phát triển một phương pháp không xâm lấn (non invation) nhằm tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung trên người bệnh việt nam

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: PHÁT TRIỂN MỘT PHƯƠNG PHÁP KHÔNG XÂM LẤN (NON INVATION) NHẰM TIÊN LƯỢNG VÀ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG TRÊN NGƯỜI BỆNH VIỆT NAM Mã số: T2014.09.176 Chủ nhiệm: ThS Trương Kim Phượng Thành viên: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy ThS Lao Đức Thuận Tp Hồ Chí Minh, tháng 11/2015 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 11 PHẦN I.TỔNG QUAN 13 I.1.UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 13 I.1.1.Đặc điểm sinh học ung thư cổ tử cung 13 I.1.2.Một số yếu tố nguy mắc ung thư cổ tử cung 13 I.1.3.Virus HPV 14 I.1.4 Cơ chế xâm nhiễm, gây bệnh ung thư cổ tử cung 14 I.1.5 Phương pháp chẩn đoán ung thư cổ tử cung 17 I.2.TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 20 I.3.TỔNG QUAN EPIGENETICS – SỰ METHYL HÓA DNA 22 I.3.1 Epigenetics 22 I.3.2 Sự methyl hóa DNA 23 I.3.2.2 Đảo CpG 24 I.3.2.3 Họ enzym methyltransferase 24 I.3.2.4 Sự methyl hóa DNA bất thường 25 I.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC GENE DAPK, RARβ, p16INK4a 26 I.4.1 Gene DAPK (Death-Associated Protein Kinase) 26 I.4.2 Gene p16INK4α (CDKN2A, Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) 27 I.4.3 Gene RARβ (Retinoic acid receptor beta) 28 I.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA 30 I.5.1 Phương pháp MSP 30 I.5.2 Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 32 I.5.3 Phương pháp QMSP 32 PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 II.1.VẬT LIỆU 34 II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 II.2.1 Tách chiết DNA 34 Trang i II.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận 35 II.2.3 Thực phản ứng MSP BSP mẫu bệnh phẩm 38 II.2.4 Mồi 40 II.2.5 Phân tích số liệu 41 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 IV.1 KẾT LUẬN 55 IV.2 ĐỀ NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trang ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình I.1 Sự xâm nhiễm tiến trình gây ung thư cổ tử cung virus HPV 16 Hình I.2 Tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ tử vong loại ung thư khác nữ giới Việt Nam (GLOBOCAN 2012, IARC) 21 Hình I.3 Sự methyl hóa cytosine (Bestor, 2000) 24 Hình I.4 Phương pháp MSP 30 Hình I.5 Xử lý sodium bisulfite 31 Hình I.6 Đọc kết MSP 32 Hình III.1 Phân tích đặc điểm methyl hóa vùng promoter gene p16INK4a mẫu bệnh phẩm phương pháp MSP 51 Hình III.2 Giải trình tự sản phẩm MSP methyl gene RARβ 52 Hình III.3 Giải trình tự sản phẩm MSP methyl gene DAPK 53 Hình III.4 Giải trình tự sản phẩm MSP methyl gene p16INK4a 54 Trang iii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng II.1 Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite EpiTect bisulfite Kit 38 Bảng II.2 Thành phần phản ứng PCR phương pháp MSP BSP 39 Bảng II.3 Chu kì nhiệt phản ứng MSP BSP 39 Bảng II.4 Tên trình tự mồi sử dụng 40 Bảng III.1 Tần số methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a khơng nhiễm/nhiễm type lành 40 Bảng III.2 Tần số methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a mẫu dịch phết tế bào âm đạo nhiễm HPV type độc không nhiễm/nhiễm type lành 48 Bảng III.3.Chỉ số OR mức độ methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a với tính chất nhiễm HPV type độc tính chất khơng nhiễm/nhiễm type lành 48 Bảng III.4 Chỉ số RR mức độ methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a với tính chất nhiễm HPV type độc tính chất khơng nhiễm/nhiễm type lành Trang iv 50 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5’UTR 5’ Untranslated Region 3’UTR 3’ Untranslated Region A Adenine C Cytosine G Guanine T Thymine bp Base pair CDKN2A Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A DAPK Death-Associated Protein Kinase RARβ Retinoic acid receptor β pRB Prepro-Retinoblastoma-Associated Protein AC Adenocarcinoma ASC Adenosquamous Carcinoma BSP Bisulfite Sequencing PCR CDKN1B Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1B (p27, Kip1) CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia DNA Deoxyribonucleic Acid DNMT DNA Methyltransferase dNTP Deoxynucleoside Triphosphate ER Receptor Estrogene HBV Hepatitis B virus HGSIL High Grade Squamous Intraepithelial Lesion HPV Human Papilloma virus IARC International Agenecy for Research on Cancer IDT Integrated DNA Technology (công ty IDT) LGSIL Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion M Methylated mRNA Messenger Ribonucleic acid MSP Methylation specific PCR NCBI National Center for Biotechnology Information Trang v PCR Polymerase chain reaction pr Receptor Progesterone qMSP-PCR Quantative MS-PCR Rb Retinoblastoma Protein SCC Squamous cell carcinoma Taq Thermus aquaticus Tm Melting temperature TP53 Tumor protein p53 U Unmethylated UV Ultraviolet WHO World Health Organization Trang vi Mẫu NCKH-09 Thông tin kết nghiên cứu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc _ THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: - Tên đề tài: Phát triển phương pháp không xâm lấn (Non invation) nhằm tiên lượng chuẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung người bệnh Việt Nam - Mã số: T2014.09.176 - Chủ nhiệm đề tài: ThS Trương Kim Phượng - Đơn vị chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ Sinh học - Thời gian thực hiện: từ tháng 06 năm 2014 đến tháng 06 năm 2015 (12 tháng) Mục tiêu: Khảo sát tính chất methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gene DAPK, RARβ p16INK4a, sử dụng mẫu dịch phết tế bào âm đạo người Việt Nam khơng nhiễm HPV và/hoặc nhiễm HPV type lành Tính sáng tạo: Phương pháp khảo sát tính chất methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a người Việt Nam không nhiễm HPV và/hoặc nhiễm type lành, theo hướng không xâm lấn, nhằm tiên lượng chẩn đoán sớm bệnh ung thư cổ tử cung Kết nghiên cứu: Dữ liệu tính chất methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a người Việt Nam không nhiễm HPV và/hoặc nhiễm type lành Dữ liệu phân tích mối tương quan tính chất methyl hóa gene DAPK, RARβ p16INK4a người Việt Nam nhiễm HPV type độc người không nhiễm HPV và/hoặc nhiễm type lành: - Tỷ lệ methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gene DAPK, RARβ p16INK4a 63,6%, 78,8%, 54,5% với độ bao phủ (có ba gene, DAPK, RARβ p16INK4a bị methyl hóa) mẫu khảo sát 97% Trang vii - Chỉ số tỷ số chênh tính chất methyl hóa gene DAPK, RARβ , p16INK4 nhóm mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV type độc (nguy cao) nhóm mẫu khơng nhiễm/nhiễm HPV type nguy thấp 85,75 (95% CI= 10,46 – 702,4, p