Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả ức chế Vibrio parahaemolyticus và phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của Cinnamaldehye trong điều kiện in vivo và in vitro. Ở môi trường thạch, Cinnamaldehyde được bổ sung vào thạch Tryptic Soya Agar (TSA) với các nồng độ 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 và 150 ppm.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ẢNH HƯỞNG CỦA CINNAMALDEHYDE TRONG PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH Ở TƠM THẺ CHÂN TRẮNG Lê Hồng Phước1*, Bùi Linh Tâm2, Cao Thành Trung1, Đồn Văn Cường1 TĨM TẮT Nghiên cứu thực nhằm đánh giá hiệu ức chế Vibrio parahaemolyticus phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Cinnamaldehye điều kiện in vivo in vitro Ở môi trường thạch, Cinnamaldehyde bổ sung vào thạch Tryptic Soya Agar (TSA) với nồng độ 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 150 ppm Một lượng V parahaemolyticus cấy trải đĩa thạch ủ 30oC 24 Kết cho thấy nồng độ 150 ppm Cinnamaldehyde ức chế hoàn tồn V parahaemolyticus mọc đĩa thạch Ở mơi trường canh dinh dưỡng, Cinnamaldehyde sử dụng với nồng độ 40, 50, 60, 70, 80 90 ppm Nồng độ 40 ppm ức chế V parahaemolyticus sau tiếp xúc Bổ sung 15ppm Cinnamaldehyde nước ni gây chết 100% tơm thí nghiệm sau Thí nghiệm gây nhiễm với có mặt Cinnamaldehyde chưa cho thấy hiệu rõ chất phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Từ khóa: Cinnamaldehyde, tôm thẻ chân trắng, Vibrio parahaemolyticus I ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ năm 2010 bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease: AHPND) diễn biến phức tạp gây thiệt hại lớn cho người nuôi Ở Trung Quốc AHPND xuất vào năm 2009 chưa người nuôi ý đến Đến năm 2011 bệnh trở nên trầm trọng trang trại nuôi năm gần biển (Panakorn, 2012) Các trang trại nuôi tôm Hainan, Guangdong, Fujian Guangxi bị thiệt hại tháng đầu năm 2011 với khoảng 80% Ở Malaysia, AHPND báo cáo vào cuối năm 2010 bang Pahang Joho sau lan rộng sang vùng khác làm giảm sản lượng tôm thẻ chân trắng từ 87.000 năm 2010 xuống 67.000 năm 2011, sản lượng đến tháng 5/2012 25.000 Năm 2014 AHPND xuất tỉnh phía đơng vịnh Thái Lan Bệnh ghi nhận gây thiệt hại nặng tôm sú tôm thẻ chân trắng với tỷ lệ chết cao Tơm bị nhiễm bệnh suốt q trình ni, tập trung nhiều giai đoạn 10-45 ngày thả nuôi (Flegel., 2012; Lightner, 2012; Prachumwat ctv., 2012) Tơm bệnh có dấu hiệu giảm ăn, dấu hiệu bệnh lý giai đoạn đầu thường không rõ biểu sưng, nhũn hay nhạt màu gan tuỵ Giai đoạn sau biểu rõ teo, dai gan tuỵ, màu sắc nhợt nhạt, dấu hiệu khác ghi nhận bao gồm mềm vỏ, sậm màu Tỷ lệ tơm chết lên đến 100% vài ngày kéo dài Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh * Email: lehongphuoc@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 65 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Theo Loc Tran ctv., (2013) bệnh hoại tử gan tụy cấp tính vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, có Vibrio parahaemolyticus phân lập từ dày tôm bệnh gây bệnh thực nghiệm cho tỷ lệ chết dấu hiệu bệnh lý AHPND xuất tự nhiên Trong 11 tháng đầu năm 2015 nước ta bệnh hoại tử gan tụy cấp tính xảy 29 xã, 76 huyện, thị xã thuộc 22 tỉnh/thành phố Tổng diện tích bị thiệt hại 9.103,43 So sánh kỳ năm 2014 số diện tích tơm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tăng Đối với bệnh truyền nhiễm vi khuẩn sử dụng kháng sinh để trị bệnh Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh mang lại nhiều hậu chủ yếu kháng kháng sinh dư lượng kháng sinh tồn tôm làm ảnh hưởng đến xuất sức khỏe người tiêu thụ Vì việc nghiên cứu chất thay kháng sinh phòng bệnh vi khuẩn cần thiết nuôi trồng thủy sản Các nghiên cứu gần cho thấy Cinnamaldehyde dạng hương liệu tổng hợp không gây độc thường sử dụng sản xuất nước giải khát, kẹo cao su, nước hoa thức ăn (Adams, 2004) Hợp chất có hoạt tính tương tự brominated furanones thiophenones Chúng tham gia vào việc bẻ gãy phân tử tín hiệu quorum sensing vi khuẩn Đây cách tiếp cận phòng bệnh vi khuẩn Trong nghiên cứu thử nghiệm hiệu Cinnamaldehyde phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính điều kiện in vivo in vitro Ảnh hưởng Cinnamaldehyde lên phát triển nấm Candida albicans nghiên cứu nhóm tác giả Taguchi ctv., (2013) Ở nồng độ 40 μg/ml chất có khả ức chế hồn tồn phát triển Candida albicans Cinnamaldehyde eugenol được Suppakul ctv., (2012) kiểm tra tính kháng khuẩn vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn làm hỏng thức ăn Nhóm tác giả tìm nồng độ 50 µl/ml hai chất 66 tính kháng khuẩn chủng thí nghiệm Cinnamaldehyde, Sporan với acid acetic Yossa ctv., (2012) thử tính kháng khuẩn Escherichia coli O157:H7 Salmonella môi trường lỏng LuriaBertani chứa Cinnamaldehyde Sporan riêng lẻ hay phối hợp với acetic acid Ở nồng độ 800 ppm cinnamaldehyde ức chế hoàn toàn E coli O157:H7 Salmonella II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Chủng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính phân lập từ mẫu tơm bệnh thu tỉnh Sóc Trăng vào tháng 07/2015 - Tôm thẻ chân trắng cỡ 1-2g dùng cho thí nghiệm - Mơi trường ni cấy tăng sinh vi khuẩn cho thí nghiệm: TSA (Tryptic Soya Agar), NB (Nutrient Broth) thiết bị nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn (tủ cấy vô trùng, tủ ấm, ly tâm lạnh…) - Các thiết bị dụng cụ dùng cho thí nghiệm tơm: bể kính, bể composite, máy sục khí,… - Cinnamaldehyde (Sigma, code 101492477) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp kiểm tra khả ức chế Vibrio parahaemolyticus phát triển môi trường thạch lỏng Chuẩn bị môi trường thạch lỏng với nồng độ khác Cinnamaldehyde (chi tiết phần bố trí thí nghiệm) Đối với mơi trường thạch, tiến hành cấy đĩa thạch 100 µl dịch huyền phù vi khuẩn với mật độ xác định, ủ đĩa thạch 30oC đếm khuẩn lạc sau 24h Đối với môi trường lỏng sau khuẩn bị môi trường với nồng độ Cinnamaldehyde khác tiến hành cấy V parahaemolyticus vào với mật nghiệm thức, ủ 30oC tủ ấm lắc 150 vòng/phút Tiến hành thu mẫu sau điểm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II thời gian khác để đánh giá ảnh hưởng Cinnamaldehyde lên V parahaemolyticus 2.2.2 Chuẩn bị vi khuẩn gây nhiễm Vibrio parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính dùng cho thí nghiệm gây nhiễm Vi khuẩn giữ giống 20% glycerol giữ -80oC sau cấy môi trường Thiosulfate Citrate Bile Succrose Agar (TCBS) ủ 28oC 24 Khuẩn lạc đơn chuyển sang môi trường Nutrient Broth + 2% NaCl tăng sinh qua đêm 28oC với tốc độ lắc 150 vòng/phút Vi khuẩn sau tăng sinh chuyển sang ống ly tâm ly tâm tốc độ 2.200 g 15 phút, bỏ dịch nổi, rửa cặn lần với nước muối sinh lý vô trùng Mật độ vi khuẩn xác định cách đo mật độ quang sau tính OD =1 tương ứng với 1,2 x 109 CFU/ml (việc tính tốn mật độ vi khuẩn dựa mật độ quang có so sánh với kết thu mẫu cấy trực tiếp đếm lượng khuẩn lạc mọc đĩa thạch) 2.2.3 Thí nghiệm gây nhiễm Nước biển ni tơm có độ mặn 20 gL-1 xử lý với 30 mgL-1 chlorine ngày với sục khí mạnh sau trung hịa Na2S2O3 để loại trừ dư lượng chlorine Tùy theo mục đích thí nghiệm, sau tơm ni nghiệm thức khác tiến hành gây nhiễm với V parahaemolyticus để đánh giá khả phòng trị loại chế phẩm sử dụng Tôm gây nhiễm phương pháp ngâm với 106 CFU/ml V parahaemolyticus Sau gây nhiễm tiến hành theo dõi ghi nhận tượng tơm chết vịng 70-10 ngày để đánh giá hiệu hợp chất thử nghiệm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Tơm chết loại khỏi bể nuôi kịp thời để tránh trường hợp tôm chết lâu làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước Mẫu tôm chết thu (6 con/nghiệm thức) để tái phân lập V parahaemolyticus kiểm tra phương pháp PCR theo quy trình Han ctv., (2015) để đảm bảo tôm chết V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy 2.2.4 Phương pháp phân tích số liệu Số liệu tổng hợp phần mềm Excel xử lý phần mềm SPSS (Version16) 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Cinnamaldehyde lên phát triển V parahaemolyticus mơi trường thạch Mục đích thí nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng Cinamaldehye đến ức chế phát triển V parahaemolyticus môi trường thạch Chuẩn bị Cinnamaldehyde với nồng độ 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 150 ppm môi trường thạch TSA Tạo dịch huyền phù vi khuẩn cho có mật độ vi khuẩn khoảng 103 CFU/ml sau cấy trang 100 µl dịch huyền phù lên đĩa thạch (3 đĩa cho nồng độ Cinnamaldehyde) Tiến hành đếm khuẩn lạc đĩa thạch sau 24h 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Cinnamaldehyde lên phát triển V parahaemolyticus môi trường lỏng Chuẩn bị Cinnamaldehyde với nồng độ 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ppm 25 ml mơi trường NB chứa bình tam giác 100ml Tiến hành cấy V parahaemolyticus cho mật độ cuối bình tam giác 104 CFU/ml, ủ tủ ấm lắc nhiệt độ 28oC với tốc độ lắc 150 vòng/phút Thu mẫu kéo dài 24 nuôi cấy cấy trang đĩa thạch để đếm tổng số V parahaemolyticus 2.3.3 Thử nghiệm tính độc Cinnamaldehyde tơm ni Mục đích thí nghiệm nhằm kiểm tra tính độc Cinnamaldehyde đến tơm ni Từ kết thí nghiệm làm sở cho việc sử dụng liều Cinnamaldehyde để bố trí ảnh hưởng chất đến khả phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Cho Cinnamaldehyde vào nước bể ni tôm thẻ chân trắng (trọng lượng 1,8 ± 0,3g) với nồng độ 2; 5; 7,5; 10; 15; 20 ppm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 67 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cinnamaldehyde Tiến hành theo dõi hoạt động tôm ghi nhận tỷ lệ chết để đánh giá 2.3.4 Thử nghiệm hiệu Cinnamaldehyde phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Thí nghiệm bố trí gồm 04 nghiệm thức có 02 nghiệm thức đối chứng 02 nghiệm thức thí nghiệm Cinnamaldehyde cho lần vào nước bể thí nghiệm thời điểm gây nhiễm Mỗi nghiệm thức gồm bể thí nghiệm, bể chứa 20 tơm cỡ 1,5 ± 0,2g (chi tiết bố trí thí nghiệm mơ tả Bảng 1) Theo dõi tỷ lệ chết vòng 14 ngày sau gây nghiễm để đánh giá hiệu Cinnamaldehyde Bảng Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu Cinnamaldehyde phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính STT Nghiệm thức Cinnamaldehyde ppm (ĐC) Tơm thí nghiệm 20 con/bể x bể Không cinnamaldehyde (ĐC) 20 con/bể x bể Cinnamaldehyde ppm 20 con/bể x bể Không cinnamaldehyde 20 con/bể x bể III KẾT QUẢ 3.1 Ảnh hưởng nồng độ Cinnamaldehyde lên phát triển V parahaemolyticus môi trường thạch Đối với thí nghiệm mơi trường thạch với nồng độ Cinamaldehyde cho thấy nồng độ từ 40-60 ppm không thấy ảnh hưởng Cinnamaldehyde đến phát triển V parahaemolyticus (Đồ thị 1), mật độ vi khuẩn Ghi Không gây nhiễm với V parahaemolyticus Không gây nhiễm với V parahaemolyticus Gây nhiễm với V parahaemolyticus Gây nhiễm với V parahaemolyticus nhóm đối chứng nghiệm thức thí nghiệm với nồng độ khác cinnamaldehyde khơng có khác biệt lớn Tuy nhiên, nồng độ từ 70-110 ppm có giảm nhẹ số lượng khuẩn lạc mọc đĩa thạch so với đối chứng Nồng độ 120-140 ppm giảm đáng kể số khuẩn lạc đĩa thạch đặc biệt 150 ppm Cinnamaldehyde ức chế hoàn toàn phát triển V parahaemolyticus Đồ thị Kết kiểm tra khả ức chế V parahaemolyticus Cinnamaldehyde mơi trường thạch 68 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.2 Ảnh hưởng nồng độ Cinnamaldehyde lên phát triển V parahaemolyticus mơi trường thạch Ở thí nghiệm mơi trường lỏng kết cho thấy Cinnamaldehyde ức chế vi khuẩn nồng độ thấp so với môi trường thạch Ở nồng độ từ 40-90 ppm Cinnamaldehye thời điểm sau cấy cho thấy số khuẩn lạc mọc so với đối chứng (Bảng 2) Tuy nhiên, thời điểm nồng độ 30, 40, 50, 60 ppm có mật độ V parahaemolyticus không khác biệt lớn so với đối chứng Có thể nồng độ chưa đủ mạnh để ức chế hoàn toàn vi khuẩn phát triển Ở nồng độ 90 ppm không ức chế hoàn toàn kết rõ ràng Cinnamaldehyde làm ức chế phát triển vi khuẩn Bảng Mật độ vi khuẩn (Log10 CFU/ml) thời điểm thu mẫu khác nuôi cấy môi trường lỏng có diện Cinnamaldehyde Giờ sau cấy vi khuẩn Nồng độ Cinnamaldehyde 12 15 18 21 24 20 ppm 5,22 8,22 8,36 8,43 8,46 8,46 8,27 7,95 ĐC 20 ppm 5,13 8,26 8,30 8,47 8,49 8,45 8,30 7,89 30 ppm 5,01 8,06 8,30 8,42 8,45 8,46 8,33 7,96 ĐC 30 ppm 5,27 7,93 8,24 8,46 8,49 8,48 8,30 7,80 40 ppm 3,58 7,28 7,55 8,33 8,44 8,42 8,30 7,84 ĐC 40 ppm 5,00 8,28 8,32 8,44 8,48 8,47 8,32 7,78 50 ppm 3,59 7,86 8,22 8,33 8,45 8,45 8,30 7,72 ĐC 50 ppm 4,95 8,27 8,35 8,44 8,44 8,44 8,32 7,72 60 ppm 3,48 7,08 7,42 8,16 8,47 8,45 8,26 7,64 ĐC 60 ppm 5,18 8,18 8,34 8,47 8,47 8,47 8,45 7,73 70 ppm 3,36 3,89 4,26 5,77 6,16 6,77 7,20 6,64 ĐC 70 ppm 5,48 8,11 8,16 8,44 8,47 8,48 8,44 7,87 80 ppm 3,19 3,80 3,90 3,67 3,64 4,11 5,07 5,36 ĐC 80 ppm 5,20 8,21 8,33 8,44 8,48 8,44 8,41 7,70 90 ppm 2,76 3,58 3,36 2,19 1,65 1,60 1,40 1,18 ĐC 90 ppm 5,20 8,17 8,35 8,42 8,47 8,44 8,37 7,59 3.3 Độc tính Cinnamaldehyde tôm nuôi sau tiếp xúc Liều 10 ppm khơng Kết khảo sát tính độc Cinnamaldehyde tôm thẻ chân trắng cho thấy liều 15 20 ppm gây chết cấp tính tơm tỷ lệ chết cộng dồn đến 93% Liều 7,5 ppm cho chết cấp tính sau 48 theo dõi cho thấy tỷ lệ chết 20% không gây chết cấp tính Như kết khảo sát cho thấy liều ppm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 69 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II an tồn tơm (Đồ thị 2) Dựa kết thí nghiệm để làm cở sở chọn nồng độ thích hợp Cinnamaldehyde cho việc bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu Cinnamaldehyde việc phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Đồ thị Tỷ lệ chết cộng dồn tôm thẻ chân trắng sau cho tiếp xúc với nồng độ khác Cinnamaldehyde 3.4 Hiệu Cinnamaldehyde phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Kết thí nghiệm Đồ thị cho thấy nghiệm thức không bổ sung Cinnamaldehyde + khơng gây nhiễm nghiệm thức có bổ sung ppm Cinnamaldehyde + không gây nhiễm cho tỷ lệ chết thấp (khoảng 10%) Ở hai nghiệm thức tôm chết chủ yếu lột xác ăn Điều cho thấy tôm Cinnamaldehyde nồng độ ppm không gây chết tôm nuôi Tuy nhiên nghiệm thức thí nghiệm có khơng có diện Cinnamaldehyde gây nhiễm với V parahaemolyticus 70 cho tỷ lệ chết cao (78,33% nghiệm thức khơng có Cinnamaldehyde 68,33% nghiệm thức có Cinnamaldehyde) Mặc dù nghiệm thức có Cinnamaldehyde có tỷ lệ chết thấp chưa thấy khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) tỷ lệ tôm chết hai nghiệm thức này, nghĩa chưa thấy ảnh hưởng lớn Cinnamaldehyde phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Kết tái phân lập vi khuẩn cho thấy mẫu thu phân lập V parahaemolyticus dương tính với phản ứng PCR theo quy trình Han ctv., (2015) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Đồ thị Hiệu Cinnamaldehyde phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính IV THẢO LUẬN Theo nghiên cứu Gde ctv., (2013) cho thấy Cinnamaldehyde làm tăng tỷ lệ sống ấu trùng tôm xanh gây nhiễm với tác nhân gây bệnh Vibrio harveyi Cinnamaldehyde thiophenone mang lại hiệu tốt sử dụng liều μM 10 μM nước Tuy nhiên tăng nồng độ 10 μM không làm tăng tỷ lệ sống mà trái lại gây chết ấu trùng tôm xanh Điều cho thấy Cinnamaldehyde sử dụng liều định tăng nồng độ trở nên độc ấu trùng tôm xanh Kết tương thích với kết thử nghiệm chúng tơi tìm thấy nồng độ 7,5 ppm Cinnamaldehyde gây chết tơm, liều 20 ppm gây chết cấp tính sau cho tơm tiếp xúc với Cinnamaldehyde Cinnamaldehyde bảo vệ Artemia tác nhân gây bệnh Vibrio campbellii cá bơn với tác nhân gây bệnh Aeromonas hydrophila Aeromonas salmonicida (Natrah ctv., 2012) Các chất có khả làm phân hủy tín hiệu quorum sensing vi khuẩn Cinnamaldehyde, brominated furanones brominated thiophenones có khả bảo vệ Artemia khỏi xâm nhiễm Vibrio harveyi (Brackman ctv., 2008; Defoirdt ctv., 2007, 2012) Nghiên cứu Chenia (2015) kiểm tra tính nhạy cảm Cinnamaldehyde 36 chủng vi khuẩn Chryseobacterium chủng Myroides spp Phân lập từ cá hồi, cá rô phi 19 chủng Flavobacterium với kết cho thấy Cinnamaldehyde nồng độ ≥250 μg/ml (77,8100%) kết luận chất có tiềm để trị bệnh nhiễm khuẩn Chryseobacterium/ Myroides cá có tính thân thiện với môi trường, giá hợp lý sử dụng khơng có tượng đề kháng Nhóm tác giả Taguchi ctv., (2013) làm thử nghiệm ảnh hưởng Cinnamaldehyde lên phát triển nấm men cách bổ sung TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 71 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II chất vào môi trường nuôi cấy Candida albicans với nồng độ khác Kết cho thấy nồng độ 10 μg/ml Cinnamaldehyde ức chế phát triển sợi nấm không ảnh hưởng đến phát triển tế bào nói chung Ngồi nồng độ chưa thấy ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất, hình thái cấu trúc tế bào Ở nồng độ 40 μg/ ml Cinnamaldehyde thể chất diệt nấm việc làm biến đổi màng tế bào cấu trúc bên tế bào nấm men Cinnamaldehyde eugenol Suppakul ctv., (2012) thử hoạt tính kháng khuẩn 10 chủng vi khuẩn gây bệnh làm hỏng thức ăn chủng nấm men phương pháp giếng khuếch tán thạch đục lỗ Hai chất tẩm vào giấy để thử tính kháng khuẩn mơi trường thạch gần giống cách thử kháng sinh đồ Ở nồng độ 50 µl/ml, Cinnamaldehyde eugenol thể tính kháng khuẩn chủng thí nghiệm Với nồng độ ức chế tối thiểu 0,7850 µl/ml, Cinnamaldehyde eugenol ức chế tồn chủng thử nghiệm Trong số chủng thử nghiệm Aeromonas hydrophila Enterococcus faecalis nhạy cảm Cinnamaldehyde eugenol Cinnamaldehyde, Sporan với acid acetic Yossa ctv., (2012) thử tính kháng khuẩn Escherichia coli O157:H7 Salmonella cách cho vào mơi trường lỏng Luria-Bertani có vi khuẩn (7 log cfu/ mL) chứa Cinnamaldehyde Sporan (800 1.000 ppm) riêng lẻ hay phối hợp với 200 ppm acetic acid 37oC Số tế bào sống sót kiểm tra phương 72 pháp tráng đĩa E coli O157:H7 Salmonella khơng tìm thấy sau có diện 800 ppm Cinnamaldehyde Trong nghiên cứu môi trường lỏng Cinnamaldehyde thể tính ức chế với nồng độ thấp so với mơi trường thạch Có thể môi trường lỏng với điều kiện nuôi cấy lắc làm cho khả tiếp lúc V parahaemolyticus với Cinnamaldehyde nhiều Hơn môi trường thạch V parahaemolyticus tiếp xúc với Cinnamaldehyde bề mặt thạch nên hiệu ức chế Cinnamaldehyde thấp so với mơi trường lỏng Đối với thí nghiệm gây nhiễm có diện Cinnamaldehyde cho tỷ lệ chết thấp chưa có khác biệt lớn so với đối chứng Các thí nghiệm tối ưu điều kiện khác cần nghiên cứu thêm để đánh giá hiệu phòng bệnh Cinnamaldehyde V KẾT LUẬN Cinnamaldehyde có khả ức chế phát triển Vibrio parahaemolyticus môi trường thạch môi trường lỏng Ở môi trường thạch với nồng độ 150 ppm chất ức chế hoàn toàn Vibrio parahaemolyticus mọc môi trường TSA Đối với môi trường lỏng nồng độ từ 40 ppm cho thấy có khả ức chế Vibrio parahaemolyticus sau nuôi cấy Bước đầu cho thấy Cinnamaldehyde gây chết tôm nuôi cỡ 1-2g với nồng độ từ 7,5 ppm trở lên hiệu chưa cao phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TÀI LIỆU THAM KHẢO Adams, T.B., 2004 The FEMA GRAS assessment of cinnamyl derivatives used as flavor ingredients Food Chem Toxicol 42(2): 157-185 Brackman, G., Defoirdt, T., Miyamoto, C., Bossier, P., Calenbergh, S.V., Nelis, H., Coenye, T., 2008 Cinnamaldehyde and cinnamaldehyde derivatives reduce virulence in Vibrio spp by decreasing the DNA-binding activity of the quorum sensing response regulator luxR BMC Microbiol (149): 1–14 Chenia, H.Y., 2015 Antimicrobial activity of cinnamaldehyde, vanillin and Kigelia africana fruit extracts against fish-associated Chryseobacterium and Myroides spp Isolates Afr J Tradit Complement Altern Med 12(3): 55-67 Defoirdt, T., Miyamoto, C.M., Wood, T.K., Meighen, E.A., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P., 2007 The natural furanone (5Z)-4 bromo-5-(bromomethylene)-3- butyl2(5H)-furanone disrupts quorum sensingregulated gene expression in Vibrio harveyi by decreasing the DNA-binding activity of the transcriptional regulator protein luxR Environ Microbiol 9: 2486–2495 Defoirdt, T., Benneche, T., Brackman, G., Coenye, T., Sorgeloos, P., Scheie, A.A., 2012 A quorum sensing-disrupting brominated thiophenone with a promising therapeutic potential to treat luminescent vibriosis PLoS One (7): 417-88 Flegel, T.W., 2012 Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia Journal of Invertebr Pathol 110: 166-173 Gde, S.J.Pande, Scheie, A.A., Benneche, T., Wille, M., Sorgeloos, P., Bossier, P., Defoirdt, T., 2013 Quorum sensing-disrupting compounds protect larvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii from Vibrio harveyi infection Aquaculture 406-407: 121-124 Han, J., Tang, K., Tran, L.H., Lightner, D.V., 2015 Photorhabdus Insect-Related (Pir) Toxin-like Genes in a Plasmid of Vibrio Parahaemolyticus, the Causative Agent of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) of Shrimp Dis Aquat Org 113(1): 33-40 Lightner, D.V., Redman, R.M., Pantoja, C.R., Noble, B.L., Loc Tran, 2012 Early Mortality Syndrome Global aquaculture advocate 2/2012, p40 Loc, T., Nunan, L., Redman, R.M., Mohney, L.L., Pantoja, C.R., Fitzsimmons, K., Logambal, S.M., Venkatalakshmi, S., Michael, R.D., 2013 Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp Dis Aquat Org 105: 45–55 Natrah, F.M.I., Iftakharul, M.A., Pawar, S., Harzevili, A.S., Nevejan, N., Boon, N., Sorgeloos, P., Bossier, P., Defoirdt, T., 2012 The impact of quorum sensing on the virulence of Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida towards burbot (Lota lota L.) larvae Vet Microbiol 159: 77–82 Panakorn, S., 2012 Opinion article: more on early mortality syndrome in shrimp Aqua Culture Asia Pacific, (1): 8-10 Prachumwat, A.A., Thitamadee, S., Sriurairatana, S., Chuchird, N., Limsuwan, C Jantratit, W., Chaiyapechara, S., Flegel, T.W., 2012 Shotgun sequencing of bacteria from AHPNS, a new shrimp disease threat for Thailand Poster, National Institute for Aquaculture Biotechnology, Mahidol University, Bangkok, Thailand (Poster available for free download at www.enaca.org) Suppakul, P., Chonhenchob, V., SanlaEad, N., 2012 Antimicrobial Activity of Cinnamaldehyde and Eugenol and Their Activity after Incorporation into Cellulosebased Packaging Films Pakaging Technology and Science 25 (2): 7–17 Taguchi, Y., Hasumi, Y., Abe, S., Nishiyama, Y., 2013 The effect of cinnamaldehyde on the growth and the morphology of Candida albicans Medical Molecular Morphology 46(1): 8-13 Yossa, N., Jitendra, P., Dumitru, M., Patricia, M., Charles, M., Gary, B., Martin, L.Y., 2012 Antibacterial activity of Cinnamaldehyde and Sporan against Escherichia Coli O157:H7 and Salmonella Journal of Food Processing and Preservation ISSN 1745-4549 doi:10.1111/jfpp.12026 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 73 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II EFFECT OF CINNAMALDEHYDE ON PREVENTION OF ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE IN Penaeus vannamei SHRIMP Le Hong Phuoc1*, Bui Linh Tam2, Cao Thanh Trung1, Doan Van Cuong1 ABSTRACT This study was conducted to evaluate the effect of Cinnamaldehye on prevention of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in Penaeus vannamei shrimp In vivo and in vitro tests were performed to test the effect of Cinnamaldehyde on Vibrio parahaemolyticus and on the prevention of AHPND In agar medium, Cinnamaldehyde was added to Tryptic Soya Agar (TSA) at concentrations of 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, and 150 ppm Equal amounts of V parahaemolyticus suspension were plated on TSA plates which contained the above mentioned concentrations of Cinnamaldehyde and were incubated at 30oC for 24 hours The concentration of 150 ppm Cinnamaldehyde completely inhibited the growth of Vibrio parahaemolyticus In broth medium, Cinnamaldehyde was added to Nutrient broth at concentrations of 40, 50, 60, 70, 80, and 90 ppm This componud was able to inhibit the growth of V parahaemolyticus at a concentration of 40 ppm at hours post-innoculation In addition, Cinnamaldehyde was toxic to Penaeus vannamei shrimp Hundred percent shrimp mortality was obtained when adding 15 ppm Cinnamaldehyde in the culture water Application of Cinnamaldehyde in challenge test showed a slight protection of Penaeus vannamei shrimp against V parahaemolyticus Keywords: Cinnamaldehyde, shrimp, Vibrio parahaemolyticus Người phản biện: ThS Ngô Thị Ngọc Thủy Ngày nhận bài: 06/9/2016 Ngày thông qua phản biện: 12/9/2016 Ngày duyệt đăng: 15/9/2016 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2 Nong Lam university, HCMC * Email: lehongphuoc@yahoo.com 74 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 ... làm cở sở chọn nồng độ thích hợp Cinnamaldehyde cho việc bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu Cinnamaldehyde việc phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Đồ thị Tỷ lệ chết cộng dồn tôm thẻ chân trắng. .. lệ tôm chết hai nghiệm thức này, nghĩa chưa thấy ảnh hưởng lớn Cinnamaldehyde phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Kết tái phân lập vi khuẩn cho thấy mẫu thu phân lập V parahaemolyticus dương tính. .. hiệu Cinnamaldehyde phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính điều kiện in vivo in vitro Ảnh hưởng Cinnamaldehyde lên phát triển nấm Candida albicans nghiên cứu nhóm tác giả Taguchi ctv., (2013) Ở nồng