Đề tài tìm kiếm, đánh giá, phân lập và sử dụng các gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa và chất lượng tinh bột của hạt gạo thông qua các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen.
Viiện khoa học Bộ khoa học công nghệ việt nam công nghệ Viện Công nghệ Sinh học V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội V.KHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Đề tài Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Trần Bình 6288 25/01/2007 Hà Nội, 2006 Viiện khoa học công nghệ việt nam Bộ khoa học công nghệ Viện Công nghệ Sinh học V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH -V.KHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Đề tài Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc Tăng cờng tính chống chịu cải tiến chất lợng giống lúa công nghệ sinh học thực vật Chủ nhiệm Đề tài: PGS TS Lê Trần Bình Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Cơ quan chủ quản: Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: 2002 - 2005 Hµ Néi, 2006 LLờ ờii ccảảm mơ ơnn Trong khuôn khổ hợp tác song phương khoa học cơng nghệ CHLB Đức Việt Nam lĩnh vực công nghệ sinh học trọng lĩnh vực ưu tiên Tuy nhiên, hầu hết nội dung hợp tác đối tác Việt Nam đối tác Đức bật nội dung nặng chuyển giao công nghệ đào tạo nguồn nhân lực Lần lĩnh vực công nghệ sinh học có đề tài mà hai bên đối tác muốn tập trung khai thác thành tựu giới Giải mã genom lúa nước Đó lý quốc gia Đức, không trồng lúa nước đồng ruộng tự nhiên mà lại quan tâm đến nghiên cứu lúa nước Vì việc xây dựng đề tài đối ứng với Viện đầu ngành sinh học phân tử thực vật Viện Max Planck Sinh lý thực vật phân tử, Golm hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang Đào tạo nghiên cứu, CHLB Đức hỗ trợ hợp tác CƠ QUAN CHỦ TRÌ VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC PHĨ VIỆN TRƯỜNG CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI PGS.TS Trương Nam Hải PGS TS Lê Trần Bình Đề tài hợp tác Việt - Đức i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic axít ADC Arginindecarboxylase APS Ammonium persulfate RNAse RNA polymerase ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine serum albumin Bc Bacillus cereus bp base pair Bt Bacillus thuringiensis CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor cDNA Complementary DNA CHLB Cộng Hoà Liên Bang CGS Cystathionin gamma-Synthase cry Crystal gene = Gen mã hoá protein tinh thể độc tố diệt trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis DNA Deoxyribonucleic axít DAO Diaminoxidase DNAse DNA polymerase EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br Ethidium Bromide FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-TOF-MS Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers GCN Guanidium thiocyanate GUS β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase HSK Homoserine kinase HPLC High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp IRRI International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IPTG Isopropylthio-o-D-galactoside Kb Kilobase KDa Kilo dalton KN&CN Khoa học Công nghệ Km Kanamycine KO Knock out LB Luria Bertani mRNA Messenger RNA MPI Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck Đề tài hợp tác Việt - Đức ii MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog MST Mass Spectral Target = Chất mục tiêu NCS Nghiên cứu sinh NhaA Na+/H+ antiporter NOS-P Nopaline Synthase Promotor nptII Neomycine phosphotransferase phosphotransferase II OAT Ornithine Aminotransferase OD Optical density PA Polyamin PAM Chlorophyll Fluorometers to measuring systems of plant Gas Exchange = Hệ thống đo huỳnh quang diệp lục PAO Polyaminoxidase PCR Polymerase Chain Reaction PGS.TS Phó Giáo sư Tiến sĩ QA, QB Quinon A, Quinon B RNA Ribonucleic axít RT-RT-PCR Real Time-Reverse Trascription-Polymerase Chain Reaction = PCR định lượng SAMDC S-Adenosylmethionin-decarboxylase II gene=Gen mã hoá neomycine SAT Serine acetyltransferase SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis = Điện di biến tính gel polyacrylamide SPD Spermidinsynthase T-DNA Transfer-DNA = DNA chuyển TF Transcription factor = Yếu tố điều khiển phiên mã Ti-plasmit Tumor inducing plasmid = Plasmit gây khối u thực vật Vip Vegetative insecticidal protein = protein sinh dưỡng diệt côn trùng Vir Virulence Region = Vùng gây độc có khả tạo khối u X-gal 5-bromo-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide Đề tài hợp tác Việt - Đức iii MỤC LỤC BÀI TÓM TẮT LỜI MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC ……… 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước ……………………………………………………… 1.2 Tình hình nghiên cứu nước ……………………………………………………… 1.3 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………… 2.1 Đối tượng thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Các giống lúa 2.1.2 Các thiết bị 2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………… … 2.2.1 Tìm kiếm phân lập gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua kỹ thuật ức chế gen RNA …………………………………………………………… 2.2.2 Phát gen điều khiển tính chịu hạn muối phổ phiên mã RNA 10 2.2.3 Kỹ thuật chép gen …………………………………………………………………… 10 2.2.4 Kỹ thuật phân tích phổ chất sắc ký khí/quang phổ khối 11 2.2.5 Tối ưu phương pháp chuyển gen vào số giống lúa Việt Nam 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………………………… 12 2.3.1 Phương pháp sinh lý học thực vật ……………………………………………………… 12 2.3.2 Phươn g pháp sinh học phân tử thực vật ……………………………………………… 18 2.3.3 Phương pháp phân tích ………………………………………………………………… 22 2.3.4 Phương pháp biến nạp gen vào lúa ……………………………………………… 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………………………………… 31 3.1 Vai trò Polyamin tính chịu hạn chịu mặn …………………………… 31 3.1.1 Đánh giá tính chịu mặn ………………………………………… … 31 Đề tài hợp tác Việt - Đức iv 3.1.2 Đánh giá tính chịu hạn ……………………………………………………………… 32 3.1.3 Phân tích polyamin biểu gen ………………………………………………… 35 3.2 Xác định gen điều khiển kiểm sốt tính chịu mặn chịu hạn 39 3.2.1 Thiết lập …………………………………………………………………………………… 39 3.2.2 Xây dựng phương pháp 41 3.2.3 Xử lý hạn 41 3.2.4 Xử lý muối 41 3.2.5 Xây dựng ngân hàng liệu Tác nhân phiên mã lúa 47 3.3 Các chất trao đổi rễ trạng thái ổn định chuyển trạng thái bị xử lý stress 47 3.3.1 Xây dựng phương pháp nuôi trồng chuyển gen lúa giống thuộc loài phụ Indica … 47 3.3.2 Xử lý hạn ………………………………………………………………………………… 47 3.3.3 Xử lý muối ………………………………………………………………………………… 48 3.3.4 Thiết lập ngân hàng chất trao đổi rễ lúa phân tích phổ …… 48 3.3.5 Xác định khối phổ chất chưa biết 49 3.3.6 Xác định phân tích chất thị xử lý mặn 50 3.3.7 Phân tích tương quan xác định chất thị …………………………………… 51 3.3.8 Đề xuất bổ sung 55 3.4 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 55 3.4.1 Chuyển gen tăng cường khả chịu hạn mặn 55 3.4.2 Chuyển gen cải thiện thành phần aminoacid lúa gạo 56 3.4.3 Đề xuất bổ sung 66 CHƯƠNG TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 68 41 Kết khoa học 68 4.2 Kết bất khả áp dụng 70 4.3 Trình độ cơng nghệ 72 4.4 Khả áp dụng 72 4.5 Đào tạo 74 4.6 Sản phẩm khoa học đề tài 75 Đề tài hợp tác Việt - Đức v 4.7 Hợp tác quốc tế 76 4.8 Tình hình sử dụng kinh phí 76 4.9 Danh sách cơng trình cơng bố 77 4.10 Hạn chế đề tài 78 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 5.1 Kết luận 79 5.2 Đề nghị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC ĐỀ TÀI 83 Báo cáo tình hình sử dụng Quyết tốn kinh phí Bản thuyết minh đề cương đề tài Quyết định Bộ trưởng việc phê duyệt nhiệm vụ hợp tác khoa học Công văn gia hạn sử dụng kinh phí đề tài Quyết định thành lập Biên đánh giá Hội đồng nghiệm thu cấp Cơ sở Các báo cáo khoa học đăng tạp chí nước Các báo cáo khoa học đăng tạp chí quốc tế Poster Danh sách gen tìm ngân hàng dịng KO So sánh trình tự gen thiết kế với Genbank Danh sách giống lúa làm nguyên liệu Trang web Ngân hàng liệu tác nhân phiên mã lúa Trang web Viện IRRI - Phân loại khả chống chịu giống lúa theo tiêu chuẩn IRRI Đề tài hợp tác Việt - Đức vi MỤC LỤC BẢNG Bảng 2.1: Các giống lúa sử dụng nghiên cứu đề tài co nguồn gốc từ quốc gia khác nhau, chủ yếu giống Việt Nam Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens ………………………………………………………………… Bảng 3.1: 26 Kết đánh giá tính chịu mặn giống lúa tham gia thí nghiệm tổng hợp theo IRRI điều kiện sử dụng nồng độ muối 100mM NaCl (5,8 g/l), thí nghiệm lần với lần nhắc lại ………………………………………………… Bảng 3.2: 31 Kết đánh giá khả chịu hạn giống lúa Thí nghiệm với lần nhắc lại Nhóm phân theo mức 30% 70% chênh lệch …………… 33 Bảng 3.3: Kết xử lý hạn nhẹ kéo dài xử lý hạn khắc nghiệt ………………………… 53 Bảng 3.4: Kết chọn lọc tái sinh lúa chuyển gen nhaA …………………………… 55 Bảng 3.5: Tiến độ chuyển gen cải thiện chất lượng amino acid gồm Cystathionin gamma-Synthase (CGS), Serinacetyltransferase (SAT), Homoserinkinase (plastid, SSUHSK), Homoserinkinase (cytosolic, HSK) Glucoronidase (GUS) gạo vào lúa …………………………………………………………………… 58 Bảng 3.6: Điều kiện thuỷ phân protein lị vi sóng MAR5 ………………………………… 64 Bảng 4.1: Báo cáo tóm tắt kết thực từ 12/2001 - 12/2005 ……………………… 70 Bảng 4.2: Khả áp dụng đề tài ……………………………………………………………… 72 Bảng 4.3: Danh sách học viên đào tạo …………………………………………………… 74 Bảng 4.4: Danh sách cán nâng cao trình độ ……………………………………… 74 Bảng 4.5: Nội dung hợp tác quốc tế …………………………………………………………………… 76 Bảng 4.6: Tình hình sử dụng kinh phí ………………………………………………………………… 76 Đề tài hợp tác Việt - Đức vii MỤC LỤC HÌNH Hình 2.1: Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp tâm phản ứng hệ quang hóa II ………………………………………… …………………………………………… 14 Hình 2.2: Ngun lý cường độ phát quang ……………………………………………………………… 18 Hình 2.3: Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng ………………………………………… 19 Hình 2.4: Mẫu dị lai …………… ……………………………………………………………………………… 20 Hình 2.5: Mẫu dị thủy phân (TaqMan probe) ………………………………………………………… 20 Hình 2.6: Định lượng (I), xác định đột biến với hybrydzation probes (II), xác định đột biến với TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen thuộc lồi (IV) ………………………………………………………………………………………………… 21 Hình 2.7: Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT 21 Hình 2.8: Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS 22 Hình 2.9: Phân tích protein tổng số 22 Hình 2.10: Sơ đồ bước chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ……… 23 Hình 3.1: Sơ đồ bước chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 32 Hình 3.2: Các giống lúa trồng phytotron 32 Hình 3.3: Lượng nước cây/ ngày 33 Hình 3.4: Sự biến động số nhánh/ cây, chiều dài lá, trọng lượng tươi, khô 34- giống 35 Hình 3.5: Hàm lượng Putresine giống xử lý mặn 35 Hình 3.6: Hàm lượng Spermidine Spermine giống xử lý mặn 36 Hình 3.7: Hàm lượng Putresine, Spermidine Spermine giống xử lý hạn 37 Hình 3.8: Hàm lượng Putresin đo mẫu giống lúa thay đổi chúng xử lý sau 14 ngày với nống độ NaCl tăng dần từ lên 50 100 mM Hình 3.9: Biểu gen Arginindecarboxylase (ADC) giống lúa có mức độ chịu mặn khác …………………………………………………………… Hình 3.10: 38 39 Hiệu hoạt động cắp mồi dùng phản ứng RT-PCR nhân đoạn gen điều khiển RNA tách chiết từ lúa Đề tài hợp tác Việt - Đức 39 viii L-cystathionine tạo sau phản ứng xác định sắc kí lỏng cao áp (Reverse Phase HPLC) Phân tích hoạt tính enzyme Serine acetyltransferase Hoạt tính Serine acetyltransferase xác định dựa tiêu thụ acetyl Coenzyme A bước sóng 232nm Theo phản ứng sau: Hoặc xác định việc đo tạo thành thionitrobenzoic qua phản ứng trao đổi cầu sulfur Coenzyme A tạo sau phản ứng xúc tác serine acetyltransferase 5,5´dithio-bis-(2-nitro-benzoic axit) Phân tích thành phần axit amin tự lúa: Thành phần axit amin tự lúa xác định dựa phản ứng axit amin với O-Phthaldialdehyd nhiệt độ thường Sản phẩm phản ứng xác định sắc kí lỏng cao áp (RP HPLC) O S R1 H H + H2N R1 + HS R2 min; RT + N R2 H2O O mV 25 Emission:450 nm 20 15 14 10 16 13 78 17 18 20 19 21 15 10 11 22 23 12 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, Hình 3.31: Phổ 23 axit amin chuẩn xác định RP HPLC 40, 45, 50, 55, 60, Phân tích thành phần chất mang nhóm thiols lúa Việc phân tích hợp chất chứa nhóm thiols cysteine, glutahione (GSH), homocysteine γGlutamylcysteine dựa phản ứng hợp chất với Monobrombiman (mBrB; 3-Bromomethyl-5ethyl-2,6-dimethyl-pyrazolo[1,2-ỏ]pyrazol-1,7-dion) Sản phẩm tạo thành xác định sắc kí lỏng cao áp (RP HPLC) 21 O O O O N + N HS R 15 min; RT N Dunkelheit N + S Br HBr R Hình 3.32: Phổ hợp chất thiols chuẩn xác định RP HPLC (1=Cystein, 2=γ-Glutamylcystein (γ-EC), 3=Glutathion, 4=Homocystein) Phân tích biểu gen chu trình trao đổi chất methionine dịng chuyển gen: Sự biểu gen (endogenous genes) chu trình trao đổi chất methionine dòng chuyển gen mức độ mã (transcript level) xác định phản ứng RT-RTPCR (Real Time Reverse Transcriptase PCR) Chu trình trao đổi chất methionine gen tham gia minh hoạ Hình 3.33 SO42- Serine Aspartate SO42- SAT S2- OAS Homoserine OPHS Cysteine CγS Cystathionine Lysine Chloroplast TS Threonine CBL Homocysteine SAM SAMS Methionine MS Homocysteine Isoleucine Cytosol Hình 3.33: Chu trình trao đổi chất methionine gen tham gia Hình 3.34: Các mẫu RNA tổng số sau xử lý DNAse, không nhận khuếch đại sau 35 chu kì phản ứng RNA tổng số từ lúa, sau xử lý DNAse để loại bỏ genomic DNA (Hình 3.34) mẫu kiểm tra nhiễm genomic DNA phản ứng RT-RT-PCR với đoạn mồi thiết kế để khuếch đại đoạn intron, dùng mẫu genomic DNA làm đối chứng dương Nếu khơng có nhiễm genomic DNA, mẫu dùng cho phản ứng tổng hợp cDNA việc dùng SuperScript III Reverse Transcriptase hãng Invitrogen Sự biểu gen mức độ mã (transcriptional level) xác định giá trị 2∆Ct ∆Ct = Ct gen quan tâm – Ct gen house-keeping Gen house-keeping dùng trường hợp Actin-1 (LOC_Os01g73310) Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng axit amin tổng số từ hạt số giống lúa Việt Nam: Hạt lúa chín từ giống lúa P1, P4, P6, IR64, TAB1, TAB2, TDH1, TDH2, C71 bóc vỏ, sau nghiền thành dạng bột mịn Cân ~0,5mg bột vào ống thuỷ tinh phân tích Sau tiến hành phản ứng thuỷ phân lị hệ thống lị vi sóng Thành phần axit amin từ mẫu thủy phân phân tích hệ thống sắc kí 22 Bảng 3.6: Điều kiện thuỷ phân protein lị vi sóng MAR5 Điện Thời gian Nhiệt độ Duy trì Bước 600W 100% 5´ 150 0´ Bước 600W 100% 150 30´ Xử lý số liệu: Phổ sắc kí axit amin, hợp chất mang nhóm thiols phân tích thơng qua chương trình Chromeleon version 6.60 (www.dionex.com) Các số liệu phân tích xử lý chương trình Microsoft Excel 2003 (www.microsoft.com) Các đoạn mồi dùng cho phản ứng PCR Real Time RT-PCR thiết kế chương trình Primer Express version 2.0 (www.AppliedBiosystems.com) Xác định thành phần axít amin lúa gạo: Để xác định thành phần axít amin lúa gạo, phương pháp thủy phân protein gạo vi sóng sử dụng Trước tiên, mẫu chuẩn BSA dùng thử Kết thủy phân BSA trình bày Hình 3.38 Hình 3.35: Thành phần axít amin protein chuẩn BSA protein gạo toàn phần A) So sánh thành phần axít amin BSA xác định phương pháp thủy phân vi sóng số liệu công bố tài liệu (biểu đồ màu xanh), B) Protein tổng số gạo so sánh với số liệu cơng bố có trước Nội dung tối ưu hóa gồm hiệu thủy phân, phản ứng tạo dẫn xuất axít amin OPA cuối xác định HPLC BSA protein biết trước thành phần axít amin nên dùng làm chuẩn thích hợp cho việc xây dựng kỹ thuật cải tiến Phần B Hình 3.35 trình bày thành phần axít amin protein tổng số gạo sau thủy phân vi sóng Kết tách chiết protein gạo trình bày Hình 3.36 Hình 3.36: Kết chiết rút protein gạo dịch đệm khác phân tích điện di PAGE (trái) định lượng Bradford (phải) Lượng protein tính µg/ 1mg gạo Để đảm bảo độ tin cậy phương pháp mới, kết so sánh với số liệu tác giả khác cơng bố Có hai vấn đề cịn cần hồn thiện: - Protein lúa gạo có tỷ lệ tái xác định thấp so với protein tinh khiết - Các axít amin Cystein Tryptophan định lượng cách ổn định phương pháp có Vấn đề thứ lý giải: Do hạt gạo chứa nhiều tinh bột có tác động khơng tốt lên hiệu thủy phân làm cho kết xấu Hình 3.36 cho thấy kết tách chiết protein gạo 23 với dịch đệm khác (trái: SDS Gel, phải: định lượng Bradford) Mục đích tách chiết loại bớt tác động xấu protein thủy phân Vấn đề thứ hai cần cải tiến qui trình để định lượng Methionin, Cystein Tryptophan Trong đó, cần lưu ý ơxy hóa axít amin 3.4.3 Đề xuất bổ sung Để cân xác lượng protein phạm vi µg cần phải có thiết bị cân siêu-vilượng đặt bàn-giảm-rung, giá thiết bị cân 16.000 € Ngoài ra, để tăng cường tốc độ phân tích mẫu thiết bị HPLC với giá 60.000 € cần mua thêm * Chuyển gen vào lúa nhằm gia tăng hàm lượng polyamin Một số dòng phân tử cDNA RIKEN Resource Center, Nhật Bản mã hóa cho enzym chu trình sinh tổng hợp phân giải polyamin bao gồm: (1) Arginindecarboxylase – ADC, (2) S-Adenosylmethionin-decarboxylase - SAMDC, (3) Spermidinsynthase – SPD) (4) Diaminoxidase – DAO, (5) Polyaminoxidase – PAO) có nguồn gốc Arabidopsis thaliana Những gen chuyển vào vector pCAMBIA1390-UbiII (Ubiquitin-Promotor) để chuyển vào lúa 24 CHƯƠNG TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC Trong thời gian từ năm 2002 đến 2005, đề tài Hợp tác nghiên cứu khoa học với CHLB Đức thu kết sau: 4.1 KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn chịu mặn Việt Nam nhân lưu giữ Viện Công nghệ sinh học Hồn thiện tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối hạn giống lúa phù hợp với điều kiện Việt Nam Kết xử lý mặn thu giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển, IR57311, Cườm Nước mặn), giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp mặn, Đốc phụng, C71 Cha va) giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua, Taipei Nipponbare) Kết xử lý hạn thu giống chịu hạn tốt (CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh, IR57311, C70, LC-93-1 Nếp mèn), giống chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa mặn, Lốc dâu, K.lua nương) giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom, Songhua, Nipponbare) Kết xử lý mặn cho thấy (i) Giữa nhóm có khác biệt rõ hàm lượng polyamin, (ii) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hẳn, (iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả chịu mặn, (iv) Hàm lượng Putrescine tăng lên xử lý với nồng độ NaCl tăng dần Hoạt động enzym Arginindecarboxylase (ADC) giống mẫn cảm tăng lên rõ rệt Thí nghiệm chuyển gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin tiến hành Để định lượng xác thành phần axít amin gạo, phương pháp thủy phân protein tổng số hạt gạo vi sóng hoàn thiện kết hợp với việc tách chiết hệ dịch đệm khác cho phép hình thành hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân vi sóng, tạo dẫn xuất định lượng với HPLC cho phép phân tích hàm lượng axít amin lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo Xây dựng ngân hàng liệu Tác nhân phiên mã lúa Thông qua việc tra cứu thu thập thông tin gen Ngân hàng liệu đoạn gen Tác nhân phiên mã lúa thức thành lập đưa vào hoạt động từ 01.09.2004 với địa http://ricetfdb.bio.uni-potsdam.de với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa xắp xếp thành 44 họ gen khác Thông qua việc thiết kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đánh giá mức độ biểu đoạn gen điều khiển mạ bị xử lý mặn hai thời điểm Kết cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần kích thích ức chế hai giống nghiên cứu Chàm DR2 có đến 12%, tức 313 gen số 2512 gen coi cảm ứng ức chế mặn Trong số có 19 gen chọn để thiết kế mồi cho việc nhân đoạn gen ngược đầu 5’ từ ba khởi đầu trở lên Kết nhân đoạn DNA 16 gen, có mồi khơng cho kết Hiện nay, đoạn gen nhân đọc trình tự Bước đầu xác định gen cảm ứng mạnh tác động khô hạn muối (Alfin-like-5, Alfin-like-28, AP2-EREBP-43, ARR-B2, C2C2-Dof-5, C2C2-Dof-11) Đã thiết lập ngân hàng chất trao đổi rễ lúa phân tích phổ GC-TOF-MS Ngân hàng liệu khối phổ chất biết chất chưa biết MSTs lưu giữ Ngân hàng khai thác, trao đổi thơng tin trích dẫn công bố qua GMD Web-Site http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/gmd.html Tiến hành phân tích phổ GC-TOF-MS mạ có 132 MSTs xác định, có 109 chất thuộc chất trao đổi sơ cấp Có số chất bị biến đổi thành nhiều dẫn xuất hóa học hóa chất cần thiết dùng cho kỹ thuật GC-MS Tuy vậy, 148 MSTs mạ chưa biết đến Chúng xuất thường xuyên Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum, Lotus japonicus, Lycopersicon spec Việc tìm kiếm chất đặc hiệu rễ lúa ý, ưu tiên việc tìm kiếm 25 chất trao đổi rễ có ý nghĩa thị tính chịu mặn chịu hạn Đã xây dựng tối ưu hóa hệ thống ni cấy mơ tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban đầu hạt lúa chín (thay phơi non khó chủ động) thiết lập 10 Bước đầu thu 15 dòng chuyển gen CGS, dòng trồng, theo dõi hoạt động gen phytotron Hạt giống hệ T1 thu từ trồng phytotron tiếp tục nghiên cứu khác Các gen khác Serinacetyltransferase, Homoserinkinase (plastid) Homoserinkinase (cytosolic) hoàn thiện để chuyển gen nhằm cải thiện thành phần axít amin gạo giống lúa Việt Nam 11 Đối với dòng chuyển gen nhaA giống lúa C71 kết thu 11 dịng dương tính Đối với gen OAT thu dòng dương tính giống lúa DR2 4.2 KẾT QUẢ NỔI BẬT VÀ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG Bảng 4.1: Báo cáo tóm tắt kết thực từ 2002 - 2005 TT Tên sản phẩm Qui trình đánh giá tính chịu mặn, hạn lúa Qui trình chuyển gen vào mơ sẹo hạt lúa chín thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Qui trình qui phạm đánh giá, phân tích chuyển gen phịng thí nghiệm nhà lưới an toàn Số lượng 02 Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật Đạt tiêu chuẩn IRRI Kết đạt Áp dụng có hiệu cao giống lúa điều kiện Việt Nam 01 Hiệu chuyển gen đạt 5-10% Trình độ tiên tiến triển khai phịng thí nghiệm nước 01 Đảm bảo độ xác an tồn sinh học Trên lúa nông nghiệp khác Cấu trúc phù hợp để chuyển vào giống lúa Việt Nam Sử dụng để chuyển gen vào lúa hiệu Sử dụng để chuyển gen vào lúa Có gen nhaA gen OAT Sử dụng để thiết kế gen chịu hạn mặn, tăng cường PA Phân lập thiết kế gen 03 Gen tăng cường tính chịu hạn (OAT) mặn (nhaA) lúa 02 Gen tăng cường hàm lượng axít amin Cystathionine gamma synthase (CGS) 01 Các dịng lúa chuyển gen nhaA OAT 14 Xác định chất phổ trao đổi chất GC/MS 132 Đảm bảo độ xác cao 01 Dữ liệu để cung cấp cho nghiên cứu Sử dụng để sàng lọc đoạn gen quan tâm 2512 Có độ xác cao Trong 2512 vi gồm 44 họ gen, xác định gen cảm ứng mạnh tác động khô hạn muối 10 Thư viện cDNA lúa 11 Ngân hàng liệu gen điều khiển phiên mã (TF) Đã sử dụng chuyển gen thành công vào mô sẹo hạt lúa chín Đã sử dụng chuyển gen thành cơng vào mơ sẹo hạt lúa chín Thế hệ R0 có biểu PCR dương tính hệ R1 (11 dòng mang gen nhaA, dòng mang gen OAT) Sử dụng để tìm kiếm chất trao đổi làm thị tính chịu mặn chịu hạn Đề tài hồn thành tốt hạng mục cơng việc ký thuyết minh đề tài sau: Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn chịu mặn Việt Nam nhân lưu Viện Cơng nghệ sinh học Hồn thiện tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối hạn giống lúa phù hợp với điều kiện Việt Nam Đã xây dựng tối ưu hóa hệ thống ni cấy mơ tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban đầu hạt lúa chín (thay phơi non khó chủ động) thiết lập Đã xây dựng qui trình qui phạm đánh giá chuyển gen phịng thí nghiệm 26 nhà kính an toàn sinh học Thiết kế gen nâng cao tính chịu hạn, mặn gen nâng cao hàm lượng axít amin CGS để chuyển vào lúa Đã thu 11 dòng mang gen nhaA, dòng mang gen OAT 15 dòng mang gen CGS Đã tạo thư viện cDNA lúa từ giống lúa xử lý mặn hạn sử dụng để sàng lọc đoạn gen quan tâm Bước đầu xác định gen cảm ứng mạnh tác động khô hạn muối (Alfin-like-5, Alfin-like-28, AP2-EREBP-43, ARR-B2, C2C2-Dof-5, C2C2-Dof-11) Ngân hàng liệu gen điều khiển phiên mã (TF) bao gồm 2512 vi mang 44 họ gen 4.3 TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ - Lần lĩnh vực cơng nghệ sinh học có đề tài mà hai bên đối tác muốn tập trung khai thác thành tựu giới Giải mã genom lúa nước - Sử dụng trang thiết bị đại, kỹ thuật tiên tiến có độ tin cao để đánh giá giá khả chịu hạn mặn lúa, phương pháp xác định chất phổ trao đổi chất GC/MS xây dựng thư viện cDNA để phục vụ nghiên cứu, tìm kiếm thị liên quan đến tính chống chịu, sàng lọc gen nâng cao hàm lượng axít amin Đây sở tốt để tạo tiền đề cho hướng nghiên cứu nâng cao tính chống chịu tăng cường chất lượng giống trồng - Trình độ cơng nghệ thiết kế gen chuyển gen vào lúa đạt trình độ tương đương quốc tế - Các kết nghiên cứu mà đề tài thu chứng tỏ trình độ cán khoa học nước ta lĩnh vực công nghệ sinh học đại tương đương với nước khu vực giới Các kết thu có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao việc nghiên cứu tính chống chịu cải tiến chất lượng giống trồng công nghệ sinh học thực vật 4.4 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG Bảng 4.2: Khả áp dụng đề tài Tên tiến kỹ Cơ quan tạo TT thuật Qui trình đánh giá tính chịu mặn, hạn lúa Qui trình chuyển gen vào mơ sẹo hạt lúa chín thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Qui trình qui phạm đánh giá, phân tích chuyển gen phịng thí nghiệm nhà lưới an tồn Nơi chuyển giao Hiệu kinh tế Viện Công nghệ sinh học Viện Max Planck – CHLB Đức, Các phịng thí nghiệm quan tâm Phân loại đánh giá nhanh dịng - giống lúa có khả chịu hạn mặn Viện Công nghệ sinh học Viện Max Planck – CHLB Đức, Các phịng thí nghiệm quan tâm Tạo giống trồng chuyển gen Viện Công nghệ sinh học Các phịng thí nghiệm quan tạo giống thử nghiệm trồng chuyển gen An toàn có độ xác cao Sưu tập trình tự gen OAT, nhaA CGS Viện Công nghệ sinh học Viện Max Planck – CHLB Đức Các phòng thí nghiệm quan tâm Gen tăng cường tính chịu hạn (OAT) mặn (nhaA) lúa Viện Công nghệ sinh học Các phịng thí nghiệm quan tâm Sử dụng thiết kế gen cho phù hợp để chuyển vào trồng khác ngồi lúa Tăng cường tính chịu hạn mặn giống trồng Pháp lý cho việc áp dụng Sẽ đăng ký quyền tác giả Sẽ đăng ký quyền tác giả 27 Các dòng lúa chuyển gen nhaA OAT Viện Công nghệ sinh học Các quan tạo giống trồng Gen tăng cường hàm lượng axít amin Cystathionine gamma synthase (CGS) Viện Max Planck – CHLB Đức Viện Công nghệ sinh học Viện Công nghệ Sinh học Ngân hàng liệu gen điều khiển phiên mã (TF) Viện Max Planck – CHLB Đức Viện Cơng nghệ sinh học Các phịng thí nghiệm quan tâm Tạo giống lúa chịu mặn hạn Nâng cao hàm lượng axít amin Cystathionine gamma synthase (CGS) giống lúa Việt Nam Tìm kiếm nhanh sử dụng gen điều khiển phiên mã Sẽ đăng ký quyền tác giả Hợp tác nghị định thư khuôn khổ đề tài Hợp tác nghị định thư khuôn khổ đề tài 4.5 ĐÀO TẠO Bảng 4.3: Danh sách học viên đao tạo TT Năm 20032007 Nguyễn Hữu Cường 20042008 Đỗ Thị Phúc 20022006 20042007 20032004 Họ tên Lê Xuân Đắc Nghiên cứu tăng cường hàm lượng axít amins nhóm sulfur lúa Oryza sativa L Cải tiến chất lượng giống lúa liên quan đến kháng điều kiện stress mơi trường: Vai trị polyamine việc chịu mặn hạn Nghiên cứu chọn tạo giống giống lúa chất lượng cao công nghệ sinh học Tiến sỹ Tiến sỹ Tiến sỹ Nguyễn Phương Thảo Nghiên cứu proteomic lúa chuyển gen Tiến sỹ Nguyễn Hải Yến Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống chuyển gen lúa Cao học Bảng 4.4: Danh sách cán nâng cao trình độ Thời gian Họ tên Nội dung đào tạo TT đào tạo Sử dụng phần mềm BLAST khai thác Ngân hàng liệu gen 4/20031 Lê Xuân Đắc 5/2003 điều khiển phiên mã (TF) Cơ quan Viện Max Planck – CHLB Đức Nguyễn Hồng Châu Sử dụng thiết bị để phân tích phổ trao đổi chất GC/MS xây dựng thư viện cDNA Viện Max Planck – CHLB Đức 2002, 2003, 2004 Lê Trần Bình Trao đổi hợp tác nghiên cứu khoa học đào tạo Viện Max Planck, Đại học tổng hợp Greifswald - CHLB Đức 22/11/2005 Các cán nghiên cứu khoa học thuộc Viện CNSH, Viện KHNN Việt Nam, Viện DTNN (35 người) Bài giảng tập huấn chuyển gen nâng cao hàm lượng axít amin Q trình đồng hóa sulfur thực vật TS Reiner Hoefgen TS Hesse Holger Viện Max Planck – CHLB Đức 4/20035/2003 Bậc đào tạo Tên Luận văn, luận án 4.6 SẢN PHẨM KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Bộ sưu tập giống lúa chịu hạn chịu mặn Việt Nam nhân lưu Viện Công nghệ sinh học: 68 giống Qui trình đánh giá tính chịu mặn, hạn lúa: 02 qui trình Qui trình chuyển gen vào mơ sẹo hạt lúa chín thơng qua vi khuẩn A.tumefaciens: 01 Qui trình qui phạm đánh giá, phân tích chuyển gen PTN nhà lưới an tồn: 01 Trình tự gen OAT, nhaA CGS: trình tự gen 28 Các dòng lúa chuyển gen nhaA, OAT CGS: 27 dòng (11 dòng mang gen nhaA, dòng mang gen OAT 15 dòng mang gen CGS) Thư viện cDNA lúa: 01 thư viện sử dụng để sàng lọc đoạn gen quan tâm Ngân hàng liệu gen điều khiển phiên mã (TF): địa http://ricetfdb.bio.unipotsdam.de với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa xắp xếp thành 44 họ gen khác Ngân hàng liệu khối phổ chất biết chất chưa biết MSTs lưu giữ Ngân hàng khai thác, trao đổi thơng tin trích dẫn công bố qua GMD WebSite http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/gmd.html 10 Đào tạo: 01 cao học, nghiên cứu sinh 11 Đào tạo nâng cao: cán viện Max Planck - CHLB Đức 12 Lớp tập huấn: 01 lớp cho 35 cán khoa học 13 13 Bài báo khoa học: đăng tạp chí nước, đăng tạp chí nước ngồi Poster trình bày hội nghị Quốc tế 4.7 HỢP TÁC QUỐC TẾ Bảng 4.5: Nội dung hợp tác quốc tế TT Cơ quan phối hợp Đại học Tổng hợp Greifswald Viện Max Planck Sinh lý thực vật phân tử EU (Bỉ, Tây Ban Nha, Pháp, Trung Quốc) Đại học tổng hợp Nagoya Nhật Bản Viện Nông lâm nghiệp - Đại học Tổng hợp Tshukuba - Nhật Bản Nội dung phối hợp Đào tạo nghiên cứu sinh Đào tạo nghiên cứu sinh, đào tạo cán khoa học Việt Nam nâng cao trình độ sử dụng phần mềm, thiết bị đại tiên tiến, trao đổi phân tích mẫu nghiên cứu Phối hợp cung cấp gen, vector pCAMBIA1300, pCAMBIA1390/Ubill, cung cấp giống lúa Songhua Đào tạo nghiên cứu sinh Cung cấp giống lúa Nipponbare 4.8 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ Tổng kinh phí SNKH: 800 triệu Tổng kinh phí tốn: 800 triệu 4.9 DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Nguyễn Thị Hồng Châu, Trần Thanh Thu, Michel Jacobs, Ramon Serrano, Emmanuel Guiderdoni, Lê Trần Bình (2004) Đánh giá khả chịu hạn dòng lúa Zhongzua (Japonica) chuyển gen Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 2, sơ 1, tr: 93 - 100 Nguyễn Thị Hồng Châu, Nguyễn Phương Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003) Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens tumefaciens vào giống lúa C71 Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 1, số 2, tr: 219 - 226 Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003) Mối tường quan hàm lượng proline tính chống chịu lúa, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 1, số tr 85 - 94 Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phòng, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003) Nghiên cứu mức độ methyl hóa DNA genom số giống lúa chọn tạo công nghệ tế bào thực vật Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb KH & KT Hà Nội, tr: 923 926 Nguyễn Thị Tâm, Lê Trần Bình (2003) Ảnh hưởng nhiệt độ cao lên hoạt độ α -amylase hàm lượng đường tan hạt nảy mầm số giống dịng lúa chọn lọc từ mơ sẹo chịu nóng, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 1, số tr 101 - 108 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Tỵ, Lê Trần Bình (2003) Đánh giá số đặc điểm hóa sinh dịng lúa chọn lọc có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu nhiệt độ cao Báo cáo Khoa học Hội nghị Công 29 nghệ sinh học toàn quốc 2003 Nxb KH & KT Hà Nội, tr: 958 - 961 Nguyễn Thị Tâm, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2003) Ứng dụng kỹ thuật phân tích đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (RAPD) vào việc đánh giá dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb KH & KT Hà Nội, tr: 1003 - 1007 Frenzel T, Miller A, Engel KH (2002) Metabolite profiling - A Fractionation method for analysis of major and minor compounds in rice grains Cereal Chemistry 79 (2): 215-221 Kopka J, Schauer N, Krueger S, Birkemeyer C, Usadel B, Bergmüller E, Dörmann P, Gibon Y, Stitt M, Willmitzer L, Fernie AR, Steinhauser D (2005) GMD@CSBDB: The Golm Metabolome Database Bioinformatics 21: 1635-1638 10 Sato S, Soga T, Nishioka T, Tomita M (2004) Simultaneous determination of the main metabolites in rice leaves using capillary electrophoresis mass spectrometry and capillary electrophoresis diode array detection Plant Journal 40:151–163 11 Schauer N, Steinhauser D, Strelkov S, Schomburg D, Allison G, Moritz T, Lundgren K, Roessner- Tunali U, Forbes MG, Willmitzer L, Fernie AR, Kopka J (2005) GC-MS libraries for the rapid identification of metabolites in complex biological samples FEBS Letters 579:1332-1337 12 Do PT, Erban A, Scherling C, Drechsel O, Heyer AG, Kopka J, Zuther E (2005) Investigation of polyamine biosynthesis in Indica rice varieties with different levels of salt tolerance 5th International Rice Symposium, Manila, Philippines 13 Zuther E, Drechsel O, Do PT, Erban A, Kopka J, Heyer AG (2004) Characterization of polyamine biosynthesis in different indica varieties of Oryza sativa under salt stress conditions 3rd Plant Genomics European Meeting, Lyon, France 4.10 HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI Giữa hệ thống quản lý Bộ BMBF, Đức Bộ KH&CN, Việt Nam có khác thời gian thực đề tài, MPIMP BMBF cho thực đề tài thời gian năm từ 2002 đến 2007 đề tài đối ứng Viện Công nghệ sinh học Bộ KH&CN cho phép tiến hành từ năm 2002 đến năm 2004 khơng tránh khỏi khâu lệch lớn nhiều nội dung mang tính kế thừa Vì vậy, đề tài phía đối tác Việt Nam phải gia hạn thời gian thực đến năm 2005 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn chịu mặn Việt Nam nhân lưu giữ Viện Cơng nghệ sinh học Hồn thiện tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối hạn giống lúa phù hợp với điều kiện Việt Nam Kết xử lý mặn thu giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển, IR57311, Cườm Nước mặn), giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp mặn, Đốc phụng, C71 Cha va) giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua, Taipei Nipponbare) Kết xử lý hạn thu giống chịu hạn tốt (CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh, IR57311, C70, LC-93-1 Nếp mèn), giống chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa mặn, Lốc dâu, K.lua nương) giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom, Songhua, Nipponbare) Kết xử lý mặn cho thấy (i) Giữa nhóm có khác biệt rõ hàm lượng polyamin, (ii) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hẳn, (iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả chịu mặn, (iv) Hàm lượng Putrescine tăng lên xử lý với nồng độ NaCl tăng dần Hoạt động enzym Arginindecarboxylase (ADC) giống mẫn cảm tăng lên rõ rệt Thí nghiệm chuyển gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin tiến hành Để định lượng xác thành phần axít amin gạo, phương pháp thủy phân protein tổng số hạt gạo vi sóng hồn thiện kết hợp với việc tách chiết hệ dịch đệm khác cho phép hình thành hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân vi sóng, tạo dẫn xuất định lượng với HPLC cho phép phân tích hàm lượng axít amin lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo Xây dựng ngân hàng liệu Tác nhân phiên mã lúa Thông qua việc tra cứu thu thập thông tin gen Ngân hàng liệu đoạn gen Tác nhân phiên mã lúa thức thành lập đưa vào hoạt động từ 01.09.2004 với địa http://ricetfdb.bio.uni-potsdam.de với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa xắp xếp thành 44 họ gen khác Thông qua việc thiết kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đánh giá mức độ biểu đoạn gen điều khiển mạ bị xử lý mặn hai thời điểm Kết cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần kích thích ức chế hai giống nghiên cứu Chàm DR2 có đến 12%, tức 313 gen số 2512 gen coi cảm ứng ức chế mặn Trong số có 19 gen chọn để thiết kế mồi cho việc nhân đoạn gen ngược đầu 5’ từ codon khởi đầu trở lên Kết nhân đoạn DNA 16 gen, có mồi khơng cho kết Hiện nay, đoạn gen nhân đọc trình tự Bước đầu xác định gen cảm ứng mạnh tác động khô hạn muối (Alfin-like-5, Alfin-like-28, AP2-EREBP-43, ARR-B2, C2C2-Dof-5, C2C2-Dof-11) Đã thiết lập ngân hàng chất trao đổi rễ lúa phân tích phổ GC-TOF-MS Ngân hàng liệu khối phổ chất biết chất chưa biết MSTs lưu giữ Ngân hàng khai thác, trao đổi thơng tin trích dẫn công bố qua GMD Web-Site http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/gmd.html Tiến hành phân tích phổ GC-TOF-MS mạ có 132 MSTs xác định, có 109 chất thuộc chất trao đổi sơ cấp Có số chất bị biến đổi thành nhiều dẫn xuất hóa học hóa chất cần thiết dùng cho kỹ thuật GC-MS Tuy vậy, 148 MSTs mạ chưa biết đến Chúng xuất thường xuyên Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum, Lotus japonicus, Lycopersicon spec Việc tìm kiếm chất đặc hiệu rễ lúa ý, ưu tiên việc tìm kiếm chất trao đổi rễ có ý nghĩa thị tính chịu mặn chịu hạn 31 Đã xây dựng tối ưu hóa hệ thống ni cấy mơ tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban đầu hạt lúa chín (thay phơi non khó chủ động) thiết lập 10 Bước đầu thu 15 dòng chuyển gen CGS, dòng trồng, theo dõi hoạt động gen phytotron Hạt giống hệ T1 thu từ trồng phytotron tiếp tục nghiên cứu khác Các gen khác Serinacetyltransferase, Homoserinkinase (plastid) Homoserinkinase (cytosolic) hoàn thiện để chuyển gen nhằm cải thiện thành phần axít amin gạo giống lúa Việt Nam 11 Đối với dòng chuyển gen nhaA giống lúa C71 kết thu 11 dịng dương tính Đối với gen OAT thu dòng dương tính giống lúa DR2 5.2 ĐỀ NGHỊ Giữa hệ thống quản lý Bộ BMBF, Đức Bộ KH&CN, Việt Nam có khác thời gian thực đề tài, MPIMP BMBF cho thực đề tài thời gian năm từ 2002 đến 2007 đề tài đối ứng Viện Công nghệ sinh học Bộ KH&CN cho phép tiến hành từ 2002 đến 2004, khơng tránh khỏi khâu lệch lớn nhiều nội dung mang tính kế thừa Mặc dù thế, thơng qua việc khai thác nguồn tài khác đề tài tận dụng lực lượng cán Việt Nam nhận học bổng 322 gửi làm NCS MPIMP để tham gia thực nhiều nội dung quan trọng đề tài kinh nghiệm thu nhận trước Viện Cơng nghệ sinh học góp phần thúc đẩy tiến độ đề tài Đề nghị có điều chỉnh cơng tác quản lý để có phù hợp tốt thời gian tiến độ bên tiếp tục thực nội dung cịn chưa hồn tất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nước Nguyễn Thị Hồng Châu, Trần Thanh Thu, Michel Jacobs, Ramon Serrano, Emmanuel Guiderdoni, Lê Trần Bình (2004) Đánh giá khả chịu hạn dòng lúa Zhongzua (Japonica) chuyển gen Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 2, sơ 1, tr: 93 - 100 Nguyễn Thị Hồng Châu, Nguyễn Phương Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003) Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens tumefaciens vào giống lúa C71 Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 1, số 2, tr: 219 - 226 Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003) Mối tường quan hàm lượng proline tính chống chịu lúa, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 1, số tr 85 - 94 Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phòng, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003) Nghiên cứu mức độ methyl hóa DNA genom số giống lúa chọn tạo công nghệ tế bào thực vật Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb KH & KT Hà Nội, tr: 923 - 926 Nguyễn Thị Tâm, Lê Trần Bình (2003) Ảnh hưởng nhiệt độ cao lên hoạt độ α -amylase hàm lượng đường tan hạt nảy mầm số giống dịng lúa chọn lọc từ mơ sẹo chịu nóng, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 1, số tr 101 - 108 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Tỵ, Lê Trần Bình (2003) Đánh giá số đặc điểm hóa sinh dịng lúa chọn lọc có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu nhiệt độ cao Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2003 Nxb KH & KT Hà Nội, tr: 958 - 961 Nguyễn Thị Tâm, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2003) Ứng dụng kỹ thuật phân tích đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (RAPD) vào việc đánh giá dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb KH & KT Hà Nội, tr: 1003 - 1007 Quốc tế Ali M.L., Patha M.S., Zhang J., Bai G., Sarkarung S., Nguyen H.T (2000), Mapping QTLs for roots traits in a recombinant inbred population from two indica ecotypes in rice, Theoretical & Applied Genetics 101: 756-766 Baker N R, Bradoury M, Farage P et al (1989) Phyl Trans Roy .Soc London V 323B No 1216 P.295 10 Bjorkman O, Demmeng B (1987) Plant 170 P 489- 504 11 Bouchereau A., Aziz A., Larher F., Martin-Tanguy J (1999), Polyamines and environmental challenges: Recent development, Plant Sci 140: 103-125 12 Butler W L (1978) Annu Rew Plant Physoil 29 P 345-378 13 Czempinski K., Zimmermann S., Ehrhardt T., Muller-roeber B (1997), New structure and function in plant K+ channels: KCO1, an outward rectifier with a steep Ca2+ dependency, EMBO J 16: 2565-2575 14 Demming B, Bjokman O (1987) Plant V 171 N02 P.171 15 Dubey R.S., Singh A.K (1999), Salinity induces accumulation of soluble sugars and alters the activity of sugar metabolizing enzyme in rice plants, Biologia Plantarum 42: 133-239 16 Erdei L., trivedi S., Takeda K., Matsumoto H., (1990), Effects of osmotic and salt stresses on the accumulation of polyamines in leaf segment from wheat varieties differing in salt and drought tolerance, J Plant Physiol 137: 165-168 17 Fiehn C.C., Kopka J., Dormann P., Altmann T., Trethewey R.N., Willmitzer L (2000), Metabolic profiling for plant function genomics, Nature Biotechnology 18: 1157-1161 18 Fiehn O., Kopka J., Trethewey R.N., Willmizez L (2000), Identification of uncommon plant metabolites based on calculation of elemental composition using gas chromatography and quadrupole mass spectrometry, Anal Chem 72: 3573-3580 19 Frenzel T, Miller A, Engel KH (2002) Metabolite profiling - A Fractionation method for analysis of major and minor compounds in rice grains Cereal Chemistry 79 (2): 215-221 20 Fukai S., Cooper M (1995), Development of drought-resistant cultivars using physiomorphological traits in rice, Field Crops Research 40: 67-86 21 Fukai S., Cooper M (1995), Devepment of drought-resistant cultivars using physio-morphological traits in rice, Field Crops res 40: 67-86 33 22 Goicoechea N., Szalai G., Antolin M.C., Sanchez-Diaz M., Paldi E (1998), Influence of arbuscular mycorrhizae and rihzobium on free polyamines and proline levels in water-stresses alfalfa, J Plant Physiol 153: 706-711 23 Gregory J.F (1998), Nutritional properties and significance of vitamin glycosides, Ann Rev Nutr 18: 277-296 24 Gygi S.P., Corthals G.L., Zhang Y., Rochon Y., Aebersold R (2000), Evaluation of two-dimensional gel electrophoresisbased proteome analysis technology, Proc Natl Acad Sci USA 97: 9390-9395 25 Hartje S., Zimmermann S., Klonus D., Mueller-Roeber B (2000), Function characterisation of LKT1, a K+ uptake channel from tomato root hairs and comarison with the closely related potato inwardly rectifying K+ channel SKT1 after expression in Xenopus oocytes, Plnta 210: 723-731 26 Holzwarth A R (1991) In the chlorophyll CRC Handbook Ed H Scheer Bocaration: CRC Press In Press 27 Ita O., Ella E., Kawano A (1999), Physiological basis of submergence tolerance in rainfed lowland rice ecosystems, field Crops Res 64: 75-90 28 Kakkar R.K., Bhaduri S., Rai V K., Kumar S (2000), Amelioration of NaCl stress by arginine in rice seedlings: Changes in endogenous polyamines, Biologia Plantarum 43: 419-422 29 Karapetian N V Bukhov (1986) Physiol Ractenii T.36 N05 P 1013-1026 (Tiếng Nga) 30 Kopka J, Schauer N, Krueger S, Birkemeyer C, Usadel B, Bergmüller E, Dörmann P, Gibon Y, Stitt M, Willmitzer L, Fernie AR, Steinhauser D (2005) GMD@CSBDB: The Golm Metabolome Database Bioinformatics 21: 1635-1638 31 Krause G H, Weis E (1991) Annu Rew Plant Physiol Plant Mol Biol 42 P.313-342 32 Krishnamurthy R., Bhagwat K.A (1989), Polyamines as modulators of salt tolerance in rice cultivars, Plant Physiol 91: 500-504 33 Kumar R.G., Dubey R.S (1999), Glutamine synthetase isoforms from rice seedlings: Effects of stress on enzyme activity and the protective roles of osmolytes, J of Plant Physiol 155: 118-121 34 Lavorel J, Etienne A L (1977) Topic in photosynthesis, ed.J.Baber.2 P 203-268 Amsterdam Elsevier 35 Lee T., Lur H., chu C (1997), Role of abscisic acid in chilling tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedling: II Modulation of free polyamine levels, Plant Sci 126: 1-10 36 Liadskii V V, Gorbunov M Yu, Venediktov P S (1987) Nautnưu daclađư vưsei Skolư Biol Nauki N0 12 trang 96 (Tiếng Nga) 37 Lin C.C., Kao C.H (1996), Proline accumulation is associated with inhibition of rice seedling root growth caused by NaCl, Plant Science 114:121-128 38 Lutts S., Majerus V., Kinet J M (1999), NaCl effects on proline metabolism in rice (Oryza sativa) seedlings, Physiologia Plantarium 105: 450-169 39 Mackill D.L., Nguyen H.T., Zhang J.X (1999), Use of molecular markers in plant improvement programs for rained lowland rice, Field Crops Research 64: 177-185 40 Malkin S, Siderer Y (1974) Biochim Biophys Act V.368 P.442-451 41 Menke U., Muller-Roeber B (2001), RNA fingerprinting of specific plant cell types: Adaptation to plants and optimization of RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR), Plant Mol Biol Rep (in press) 42 Menke U., Renault N., Muller-Roeber B (2001), StGCPRP, a potato gene strongly expressed in stomatal guard cells, defines a novel type of repetitive proline -rich protein, Plant Physiol 122: 677-686 43 Muller-Roeber B., Cognata L., Sonnerwald U., Willmizer L (1994), A truncated version of an ADP-plants, Plant cell 6: 601-612 44 Muller-Roeber B., Ellenberg J., Provart N., Willmitzere L., Busch L., Becker D., Dietrich P., Hoth S., Hedrich R (1995), Cloning and electrophysiological analysis of KST1, an inward-rectifying K+ channel expressed in potato guard cell, EMBO J 14: 2409-2416 45 Murata N, Satoh K (1986) See Ref 47 P.137-159 46 Papagergiou G (1975) In Bioenergetics of photosynthesis.ed Govindiee P 320-366 New York Academic 47 Pareek A., Singla S.L., Grover A (1999), Protein alterations associated with salinity, desisccation, high and low temperature stresses and abscisic acid application in seedling of Pusa 169, a high-yielding rice (Oryza sativa L.) cultiva, 34 Current Science 75: 1023-1035 48 Pere-Molphebalch E., Gidekel M., Segurannieto M., Herrera-Estrella L., Ochoaalejo N (1996), Effects of water stress on plant growth and root proteins in three cultivars of rice (Ozyra sativa L.) with different levels of drought tolerance, Physiologia Plantarum 96: 284-290 49 Prakash J (1996), Rice bran proteins: properties and food uses, Crit Rev Food Sci Nutrit 36 537-552 50 Prakash L., Prathapasenan G (1988), Effect of NaCl salinity and putrescine on shoot growth, tissue ion concentration and yield of rice (Oryza sativa L.), J Agron Crop Sci 160: 325-334 51 Presch G., Kamann E., Muller-Roeber B (2000), Cloning of regulatory sequences mediating guard cell-specific gene expression, Gene 249: 83-89 52 Renger G, Schreiber U (1986) See Ref 47 P.587-619 53 Rossner U., Wagner C., Kopka J., Trethewey R.N., Willmitzer L (2000), Simultaneous analysis of metabolites in potato tube by gas chromatography/mass spectrometry, Plant Journal 23_131-142 54 Roy M., Jain R.K., Wu R (2000), Production of agronomically superior transgenic rice plants using Agrobacterium tumefaciens transformation methods: Present status and future perspectives, Curr Sci 79: 954-960 55 Sato S, Soga T, Nishioka T, Tomita M (2004) Simultaneous determination of the main metabolites in rice leaves using capillary electrophoresis mass spectrometry and capillary electrophoresis diode array detection Plant Journal 40:151– 163 56 Schauer N, Steinhauser D, Strelkov S, Schomburg D, Allison G, Moritz T, Lundgren K, Roessner-Tunali U, Forbes MG, Willmitzer L, Fernie AR, Kopka J (2005) GC-MS libraries for the rapid identification of metabolites in complex biological samples FEBS Letters 579:1332-1337 57 Slocum R.D., kau-Sawhney R., Galston A.W (1984), The physiology and biochemistry of polyamines in plants, Arch Biochem Biophys 235: 283-303 58 Thanh N.D., Zheng H.G., Dong N.V., Trinh L.N., Ali M.L., Nguyen H.T (1999), Genetic variation in root morphology and microsatellite DNA loci in upland rice (Oryza sativa L.) from Vietnam, Uephytica 105: 43-51 59 Turner L.B., Stewart G.R (1986), The effect of water stress upon polyamine levels in barley hordeum-vulgare leaves, J Exp Bot 37: 170-177 60 Tyagi A.K., Mohanty A (2000), Rice transformation for crop improvement and functional genomics, Plant Sci 158: 1-18 61 Van Gorkom H (1986) See Ref 47 P 267-289 62 WadaN., Shinizaki m., Iwamura H (1994), Flower induction by polyamines and related compound in seedlings of morning glory (Pharbitis nil cv Kidachi), Plant Cell Physiol 35: 469-472 63 Wlson C.E., Counce P.A., Keisling T.C., Frizzell D.L (1999), Differentiation between osmotic injury and chloride toxicity of rice seedlings grown under saline conditions, Communications in Soil Science & Plant Analysis 30: 21001-2112 64 Xue W., Pical C., Brearley C., Elge S., Mueller-Roeber B (1999), A plant 126-kDa phosphatidylinositol 4-kinase with a novel repeat structure: cloning and functional expression in Baculovirus-infected insect cells, J Biol Chem 274: 57385745 65 Young N.D., Galstol A.W (1984), Physiological control of arginine decarboxylase activity in K-deficient oat shoots, Plant Physiol 76: 331-35 66 Zhang J.S., Zhou J.M., Zhang C., Chen S.Y (1996), Differential gene expression in salt-tolerant rice mutant and its parental variety, Science in China Series C, Life Sciences 39: 310-319 67 Zheng H.G., BabuR.C., Pathan M.S., Ali L., Huang N., Ciurtois B., Nguyen H.T (2000), Quantitative trait loci for rootpenetration ability and root thickness in rice: Comparison of genetic backgrounds, Genome 43: 53-61 35 ... mẫu Đề tài hợp tác Việt - Đức xi BÀI TĨM TẮT Đề tài ? ?Tăng cường tính chống chịu cải tiến chất lượng giống lúa công nghệ sinh học thực vật? ?? thực phối hợp Viện Công nghệ sinh học, Việt Nam với. .. Max Planck Sinh học phân tử thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Greifswald, CHLB Đức theo hướng nghiên cứu Tăng cường tính chống chịu cải tiến chất lượng giống lúa công nghệ sinh học thực vật Dự án...Viiện khoa học công nghệ việt nam Bộ khoa học công nghệ Viện Công nghệ Sinh học V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH -V.KHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Đề tài Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với