Tolerine - protein tái tổ hợp rVP28 - đã được nhiều nhà nghiên cứu xác định có khả năng bảo vệ tôm trước virus gây bệnh đốm trắng (WSSV). Nghiên cứu này, ngoài xác định hiệu quả bảo vệ, hiệu quả hạn chế truyền lây của protein tái tổ hợp rVP28 biểu hiện trong tế bào nấm men cũng được đánh giá dựa trên hệ số sinh cơ bản R.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN HIỆU QUẢ CỦA TOLERINES TRONG VIỆC HẠN CHẾ TRUYỀN LÂY VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG CHO TƠM SÚ NI THƯƠNG PHẨM Ngơ Thị Ngọc Thủy1*, Trần Ngọc Hiểu1, Đặng Thị Trà My1 TĨM TẮT Tolerine - protein tái tở hợp rVP28 - đã được nhiều nhà nghiên cứu xác định có khả bảo vệ tôm trước virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) Nghiên cứu này, ngoài xác định hiệu quả bảo vệ, hiệu quả hạn chế truyền lây của protein tái tổ hợp rVP28 biểu hiện tế bào nấm men cũng được đánh giá dựa hệ số sinh bản R Tôm được dùng tolerine đợt hoặc đợt (10 ngày đợt-1 và mỗi đợt cách 10 ngày) Sau đó, chúng được gây nhiễm theo cặp gồm tôm khỏe và tôm gây nhiễm bằng WSSV cùng nhóm Kết quả cho thấy tôm dùng tolerine có tỷ lệ chết (50,7 – 63,3%) và tỷ lệ nhiễm (62,7 – 67,8%) thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê với tôm đối chứng (72,4 – 75,7% và 74,8- 76,0%) (P < 0,05) Ngoài ra, hệ số R của các lô tôm được dùng tolerine (2,07 – 2,43) thấp ở các lô tôm không dùng tolerine (2,96 – 3,28); nhiên, các hệ số này đều lớn đã không biểu thị khả hạn chế lây nhiễm virus gây bệnh đốm trắng của tolerine Như vậy, việc nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật, quản lý kết hợp với việc sử dụng tolerine là cần thiết để góp phần làm giảm khả lây lan virus, hạn chế bùng phát dịch bệnh Từ khóa: Tolerine, truyền lây, bệnh đốm trắng I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần nhiều nghiên cứu vắc xin/tolerine phịng bệnh đốm trắng cho tơm cơng bố rộng rãi Đó nghiên cứu tolerine nhược độc (Namikoshi et al., 2004; Singh et al., 2005; Zhu et al., 2009), protein tolerine (Caipang et al., 2008; Jha et al., 2007; Jha et al., 2006a; Witteveldt et al., 2004b, 2006) DNA tolerine (Kumar et al., 2009; Ning et al., 2009; Rout et al., 2007) Để đánh giá hiệu loại tolerine này việc phòng bệnh đốm trắng, tất nghiên cứu dựa việc so sánh, đánh giá tỷ lệ sống và dựa vào chỉ số bảo hộ RPS (Relative Percentive Survival) tơm thí nghiệm sau gây nhiễm với virus Tuy nhiên, tỷ lệ truyền lây – yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu vắc xin (Anderson, 1992; Dejong Kimman, 1994) không đề cập đến Thực tế, số trường hợp, vắc xin khơng có hiệu bảo vệ cao cho cá thể có ích cho quần đàn làm giảm lây truyền tác nhân quần đàn (Anderson, 1992) Chính vậy, nghiên cứu này ngoài việc đánh giá tỷ lệ bảo hộ của tolerine tài liệu cơng bố, tiêu chí giảm lan truyền virus quần đàn xác định dựa số sinh bản R Đây là chỉ số xác định số trung bình động vật bị nhiễm virus lây lan từ một cá thể ban đầu mang mầm bệnh quần đàn Nếu R lớn có nghĩa cá thể mang mầm bệnh lây lan cho cá thể khỏe khác quần đàn – dịch bệnh xuất Ngược lại, R nhỏ đồng nghĩa với việc có cá thể khỏe bị nhiễm bệnh từ cá thể mang bệnh quần đàn – điều cho thấy tác nhân gây bệnh dần bị loại dịch bệnh sảy Đây là một nội dung của đề tài cấp Bộ: Bước đầu Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Nam sông Hậu, Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản * Email: thuyngo8@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 37 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN nghiên cứu, sản xuất tolerine có khả hạn chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng tôm sú Penaeus monodon nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu • Tơm sú: 900 tôm sú kích cỡ 2,6 ± 0,5g/con, tôm có màu sắc tươi sáng, không bị tổn thương vỏ, phụ bộ, không bị nhiễm nấm, ký sinh trùng, vi khuẩn V parahaemolyticus, virus gây bệnh đốm trắng, đầu vàng, còi, virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu biểu mô • Chủng WSSV: Virus gây bệnh đớm trắng dùng nghiên cứu này là virus thu được tại Quảng Ngãi thời gian dịch bệnh, là loại virus đã dùng các nghiên cứu của Dieu (2010), cung cấp bởi trường Đại học Wageningen, Hà Lan Virus được phân lập và tinh sạch dựa theo phương pháp của Xie et al., (2005) và được bảo quản ở -80oC tại Phân Viện Nghiên Cứu Thủy Sản Minh Hải • Thức ăn và Tolerine: Thức ăn dùng nghiên cứu này là thức ăn viên thương mại dùng cho tôm sú nuôi thương phẩm giai đoạn 2-3gram (LAONE L300 của công ty UNI-PRESIDENT, Việt Nam) Tolerine là protein tái tổ hợp rVP28 có dịch và tế bào nấm men Pichia pastoris với mật độ 3,1 x 1010 ml-1 Đối chứng là dịch nuôi cấy và tế bào nấm men không mang gen VP28 (không có protein tái tổ hợp rVP28) • Nước biển, bể thí nghiệm: Nước biển dùng thí nghiệm có độ mặn 25‰ được lắng, lọc, xử lý chlorine 30 ppm trước sử dụng Hai bể composite có thể tích m3/bể được gắn sục khí đáy và bề mặt và hệ thống nuôi tôm theo cặp được thiết kế gồm gồm 160 hộp nhựa lít chia làm dãy ngăn cách với để hạn chế tối đa lây nhiễm chéo giữa tôm ở lô đối chứng và thí nghiệm Mỗi hộp nhựa được gắn cục bọt sục khí và nuôi hai tôm: gây nhiễm WSSV tôm khỏe 2.2 Phương pháp nghiên cứu • Chuẩn bị thức ăn có tolerine thức ăn đối chứng Tolerine được pha loãng theo số 10 bằng dung dịch đệm phosphate (PBS) vô trùng để được dung dịch có nồng độ 3,1 x 109 tế bào.ml-1 Dung dịch này được được trộn đều với 10 gram thức ăn LAONE L300 và ủ đá lạnh 20 phút trước áo bằng dầu mực (ANOVA) với tỷ lệ 1% theo trọng lượng Thức ăn đối chứng thức ăn thương mại loại trộn với tế bào nấm men không mang gen VP28 dịch nuôi cấy tương ứng Thức ăn dùng bảo quản tủ mát 40C ngày • Bố trí thí nghiệm 800 tơm thí nghiệm chia đều làm hai nhóm ni bể 4m3 (Hình 1): nhóm cho ăn thức ăn trộn tolerine nhóm cho ăn thức ăn đối chứng 10 ngày Tôm sau đó được ngưng cho ăn thức ăn thí nghiệm 10 ngày thời gian này chúng được dùng thức ăn thức ăn viên thương mại LAONE L300 (Hình 3A) Hình 1: Bố trí thí nghiệm giai đoạn cho ăn tolerine 38 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Sau đó, 140 tơm nhóm chuyển khu vực thí nghiệm lây nhiễm để tiến hành bố trí gây nhiễm theo mơ hình cặp (Velthuis et al., 2002): tơm gây nhiễm liều gây chết tối thiểu 100% nuôi tôm khỏe (Hình 3B) Tôm lây nhiễm và tôm khỏe được phân biệt bằng cách buộc các sợi chỉ có màu sắc khác ở vị trí gốc mắt tôm (Hình 2) Tỷ lệ tôm chết theo dõi hàng ngày diện virus đốm trắng tất tơm thí nghiệm kiểm tra phương pháp PCR (Hình 3C) Hình 2: Bố trí thí nghiệm ni tơm theo cặp giai đoạn gây nhiễm Số tơm cịn lại tiếp tục cho ăn thức ăn trộn tolerine lần thứ hai 10 ngày ngưng 10 ngày tiến hành cảm nhiễm ngược theo cặp tương tự giai đoạn trước Hình 3: Bố trí thí nghiệm xác định khả hạn chế lây lan tolerine TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 39 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN • Chăm sóc, quản lý tơm thí nghiệm Tơm được cho ăn thức ăn thí nghiệm lần ngày-1 vào giờ và 17 giờ với lượng 5% trọng lượng thể Ở giai đoạn gây nhiễm, lượng thức ăn điều chỉnh hàng ngày dựa theo số lượng tôm chết mức độ ăn tôm Các dấu hiệu bất thường mềm vỏ, đốm trắng,… và tỷ lệ chết của tôm được ghi chép lần.ngày-1 vào lúc 7-9 và 16-19 Tôm gây nhiễm ngâm virus bị chết giữ lại bể ni 24 để đảm bảo có lây truyền virus Tôm không gây nhiễm nếu chết bỏ khỏi bể nuôi Tôm chết bảo quản tủ lạnh -200C Kết thúc thí nghiệm, tất tôm kiểm tra diện virus đốm trắng phương pháp PCR (Kiatpathomchai et al., 2001) Mơi trường nước trì cách vệ sinh bể, điều chỉnh lượng thức ăn, bổ sung men vi sinh, thay nước cần thiết Tơm ni phịng thí nghiệm có khống chế nhiệt độ để trì nhiệt độ nước khoảng 280C; độ mặn nước 25‰, sục khí lắp bể điều chỉnh để lượng oxy hòa tan lớn 4mg.l-1 Ở giai đoạn gây nhiễm 10-15ml nước biển vơ trùng có độ mặn cấp cho bể để trì mức nước độ mặn Các yếu tố môi trường: nhiệt độ, pH, độ mặn, NH3, NO2, H2S theo dõi ngày.lần-1 vào lúc Ở giai đoạn chuẩn bị tôm, các yếu tố môi trường được đo tại từng bể; ở giai đoạn nuôi tôm theo cặp, chúng được đo ở bể ngẫu nhiên Nhiệt độ đo nhiệt kế; pH đo bằng máy pH cầm tay (HANNA HI 8424); độ mặn đo bằng khúc xạ kế (Atago Master S-Mill Alpha) Hàm lượng khí độc phân tích theo phương pháp hành: Nitrit -TCVN 6178:1996, Amonia - TCVN 3706:1990, Hydrosulphua -TCVN 6637:2000 • Phương pháp phân tích số liệu Tỷ lệ chết của tôm sau gây nhiễm 10 ngày 40 được phân tích bằng thống kê mô tả, so sánh dựa kiểm định t-test ANOVA, phân tích Duncan phần mềm SPSS 16.0 Đối với kiểm định ANOVA, số liệu biểu thị phần trăm như: tỷ lệ chết, tỷ lệ RPS chuyển đổi sang arsin trước phân tích - Giá trị RPS (Relative Percent Survivor) được tính dựa theo Amend (1981): RPS (%) = (1 – tỷ lệ chết của nhóm dùng tolerine/tỷ lệ chết của nhóm đối chứng) x 100 - Tỷ số sinh – The basic reproduction ratio (R), hệ số truyền lây β nhóm phương pháp so sánh FS dùng để xác định khác biệt nhóm có dùng khơng dùng tolerine (Hình 3D) Tolerine có hiệu hạn chế lây truyền giá trị Rv (Giá trị R nhóm dùng tolerine) khác biệt có ý nghĩa với giá trị Ro (R nhóm khơng dùng tolerine) Rv nhỏ Ro lớn Trong đó: R: tỷ số sinh bản; β: hệ số truyền lây P: xác suất để cá thể bị lây nhiễm (mức 2) từ cá thể bị nhiễm (mức 1) quần đàn chưa bị lây nhiễm III KẾT QUẢ 3.1 Sự biến động yếu tố môi trường Các yếu tố môi trường hai giai đoạn khoảng thích hợp cho phát triển tôm: nhiệt độ 27 – 290C, pH 8,0 – 8,2; Amonia 0,00 – 0,04 mg.l-1; Nitrit 0,00 – 0,03 mg.l-1 hydrosulphure 0,00 mg.l-1 (Bảng 1) Ở giai đoạn gây nhiễm, tượng tôm chết xuất tôm gây nhiễm chết không lấy mà trì bể ni nhằm tạo hội cho việc lây truyền virus sang cá thể tiếp xúc Điều làm cho hàm lượng khí độc (ammonia, nitrit) cao môi trường song nằm giới hạn thích hợp, khơng gây ảnh TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN hưởng đến sức khỏe tơm Ngồi ra, khơng có khác biệt yếu tố mơi trường theo dõi cơng thức thí nghiệm: có không dùng tolerine (P0,05) Bảng 3: Kết phân tích thời gian chết tôm gây nhiễm tôm tiếp xúc Thông số Loại tôm lần dùng tolerine lần dùng tolerine Số tơm chết Thời gian chết trung bình (ngày) Giá trị T-test Giá trị P Tiếp xúc 26 5,5 ± 2,1 1,23 0,224 Gây nhiễm 50 4,8 ± 2,4 Tiếp xúc 24 1,94 0,056 Gây nhiễm 47 6,3 ± 2,3 5,1 ± 2,5 3.3 Tỷ lệ chết và dấu hiệu bệnh lý Trong thí nghiệm tỷ lệ chết tơm có dùng tolerine thấp so với tôm đối chứng – không dùng tolerine (P