Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) gây ra bởi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã gây thiệt hại kinh tế đáng kể trong nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Nghiên cứu trước cho thấy V. parahaemolyticus kháng với nhiều loại kháng sinh do việc lạm dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II THỬ NGHIỆM IN VITRO ĐỐI VỚI KHÁNG SINH THÍCH HỢP TRONG PHỊNG TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH Nguyễn Diễm Thư1*, Lê Hồng Phước1, Võ Hồng Phượng1, Phạm Võ Ngọc Ánh1, Mã Tú Lan1, Trần Minh Trung1 TÓM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) gây vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây thiệt hại kinh tế đáng kể nghề nuôi tôm Việt Nam Nghiên cứu trước cho thấy V parahaemolyticus kháng với nhiều loại kháng sinh việc lạm dụng thuốc kháng sinh để kiểm sốt bệnh nhiễm khuẩn ni trồng thủy sản Các nghiên cứu nồng độ sử dụng thuốc kháng sinh cho tơm ni phịng trị vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND hạn chế Đồng sông Cửu Long, Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu sàng lọc danh mục kháng sinh thử nghiệm nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu - MIC nồng độ ức chế 50% (IC50) 90% (IC90) V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập từ mẫu tôm bệnh Việt Nam Nghiên cứu thực qua chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND gồm chủng phân lập tôm bệnh AHPND ao nuôi miền Nam chủng tôm bệnh miền Bắc với loại kháng sinh Kết cho thấy nồng độ MIC chủng V parahaemolyticus với Norfloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Ciprofloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Doxycycline 1-32 mg/l, Gentamicin 4-16 mg/l, Tetracycline 1-128 mg/l Oxytetracycline - ≥ 128 mg/l IC50 Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycyclin, Gentamicin Tetracycline 0,32, 0,36, 1,46, 9,33 1,75 µg/ml IC90 0,76, 0,71, 22,80, 11,40 97,92 µg/ml Từ khóa: Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND, kháng sinh, MIC, IC50, IC90, tôm nuôi I ĐẶT VẤN ĐỀ Vibrio parahaemolyticus mang gen độc, tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) hay hội chứng chết sớm (EMS), gây thiệt hại kinh tế đáng kể trang trại nuôi tôm Bệnh thường xảy khoảng ngày sau thả giống, phát triển cách nhanh chóng gây chết nghiêm trọng 20 đến 30 ngày nuôi đầu (Han et al., 2015) Triệu chứng lâm sàng tôm bệnh bao gồm tăng trưởng chậm, ruột rỗng ruột bị đứt đoạn, bơi xoắn ốc, lỏng vỏ, màu sắc nhợt nhạt Tôm bệnh cho thấy dấu hiệu gan bất thường gan teo, nhỏ, gan sưng, màu đen nhạt màu (Lightner et al., 2013; Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015) Tần suất nhiễm bệnh thường xảy nhiều hệ thống ni tơm thâm canh nên thường địi hỏi việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh Sử dụng kháng sinh khơng liều lượng phịng trị bệnh nhiễm khuẩn nuôi trồng thủy sản cho có liên quan dẫn đến kháng thuốc vi khuẩn (Elmahdi et al., 2016) Các nghiên cứu nồng độ sử dụng thuốc kháng sinh cho tôm ni phịng trị vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND cịn hạn chế Đồng sơng Cửu Long, Việt Nam Nghiên cứu sàng lọc danh mục kháng sinh thử nghiệm nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu-MIC nồng độ ức chế 50% (IC50) 90% (IC90) V Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II * Email: thu_seven@yahoo.com 42 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập từ mẫu tôm bệnh Việt Nam làm sở cho nghiên cứu thử nghiệm cho việc phòng trị loại bệnh tôm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Bảy chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND gồm chủng phân lập tôm bệnh AHPND ao nuôi miền Nam chủng tôm bệnh miền Bắc (Bảng 1) chọn để thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu Mẫu lưu trữ glycerol 20% bảo quản -70oC Trung tâm Quan Trắc, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Bảng Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập tôm STT Ký hiệu mẫu Phân lập từ Tỉnh KG11T1 Tôm thẻ Kiên Giang ST8T Tơm sú Sóc Trăng ST11T Tơm sú Sóc Trăng ST13T Tơm thẻ Sóc Trăng CMT14 Tôm thẻ Cà Mau PR15.10 Tôm thẻ Nghệ An PR15.20 Tôm thẻ Nghệ An 2.2 Sàng lọc danh mục kháng sinh thử nghiệm 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch kháng sinh 2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu-MIC (Minimal inhibitory concentration) Pha dung dịch kháng sinh gốc: pha 10ml dung dịch gốc nồng độ 1.280 µg/ml theo cơng thức: X(g) = [10 (ml) x 1.280 (µg/ml) x 100] / a Trong đó: a % hoạt lực kháng sinh Kháng sinh bột pha với dung mơi thích hợp (nước cất dùng pha loại kháng sinh sử dụng nghiên cứu này) Cho lượng dung môi vừa đủ để hịa tan hồn tồn kháng sinh, bồi phụ đủ thể tích dung mơi hồ tan Từ dung dịch gốc pha lỗng ½ đến nồng độ thấp cần dùng 2,5 µg/ml (10 nồng độ pha lỗng 1.280 µg/ml, 640 µg/ml, 320 µg/ml, 160 µg/ml, 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml, µg/ ml, 2,5 µg/ml). MIC xác định theo quy trình có thay đổi Ruangpan (2004) cách pha loãng thuốc kháng sinh môi trường đĩa thạch với loại kháng sinh chọn Giá trị MIC xác định nồng độ thấp thuốc kháng sinh, khơng có phát triển vi khuẩn (Ruangpan, 2004) Các bước tiến hành sau: Đĩa thạch Mueller-Hinton Agar chuẩn bị theo hướng dẫn hãng sản xuất, có bổ sung 2% muối hịa tan vào mơi trường nước cất. Đun sơi để hồ tan hồn tồn thạch hấp tiệt trùng 120oC/15 phút, để nguội môi trường tới 50oC Sau đó, cho vào đĩa petri ml thạch 1ml dung dịch kháng sinh cần dùng (10 nồng Căn vào đặc tính sinh học chế gây bệnh tác nhân gây bệnh; vào chất hóa học kháng sinh; kết hợp với kết nghiên cứu trước; điều tra bổ sung nghiên cứu sử dụng loại kháng sinh, mức độ kháng, hiệu quả,…trong nuôi tôm Tiến hành chọn loại kháng sinh có tỉ lệ nhạy cao mẫu V parahaemolyticus phân lập từ miền để thử nồng độ ức chế tối thiểu làm sở cho việc chọn liều thử nghiệm tôm 2.3.2 Chuẩn bị đĩa thạch kháng sinh TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 43 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II độ kháng sinh pha trên, nồng độ đĩa) lắc Các đĩa thạch dùng ngày Đánh dấu phía phía đĩa thạch để tránh nhầm lẫn số thứ tự chủng đọc kết quả. Hai đĩa môi trường MHA khơng có kháng sinh chuẩn bị để làm chứng dương 2.3.3 Chuẩn bị chủng vi khuẩn pha hỗn dịch vi khuẩn chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chọn làm thử nghiệm cấy vào môi trường thạch dinh dưỡng (BHIA), ủ 18-24 30oC để tạo khuẩn lạc riêng rẽ Các khuẩn lạc hòa tan vào 10 ml nước muối 2% vô trùng đến đạt nồng độ 108 vi khuẩn/ml (độ đục huyền dịch vi khuẩn tương ứng với độ đục chuẩn 0,5 McFarland). Pha loãng 100 lần huyền dịch vi khuẩn để huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn/ml 2.3.4 Tiến hành Hút 10 µl huyền dịch vi khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn/ml cho vào vị trí giếng/ vịng trịn (nhỏ giọt) đĩa thạch MHA với 10 nồng độ kháng sinh khác (từ nồng độ thấp đến nồng độ cao), nồng độ lặp lại lần Hai đĩa môi trường MHA kháng sinh cho 10 µl huyền dịch vi khuẩn để làm chứng dương Sau để đĩa thạch nhiệt độ phịng khơ, lộn IC50 = 2.3.5. Đọc phân tích kết Trước tiên kiểm tra phát triển chủng vi khuẩn thử nghiệm đĩa thạch đối chứng kháng sinh Nếu chủng đảm bảo mọc tốt tiếp tục đọc kết chủng thử nghiệm Nếu chủng vi khuẩn khơng mọc tiến hành làm lại thí nghiệm Đọc kết từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp đến nồng độ cao nhất. Nồng độ MIC xác định đĩa mơi trường mà vi khuẩn bị ức chế phát triển (mật độ vi khuẩn giảm hẳn 1-2 khuẩn lạc mọc) Kết MIC chủng với kháng sinh ghi nhận lại. Ở nồng độ thấp nhất, khơng có vi khuẩn mọc kết ghi nhận là: nhỏ nồng độ (≤) Trong trường hợp đến nồng độ cao mà thấy vi khuẩn mọc kết ghi nhận lớn nồng độ (≥) 2.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) 90% (IC90) Sau xác định giá trị MIC, IC50 IC90 tính toán để xác định liều lượng kháng sinh thử nghiệm điều trị bệnh động vật nhằm tìm loại kháng sinh điều trị bệnh hiệu IC50 IC90 tính tốn theo cơng thức sau (Ruangpan, 2004): A+B , A= 50 x nồng độ MIC gần chủng vi khuẩn bị ức chế thấp 50% tỉ lệ % gần thấp 50% B= 50 x nồng độ MIC gần chủng vi khuẩn bị ức chế cao 50% tỉ lệ % gần cao 50% IC90 = 44 ngược đĩa ủ 300C vòng 18-24 C+D , C= 90 x nồng độ MIC gần chủng vi khuẩn bị ức chế thấp 90% tỉ lệ % gần thấp 90% D= 90 x nồng độ MIC gần chủng vi khuẩn bị ức chế cao 90% tỉ lệ % gần cao 90% TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 2.5 Phương pháp phân tích số liệu (thơng tư 10/2016/TT-BNNPTNT) Tuy nhiên, loại kháng sinh sử dụng phổ biến ao nuôi nên chọn cho thử nghiệm Dữ liệu nhập phân tích thống kê phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu-MIC 3.1 Kết sàng lọc danh mục kháng sinh thử nghiệm Kết cho thấy nồng độ MIC chủng V parahaemolyticus với Norfloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Ciprofloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Doxycycline 1-32 mg/l, Gentamicin 4-16 mg/l, Tetracycline 1-128 mg/l Oxytetracycline - ≥ 128 mg/l (Bảng 2) Nghiên cứu trước cho thấy kết MIC V parahaemolyticus phân lập tôm nuôi Thái Lan với Gentamicin < 1-2 mg/l Oxytetracycline < 0,5-64 mg/l (Yano et al., 2014) Kết Vaseeharan et al., (2005) cho thấy tất chủng V parahaemolyticus phân lập từ ao nuôi tôm kháng với oxytetracycline, với MIC dao động từ 32,5-88,6 mg/l Căn vào kết thử kháng sinh đồ 47 mẫu V parahaemolyticus phân lập năm 2015 (Báo cáo tổng kết đề tài, 2015) Năm loại kháng sinh chọn có tỉ lệ nhạy cao mẫu V parahaemolyticus phân lập Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycycline, Gentamicin Tetracyline Oxytetracycline loại kháng sinh người nuôi sử dụng phổ biến (qua điều tra thực tế), lựa chọn cho thử nghiệm Sáu loại kháng sinh dùng để thử nồng độ ức chế tối thiểu làm sở cho việc chọn liều thử nghiệm tôm Norfloxacin và Ciprofloxacine bị cấm sử dụng nuôi trồng thủy sản từ tháng 10/2016 Bảng Nồng độ ức chế tối thiểu chủng V parahaemolyticus với loại kháng sinh Số chủng vi khuẩn với MIC (mg/l) Số chủng vi khuẩn ≤ 0,25 0,5 Norfloxacin 2 Ciprofloxacin Doxycycline Gentamicin Tetracycline Oxytetracycline Kháng sinh 3.3 Kết xác định nồng độ ức chế IC50 IC90 Dựa kết MIC, IC50 IC90 loại kháng sinh với chủng V parahaemolyticus trình bày qua Bảng IC50 Norfloxacin có giá trị thấp 0,32 µg/ml Gentamicin có giá trị cao 9,33 µg/ml IC90 Ciprofloxacin có giá trị thấp 0,71 µg/ 1 16 32 1 64 ≥ 128 1 2 ml Tetracycline có giá trị cao 97,92 µg/ ml Chưa xác định liều IC50 IC90 Oxytetracycline với 10 nồng độ kháng sinh thử nghiệm Dung ctv., (2010) báo cáo giá trị IC50 IC90 Gentamicin vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra µg/ml TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 45 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng IC50 IC90 loại kháng sinh với chủng V parahaemolyticus MIC (µg/ ml) Norfloxacin % chủng vi khuẩn bị ức chế Ciprofloxacin Doxycyclin Gentamicin Tetracycline Oxytetracycline 0,25 42,86 28,57 0 0 0,5 71,43 85,71 0 0 100 100 42,86 28,57 57,14 100 100 57,14 57,14 57,14 100 100 71,43 14,29 57,14 57,14 100 100 71,43 85,71 57,14 57,14 16 100 100 85,71 100 57,14 57,14 32 100 100 100 100 71,43 57,14 64 100 100 100 100 71,43 71,43 128 100 100 100 100 100 71,43 IC50 0,32 0,36 1,46 9,33 1,75 x IC90 0,77 0,71 22,80 11,40 97,92 x Ghi chú: x = khơng tính IV KẾT LUẬN Nồng độ MIC chủng V parahaemolyticus với Norfloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Ciprofloxacin ≤ 0,25-1 mg/l, Doxycycline 1-32 mg/l, Gentamicin 4-16 mg/l, Tetracycline 1-128 mg/l Oxytetracycline - ≥ 128 mg/l IC50 Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycyclin, Gentamicin Tetracycline 0,32, 0,36, 1,46, 9,33 1,75 µg/ml IC90 0,76, 0,71, 22,80, 11,40 97,92 µg/ml TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Hồng Phước, Nguyễn Diễm Thư, Nguyễn Văn Hảo, Cao Thành Trung, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Hồng Lộc, Đoàn Văn Cường, 2015 Nghiên cứu quy trình sử dụng kháng sinh hợp lý phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm ni nước lợ Việt Nam Báo cáo tổng kết năm 2015 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, 43 trang 46 Tài liệu tiếng Anh Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 24th informational supplement Approved standard M100-S24 Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 226 pp Dung, T T., Haesebrouck, F., Tuấn, N A., & Sorgeloos, P., 2010 Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan, thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Đồng sơng Cửu Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 15, 162-171 Elmahdi, S., DaSilva, L V., & Parveen, S., 2016 Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in various countries: A review Food microbiology, 57, 128-134 Han, J E., Tang, K F., Tran, L H., & Lightner, D V., 2015 Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II shrimp Diseases of aquatic organisms, 113(1), 33-40 Lightner D.V., Redman C.R., Pantoja B.L., Noble L.M., Nunan, Loc Tran, 2013 Documentation of an Emerging Disease (Early Mortality Syndrome) in SE Asia & Mexico OIE Reference Laboratory for Shrimp Diseases, Department of Veterinary Science & Microbiology, School of Animal and Comparative Biomedical Sciences Ruangpan, L., 2004 Minimal inhibitory concentration (MIC) test and determination of antimicrobial resistant bacteria In Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment (pp 31-55) Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center Vaseeharan, B., Ramasamy, P., Murugan, T and Chen, J.C., 2005 In vitro susceptibility of antibiotics against Vibrio spp and Aeromonas spp isolated from Penaeus monodon hatcheries and ponds International journal of antimicrobial agents, 26(4), pp.285-291 Yano, Y., Hamano, K., Satomi, M., Tsutsui, I., Ban, M and Aue-Umneoy, D., 2014 Prevalence and antimicrobial susceptibility of Vibrio species related to food safety isolated from shrimp cultured at inland ponds in Thailand Food control, 38, pp.30-36 Zorriehzahra, M J., & Banaederakhshan, R., 2015 Early mortality syndrome (EMS) as new emerging threat in shrimp industry Adv Anim Vet Sci, 3(2s), 64-72 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 47 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II IN VITRO TRIALS OF ANTIBIOTICS ON THE ABILITY TO INHIBIT ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE PATHOGEN Nguyen Diem Thu1*, Le Hong Phuoc1, Vo Hong Phuong1, Pham Vo Ngoc Anh1, Ma Tu Lan1, Tran Minh Trung1 ABSTRACT Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus has resulted in significant economic losses in shrimp production in Vietnam Previous studies reported that V parahaemolyticus showed multiple-antibiotic resistance due to the misuse of antibiotics to control pathogenic infections in aquaculture There is a lack of information on the doses of antibiotic usage for shrimp farmers in prevention of V parahaemolyticus in the Mekong Delta, Vietnam This study aimed to select the effective antibiotics by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and inhibitory concentrations at 50% (IC50) and inhibitory concentrations at 90% (IC90) of AHPND pathogenic V parahaemolyticus isolates from AHPND shrimp samples in Vietnam The study was carried out on strains of AHPND pathogenic V parahaemolyticus, including trains from the South and strains from the North of Vietnam, using different antibiotics The results showed that MIC values of these strains were ≤ 0,25-1 mg/l for Norfloxacin, ≤ 0,25-1 mg/l for Ciprofloxacin, 1-32 mg/l for Doxycycline, 4-16 mg/l for Gentamicin, 1-128 mg/l for Tetracycline and - ≥ 128 mg/l for Oxytetracycline IC50 values of Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycycline, Gentamicin and Tetracycline were 0.32; 0.36; 1.46; 9.33 and 1.75 µg/ml, respectively IC90 values were 0.76; 0.71; 22.80; 11.40 and 97.92 µg/ml, respectively Keywords: AHPND pathogenic Vibrio parahaemolyticus, antibiotics, MIC, IC50, IC90, farmed shrimp Người phản biện: TS Lý Thị Thanh Loan Ngày nhận bài: 26/11/2017 Ngày thông qua phản biện: 15/12/2017 Ngày duyệt đăng: 18/12/2017 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No.2 * Email: thu_seven@yahoo.com 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 ... a Trong đó: a % hoạt lực kháng sinh ? ?Kháng sinh bột pha với dung mơi thích hợp (nước cất dùng pha loại kháng sinh sử dụng nghiên cứu này) Cho lượng dung mơi vừa đủ để hịa tan hồn tồn kháng sinh, ... Norfloxacin, Ciprofloxacin, Doxycycline, Gentamicin Tetracyline Oxytetracycline loại kháng sinh người nuôi sử dụng phổ biến (qua điều tra thực tế), lựa chọn cho thử nghiệm Sáu loại kháng sinh dùng... parahaemolyticus với loại kháng sinh Số chủng vi khuẩn với MIC (mg/l) Số chủng vi khuẩn ≤ 0,25 0,5 Norfloxacin 2 Ciprofloxacin Doxycycline Gentamicin Tetracycline Oxytetracycline Kháng sinh 3.3 Kết