Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (anoectochilus setaceus) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc​

tên đề tài.txt Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc Giảng viên hướng dẫn: TS Hà Thị Loan SV: Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp: 13DSH01 MSSV: 1311101018 Page Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học Tiến sĩ Hà Thị Loan Các số liệu sử dụng phân tích đồ án có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước đây, phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp Lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh, q thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức chun mơn bổ ích suốt bốn năm học vừa qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện kinh phí trang thiết bị để em thực đề tài Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Hà Thị Loan với Anh (Chị) cán làm việc phòng Thực nghiệm trồng tạo điều kiện thuận lợi cho em học hỏi, tiếp cận kiến thức thực tế, tích lũy nhiều kinh nghiệm thao tác phịng thí nghiệm Đồng thời Anh (Chị) góp ý, bổ sung chỉnh sửa kiến thức thiếu sót để em hồn thành tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình người bên cạnh em, cổ vũ tinh thần ủng hộ em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật 1.1.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 12 1.1.4 Ưu điểm nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô thực vật 13 1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 14 1.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 14 1.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn 15 1.2.4 Nuôi cấy tế bào trần 15 1.2.5 Nuôi cấy hạt phấn 16 1.2.6 Nuôi cấy protoplast 16 1.3 Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 16 1.3.1 Đặc điểm chế xâm nhiễm vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ 16 1.3.2 Vai trò, chức oncogen rol (root inducing locus) 19 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Tình hình nghiên cứu rễ tóc số loài dược liệu trồng 21 1.4 Tổng quan lan kim tuyến 22 1.4.1 Nguồn gốc phân bố 22 1.4.2 Phân loại 23 1.4.3 Đặc điểm hình thái 23 1.4.4 Điều kiện sinh sống lan kim tuyến 25 1.4.5 Giá trị dược liệu lan kim tuyến 25 1.4.6 Nhân giống lan kim tuyến 26 1.4.7 Tình hình nghiên cứu lan kim tuyến 27 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 2.2 Vật liệu nghiên cứu 29 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 29 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 31 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy 31 2.3 Phương pháp 31 2.3.1 Pha môi trường 31 2.3.2 Các thao tác phòng cấy 32 2.4 Nội dung nghiên cứu 33 2.5 Bố trí thí nghiệm 33 2.5.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng NAA BA đến vị trí mẫu cấy chồi lan kim tuyến 33 ii Đồ án tốt nghiệp 2.5.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến 34 2.5.3 Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả tạo rễ tóc từ quan lan kim tuyến lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .Error! Bookmark not defined 3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng NAA BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến… 38 3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến 43 3.3 Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả tạo rễ tóc từ quan lan kim tuyến lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNSH Cơng Nghệ Sinh Học TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh MS Murashige – Skoog BA Benzyl Adenin NAA Napthalene Acetic Acid BAP 6-Benzyl Amino Purine 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA 3-Indole butyric acid IAA 3-Indole acetic acid NT Nghiệm thức ĐC Đối chứng Cs Cộng YMB Yeast mannitol broth B5 Gamborg’s iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thời gian nồng độ chất khử trùng (Street, 1974) Bảng 2.1 Khảo sát nồng độ BA NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến 34 Bảng 2.2 Khảo sát nồng độ BA NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến 35 Bảng 2.3 Các quan lan kim tuyến chuyển gen 37 Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên tái sinh chồi lan kim tuyến sau tuần theo dõi 39 Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau tuần theo dõi 44 Bảng 3.3 Khảo sát khả tạo rễ tóc từ quan lan kim tuyến lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 chủng TR7 sau tuần nuôi cấy 48 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng nồng độ NAA BA đến số chồi chiều cao chồi mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy 40 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng nồng độ NAA BA đến tỷ lệ tái sinh chồi mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy 41 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng nồng độ NAA BA đến số chồi chiều cao chồi mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy 46 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19 Hình 1.2 Lan kim tuyến ngồi vườn ươm 23 Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến tự nhiên 29 Hình 3.1 Ảnh hưởng NAA BA lên tái sinh chồi lan kim tuyến .38 Hình 3.2 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến 44 Hình 3.3 Ảnh hưởng việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng Tr7 chủng 15834 vào quan lan kim tuyến sau tuần nuôi cấy nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4 51 vii 56 Đồ án tốt nghiệp 19 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lind Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(4), 248-253, 2010 20 Trần văn Minh (2010), Giáo trình ni cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, Tài liệu nước 21 Altamura, 2004 Agrobacterium rhizogenes rolB and rolD genes: regulation and involvement in plant development Plant Cell Tissue Org Cult., 77: 89-101 22 Birot, Bouchez, Casse-Delbart, Durand-Tardif, Jouanin, Pautot, Robaglia, Tepfer, Tepfer, Tourneur, 1987 Studies and uses of the rRi plasmids of Agrobacterium rhizogenes Plant Physiol Biochem., 25: 323-335 23 Cardarelli, Spanò, 1987 The role of auxin in hairy root induction Mol Gen Genet., 208(3): 457-463 24 Chilton, Tepfer, 1982 Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells Nature, 295: 432-434 25 Chow, Hsieh, Chang, 1982 In vitro propagation of Anoectochilus formosanus J Sci Eng 19: 155- 165 (in Chinese) 26 Christophe Maurel, Helene Barbier-Brygoo, Angelo Spena, Jacques Tempe, and Jean Guern, 1991 Single rol Genes from the Agrobacterium rhizogenes TL-DNA Alter Some of the Cellular Responses to Auxin in Nicotiana tabacum 97: 212-216 27 Dodds, Roberts, 1985 Experiments in Plant Tissue Culture 2nd Ed Cambridge University Press, Cambridge 28 Edwin 1993, Plant Propagation by Tissue Culture, Exegetics Limited, Part 29 Gupta, Liu, Liaw, Chan , Tsay, 2011 Enhanced tanshinone production in hairy roots of ‘Salvia miltiorrhiza Bunge’ under the influence of plant growth regulators in liquid culture Botanical Studies, 52: 435-443 57 Đồ án tốt nghiệp 30 Hahn Van Kiet Nguyen, 2004 Effect of Environmental Conditions on in vitro and ex vitro growth of Jewel Orchid Anoectochilus formosanus Hayata, Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy in Agriculture, The Graduate School of Chungbuk National University 31 Hao, Ji, Li, Shi R, Wang, Feng, Huang, 2012 Exogenous ABA and polyamines enhanced salvianolic acids contents in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba Plant Omics Journal, 5(5): 446-452 32 Kim, Lee, Park, 2008 Resveratrol production in hairy root of peanut, Arachis hypogaea L transformed with defferent Agrobacterium rhizogenes strains Afr J Biotechnol., 7: 3788-3790 33 Jouanin, Guerche, Pamboukdjian, Tourneur, Casse-Delbart, Tourneur, 1987 Structure of T-DNA in plants regenerated from roots transformed by Agrobacterium rhizogenes strain A4 Mol Gen Genet., 206: 387-392 34 Meyer, Tempe, Costantino, 2000, Hairy root; a molecular overview Functional analysis of Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes In: Stacey G, Keen NT, eds Plant Microbe Interactions St Paul: APS Press: 93-139 35 Narayaswamy, 1994 Plant cell and tissue culture Tata McGraw-Hill Education 36 Nilsson, Olsson, 1997 Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots Physiol Plant, 100: 463- 473 37 Ramachandra Rao, Ravishankar 2002 Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites Biotechnol Adv 20: 101-153 38 Riker et al 1930, Rhizobium rhizogenes, Young et al 2001 39 Salez, Sánchez, Piqueras, 1994, Micropagation of Thymus piperella, Plant Cell Tiss, 39:269–272 58 Đồ án tốt nghiệp 40 Shi, Kintzios, 2003 Genetic transformation of Pueraria phaseoloides with Agrobacterium rhizogenes and peurarin production in hairy root Plant Cell Rep, 21: 1103-1107 41 Smith, Townsend 1907 "A Plant-Tumor of Bacterial Origin" Science 25 (643): 671–673 Tài liệu từ internet 42 https://www.khcnthainguyen.vn/portals/0/ThongtinKHCN/11_7_2014 43 https://www.slideshare.net//pada180490/vaccine-thc-vt-nhm-6 44 https://www.botanyvn.com 59 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Thành phần môi trường Bảng Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Khoáng đa lượng Khoáng vi lượng Các vitami chất hữu c Đồ án tốt nghiệp Bảng Thành phần môi trường YMB Phụ lục B: Bảng số liệu xử lý phần mềm SAS Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên tái sinh chồi lan kim tuyến The ANOVA procedure Dependent variable: TYLETAISINHCHOI Source Model Error Corrected Total Source NTHUC Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for TYLETAISINHCHOI Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NTHUC A 98.790 NT2 A B A93.050 NT1 B B86.417 NT3 The ANOVA procedure Dependent variable: SOCHOI Source Model Error Corrected Total Source NTHUC Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for SOCHOI Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B C The ANOVA procedure Dependent variable: CHIEUCAOCHOI Source Model Error Corrected Total Source NTHUC Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for CHIEUCAOCHOI Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NTHUC A 2.0333 NT2 A B A1.6467 NT3 B B1.4067 NT1 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến The ANOVA procedure - Dependent variable: SOCHOI Source Model Error Corrected Total Source NTHUC Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for SOCHOI Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B B C The ANOVA procedure - Dependent variable: SOLA Source Model Error Corrected Total Source NTHUC Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for SOLA Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B B C Đồ án tốt nghiệp ... Blume) in vitro phục vụ cơng tác chuyển gen tạo rễ tóc” II Mục đích, nhiệm vụ phương pháp nghiên cứu Mục đích Đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học loài lan (Anotoecchilus setaceus Blume), chi Lan kim. .. nghiệp Tạo nguồn vật liệu in vitro làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc Nhiệm vụ Khảo sát ảnh hưởng NAA BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên nhân nhanh chồi. .. ưu lên tái sinh chồi nhân nhanh chồi lan kim tuyến Xác định nguồn mẫu (các mô hay quan lan kim tuyến) phù hợp cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Kết cấu