Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp ​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT METHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Sinh viên thực hiện: Nhựt Phạm Hữu Tuấn MSSV: 1151110538 Lớp: 11DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm…… Sinh viên Phạm Hữu Tuấn LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, q thầy giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm khố luận tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phịng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường anh chị, bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Tp Hồ Chí Minh, ngày……tháng……2015 Sinh viên Phạm Hữu Tuấn Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách hình v Danh sách bảng vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Elephantopus sp 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm số loài thuộc Elephantopus sp 1.1.4 Phân bố 1.1.5 Công dụng 1.2 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất từ thực vật 1.2.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn hợp chất từ thực vật 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất từ thực vật i Đồ án tốt nghiệp 1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.2.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn thực vật giới Việt Nam 12 1.3 Ảnh hưởng dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn thực vật 14 1.4 Giới thiệu số nhóm vi sinh vật gây bệnh 15 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 15 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh hội da 21 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Thời gian địa điểm 27 2.1.1 Thời gian 27 2.1.2 Địa điểm 27 2.2 Vật liệu 27 2.2.1 Nguồn mẫu 27 2.2.2 Vi sinh vật thị 27 2.2.3 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp xử lý tách chiết hợp chất kháng khuẩn 29 2.4.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật thị 29 2.4.3 Phương pháp pha loãng mẫu 30 2.4.4 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật thị 30 2.4.5 Phương pháp tách phân đoạn từ cao tổng methanol 30 2.4.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 31 2.4.7 Phương pháp xác định số MIC 32 ii Đồ án tốt nghiệp 2.4.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 33 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 34 2.5 Bố trí thí nghiệm 34 2.5.1 Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết methanol từ Elephantopus sp .34 2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol từ Elephantopus sp 36 2.5.3 Thí nghiệm 3: Tách chiết phân đoạn từ cao tổng methanol 75% từ Elephantopus sp 37 2.5.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả kháng khuẩn phân đoạn cao tổng methanol 38 2.5.5 Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao tổng methanol Elephantopus sp 39 2.5.6 Thí nghiệm 6: Định tính số thành phần có Elephantopus sp 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết methanol từ Elephantopus sp 45 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn sơ cao tổng methanol từ Elephantopus sp 45 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu cao tổng Elephantopus sp 49 3.4 Định tính sơ thành phần hóa học Elephantopus sp 50 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng Elephantopus sp qua phân đoạn 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 4.1 Kết luận 58 4.2 Đề nghị 58 Tài liệu tham khảo 59 iii Đồ án tốt nghiệp iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BF: Butanol fraction EF: Ethyl acetate fraction EMB: Eosin Methylene Blue HF: Hexan fraction ME: dịch chiết methanol 75% MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu PSMs: Plant Secondary Metabolites TSA: Trypticase Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth XLD: Xylose Lysine Deoxycholate WF: Water fraction v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái Elephantopus scaber Hình 1.2 Hình thái Elephantopus mollis Hình 1.3 Hình thái Elephantopus tomentosus Hình 1.4 Các điểm tác động PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm nấm Hình 1.5 Hình thái E.coli kính hiển vi điện tử 15 Hình 1.6 Khuẩn lạc E.coli môi trường EMB 16 Hình 1.7 Hình thái Vibrio kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.8 Khuẩn lạc Vibrio môi trường Chrom agar 17 Hình 1.9 Hình thái Salmonella kính hiển vi điện tử 18 Hình 1.10 Khuẩn lạc Salmonella môi trường XLD 19 Hình 1.11 Hình thái Shigella kính hiển vi điện tử 20 Hình 1.12 Khuẩn lạc Shigella mơi trường Macconkey 20 Hình 1.13 Hình thái Pseudomonas kính hiển vi điện tử 22 Hình 1.14 Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa mơi trường thạch thường22 Hính 1.15 Hình thái Enterococcus faecalis kính hiển vi điện tử 23 Hình 1.16 Khuẩn lạc Enterococcus faecalis môi trường thạch máu BA .24 Hình 1.17 Hình thái Staphylococcus kính hiển vi điện tử 25 Hình 1.18 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk 25 Hình 2.1 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) chủng Escheriachia coli (trái) Shigella flexneri 37 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn hexan (20 mg/ml) butanol (50 mg/ml) chủng Escheriachia coli Shigella flexneri 39 Hình 2.3 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết methanol 75% (25 mg/ml) chủng Listeria monocytogenes Vibrio alginolyticus (phải) 40 Hình 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) nhóm Escherichia spp 45 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus 46 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) chủng Listeria monocytogen Pseudomonas aeruginosa 47 Hình 3.4 Thử nghiệm định tính tannin 52 Hình 3.5 Thử nghiệm định tính alkaloid 53 Hình 3.6 Thử nghiệm định tính flavonoid 53 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn nhóm Escherichia54 Hình 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus 54 Hình 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn lên chủng Listeria monocytogenes chủng Pseudomonas aeruginosa 55 vii Đồ án tốt nghiệp Ibtisam Mohammed Ababutain (2011) “Antimicrobial Activity of Ethanolic Extracts From Some Medicinal Plant” Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(11): 678-683 Inta, A ctv (2008) “A comparative study on medicinal plants used in Akha’s traditional medicine in China and Thailand, cultural coherence or ecological divergence?” J Ethnopharmacol 116: 508-517 Jaganath I.B (2000) Herbs the green pharmacy of Malaysia Kuala Lumpur: Vinpress,76−7 Jasmine R Daisy P, (2008) “Effect of crude extract and fraction from Elephantopus scaber on hyperglycemia in Streptozotocin-diabetic rats” Int J Biol Chem 1: 111-116 Murugesan S ctv (2011) “Phytochemical screening and Antimicrobial activity of the leaves of Memecylon umbellatum Burm F”.Journal of Applied Pharmaceutical Science (1): 42-45 Muthumani P ctv (2010) “Anti-diarrhoeal and cardiotonic activity of extracts of Elephantopus scaber linn in experimental animals” Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences Volume Issue Page No Poli A ctv (1992) Preliminary pharmacologic evaluation of crude whole plant extracts of Elephantopus scaber Part I: In vivo studies J Ethnopharmacol 37(1):71-6 Radulovíc ctv (2013) “Antimicrobial Plant Metabolites: Structural Diversity and Mechanism of Action” Current Medicinal Chemistry, 20, 932-952 Silvia Martins ctv (2013) Antibacterial activity of crude methanolic extract and fractions obtained from Larrea tridentata leaves Industrial Crops and Products, 306– 311 62 Đồ án tốt nghiệp Thatoi H.N, ctv (2008) “Antimicrobial Activity and Ethnomedicinal Uses of Some Medicinal Plants” Similipal Biosphere Reserve, Orissa Asian J of Plant Sci 7: 260-267 Tim Cushnie ctv (2014) “Alkaloids: An overview of their antibacterial, antibiotic-enhancing and antivirulence activities” 44(5), pp 377–386 Wang B ctv (2012) “A new sesquiterpene lactone from Elephantopus tomentosus” J Asian Nat Prod Res 14(7):700-3 Wang L ctv (2004) “Chemical composition of the essentia oil of the Elephantopus scaber from Southern China” Z Naturforsch C, 59(5-6):327-9 Yam, M.F ctv (2009) “Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Elephantopus tomentosus Ethanolic Extract” J Acupunct Meridian Stud 2(4):280−287 63 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ KHÁNG KHUẨN CÂY ELEPHANTOPUS SP Bảng.A.1 Kết kháng khuẩn dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) từ Elephantopus sp Đường kính giếng thạch lỗ mm Đồ án tốt nghiệp Bảng A.2 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn hexan (HF 20 mg/ml), ethyl acetate (EF 40 mg/ml), butanol (BF 50 mg/ml) nước (WF 50 mg/ml)từ phân đoạn methanol 75% Chủng vi sinh vật Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coliETEC Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii Salmonella typhimurium Đồ án tốt nghiệp Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng thạch lỗ mm Đồ án tốt nghiệp Bảng A.3 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC cao tổng methanol 75% từ Elephantopus sp (mm) Chủng VSV Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coliETEC Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Đồ án tốt nghiệp Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng thạch lỗ mm Đồ án tốt nghiệp Bảng A.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng sinh ciprofloxacin 500 µg/ml 500 µg/ml (mm) Chủng vi sinh vật Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coli-ETEC Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng thạch lỗ mm Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ Kết xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey Bảng B.1 Kết xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Escherichia VSV E.coli 0208 E.coli O157:H7 DC 0208 DC K DC O157H7 E.coli (K) E.coli-ETEC DC ETEC Bảng B.2 Kết xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Samonella VSV S.typhi (K) DC Bảng B.3 Kết xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Shigella VSV S.flexneri DC Bảng B.4 Kết xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Vibrio VSV V cholerae DC cholerae V alginolyticus DC algino Bảng B.5 Kết xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Listeria VSV DC L.monocytogenes Bảng B.6 Kết xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Psedomonas aegurinosa VSV DC Pseudomonas (K) Bảng B.7 Kết xử lý số liệu hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết methanol Escheriachia Bảng B.7.1 Escherichia 0208 Đồ án tốt nghiệp phan doan EF HF BF CIP Bảng B.7.2 Escheriachia O15:H7 phan doan HF BF EF CIP Bảng B.7.3 E coli-ETEC phan doan HF BF EF CIP Bảng B.7.4 E coli phan doan WF HF BF CIP Bảng B.8 Kết xử lý số liệu hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết methanol Salmonella phan doan WF CIP Bảng B.9 Kết xử lý số liệu hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết methanol Shigella phan doan HF BF CIP Bảng B.10 Kết xử lý số liệu hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết methanol Vibrio Bảng B.10.1 V cholerae phan doan EF HF CIP Đồ án tốt nghiệp Bảng B.10.2 V alginolyticus phan doan HF CIP Bảng B.11 Kết xử lý số liệu hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết methanol Psedomonas aegurinosa phan doan WF CIP ... định khả kháng khuẩn cao chiết từ Elephantopus sp Đồ án tốt nghiệp Bước đầu xác định thành phần hóa học có Elephantopus sp Nội dung nghiên cứu Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết methanol. .. cao chiết methanol từ Elephantopus sp 45 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn sơ cao tổng methanol từ Elephantopus sp 45 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu cao tổng Elephantopus sp 49 3.4 Định tính sơ... Thu nhận cao chiết methanol từ Elephantopus sp .34 2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol từ Elephantopus sp 36 2.5.3 Thí nghiệm 3: Tách chiết phân