàng... 55CNHH Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học Đề tài: Nghiên cứu tinh chế đánh giá số đặc tính hóa học lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis Số trang: Số chương: Tài liệu tham khảo: Hiện vật: