Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan kim tuyến kỹ thuật in vitro

NGUYỄN THỊ HẰNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI LAN KIM TUYẾN Anoectochilus roxburghii BẰNG KỸ TH

NGUYỄN THỊ HẰNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG

VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI

LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên, năm 2014

NGUYỄN THỊ HẰNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG

VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI

LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro”

Qua thời gian thực tập tại phòng nuôi cấy mô tại Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện khoa học sự sống, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đến nay

em đã hoàn thành đề tài Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa và các thầy cô Bộ môn Công nghệ Tế bào, cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp

đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình và ThS Lê Thị Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hằng

nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 24 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (1,5 mg/l) kết

hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

(sau 35 ngày nuôi cấy) 26 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l)

và Kinetine (0,3 mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),

Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với nước dừa đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),

Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với khoai tây đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (1,5 mg/l),

Kinetine (0,3 mg/l), NAA (0,3 mg/l) kết hợp với chuối xanh đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 31

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân

nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 27 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l) kết

hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau

35 ngày nuôi cấy) 29 Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l) và

Kinetine (0,3 mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 31 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),

Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với nước dừa đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 33 Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),

Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với khoai tây đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 35 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),

Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với chuối xanh đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 37

1.2 Mục đích của đề tài 1

1.3 Yêu cầu của đề tài 1

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây lan Kim Tuyến 3

2.1.1 Phân loại thực vật 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây lan Kim Tuyến 3

2.1.3 Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến 4

2.1.4 Giá trị của lan Kim Tuyến 5

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Lan Kim Tuyến trên thế giới và trong nước 14

2.3.1.Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến trên thế giới 14

2.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến ở Việt Nam 15

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 17

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 17

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17

3.2.2 Thời gian tiến hành 17

3.3 Hóa chất và thiết bị 17

3.3.1 Dụng cụ 17

3.3.2 Hóa chất 17

3.3.3 Thiết bị 17

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 24

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy) 24

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (1,5 mg/l) kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy) 26

4.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP 1,5 mg/l và Kinetine (0,3 mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy) 28

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng của khoai tây, nước dừa, chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 30

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP 1,5 mg/l, Kinetinen(0,3mg/l), NAA (0,3 mg/l) kết hợp với nước dừa đến khả năng nhân nha nh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy) 32

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng lượng BAP 1,5 mg/l, Kinetine (0,3 mg/l), NAA (0,3 mg/l) kết hợp với khoai tây đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy) 34

4.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP 1,5 mg/l, Kinetine (0,3 mg/l), NAA (0,3 mg/l), kết hợp với chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy) 30

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lan Kim Tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) thuộc họ Lan -

Orchidaceae, được phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh của Việt Nam [4] Chi Lan

Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall) Là một loại thảo dược

có giá trị dược liệu, Lan Kim Tuyến có khả năng chữa trị các bệnh ung thư, chống tăng huyết áp, lưu thông khí huyết, kháng khuẩn, làm thuốc trị lao phổi,

ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức xương khớp, viêm dạ dày mãn tính, viêm khí quản, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, v.v [4] Ngoài tác dụng chữa bệnh Lan Kim Tuyến còn được dùng làm cảnh [1]

Hiện nay với nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càng tăng Lan Kim Tuyến

đã bị thu hái nhiều đến mức cạn kiệt ngoài tự nhiên [1] Lan Kim Tuyến được

xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d

trong Sách đỏ Việt Nam (2007), phần thực vật [5], [4] Xuất phát từ tình hình

thực tiễn nhằm bảo tồn loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii việc

ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp hữu hiệu cho hệ số

nhân chồi cao, chất lượng tốt, độ đồng đều cao và giữ được các đặc tính di

truyền của cây mẹ

Xuất phát từ tính cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro”

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus

roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro

1.3 Yêu cầu của đề tài

Xác định ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin

và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

Xác định ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên khoai tây, nước dừa, chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

1.4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra kĩ thuật nhân nhanh chồi lan Kim

Tuyến bằng phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

Giúp sinh viên tiếp cận được với công tác nghiên cứu khoa học, qua đó nâng cao trình độ chuyên môn và tạo cho sinh viên có tác phong làm việc nghiêm túc, sáng tạo

- Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nhân giống lan Kim Tuyến nhằm cung cấp cây giống với số lượng lớn, có chất lượng đồng đều

đồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc

Bảo tồn được loại dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây lan Kim Tuyến

2.1.1 Phân loại thực vật

Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus roxburghii (Wall.) [4]

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây lan Kim Tuyến

Lan Kim Tuyến là cây thảo, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước mang 2-6 lá mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3,5-4,5 x 2,5-3,5 cm Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu

đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá

ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6-1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng

xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 5-20 cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa Mùa hoa nở tháng 9-12 Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau Hoa có cánh môi màu trắng Hai bên rìa mang từ 6-8 râu mỗi bên [10]

- Về mặt cấu tạo, Lan Kim Tuyến có các đặc điểm sau:

+ Thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài

Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm Đường kính thân rễ từ 4mm, trung bình là 3,17 mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông [10]

3-+ Rễ: Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình

thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ Số lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ trên một cây thường

từ 3-10 rễ, trung bình là 5,4 rễ Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình

của các rễ trên một cây là 3,82 cm [10]

+ Thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi

mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-6 cm, trung bình 5,4cm Đường kính thân khí sinh từ 2,5-3,5 cm, trung bình là 2,98 cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 3,6 Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 1,52 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng,

đôi khi có màu hồng nhạt [10]

+ Lá: Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần

tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3-4 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2-3 cm, trung bình là 3,12 cm Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên

và phủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi

rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6-1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ

lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ 2-6, thông thường có 4 lá Kích

thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau

rõ rệt [10]

+ Hoa: Cụm hoa dài 10-15 cm, mang 4-10 hoa mọc thưa Lá bắc hình

trứng, hoa thường màu trắng, dài 2,5-3 cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm, môi dài 1,5cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm màu lục có nhiều lông mềm [4], [10]

2.1.3 Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến

- Phân bố theo kiểu rừng: Lan Kim Tuyến hầu hết phân bố ở rừng kín lá rộng, rừng thường có cấu trúc 2 tầng cây gỗ [10]

- Phân bố theo trạng thái rừng: Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim Tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ khoảng 15-30%, độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0, 5m tuỳ từng khu vực Lan Kim Tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi, thảm tươi dày đặc Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ [10]

- Phân bố theo sinh cảnh: Lan Kim Tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm, độ xốp cao, thoáng khí, thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây trên các đoạn thân cây

gỗ mục, trong gốc cây Có thể bắt gặp Lan Kim Tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên

đường mòn đi lại trong rừng [10]

- Phân bố theo địa lý, địa hình: Phân bố ở hầu hết các dạng địa hình, như

chân núi, sườn núi, đỉnh núi [10]

- Phân bố theo đai cao: Lan Kim Tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735

m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970 m [10]

Ở Việt Nam, Lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm các tỉnh:

Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quảng Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kom Tum (Đắc Tô: Đăc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Thuận, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Đắk Lăk [4]

Thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan, Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [4]

2.1.4 Giá trị của lan Kim Tuyến

- Giá trị kinh tế

Hiện nay Lan Kim Tuyến ngoài tự nhiên đã bị thu hái đến mức cạn kiệt [16] do có rất nhiều tác dụng dược liệu và làm cây cảnh Giá bán trên thị trường thế giới của Lan Kim Tuyến khô là 3,200 USD/kg [27], cây tươi có giá từ 300-

320 USD/kg, nếu được thu hái trong tự nhiên, đặc biệt có nấm cộng sinh ở rễ thì giá này sẽ cao gấp 3 hoặc nhiều hơn nữa [16], [27] Cây giống Lan Kim Tuyến

có thể tạo từ nhân in vitro các mắt đốt thân, hạt giống và các bộ phận sinh dưỡng của cây Tuy nhiên sự sinh trưởng các của cây Lan Kim Tuyến in vitro chậm,

kéo dài thời gian nhân giống Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây Lan Kim

Tuyến từ nuôi cấy hạt in vitro Trung Quốc, Đài Loan, Nhật bản đã trồng và xuất

khẩu Lan Kim Tuyến mang lại nguồn thu lớn

- Giá trị dược liệu

Lan Kim Tuyến có rất nhiều tác dụng dược liệu do có chứa axit hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit, kinsenoside nên được sử dụng trong điều trị bệnh [27]

4-Theo y học cổ truyền Đài Loan, Lan Kim Tuyến tươi hoặc khô nấu nước uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, viêm thận [20], [24], sốt, huyết áp

cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách, tim, phổi [15], [16], [24], [25] Cây tươi sử

dụng để chữa các vết thương do rắn cắn [15], [27] Dịch chiết Lan Kim tuyến có

khả năng kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và sử dụng để chữa các bệnh về gan [23], [24], [18] chống khối u, ung thư và tính chống virus [17], điều trị bệnh tim mạch, chống loãng xương, chống mệt mỏi [25]

Gần đây, một hợp chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên thương mại là kinsenoside được chiết xuất từ Lan Kim Tuyến có tác dụng chống tăng huyết áp và bệnh tim mạch, tiểu đường [27] Lan Kim Tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr) đóng vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa, chuỗi polysaccharide nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người [18]

Cây Lan Kim Tuyến sau khi thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sản phẩm gồm thân, rễ và lá phơi khô để chế biến trà dược, thực phẩm chức năng, thạch Lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide

từ Lan Kim Tuyến để sản xuất biệt dược kinsenoside [27]

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường

dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [6] Nhân giống vô tính in vitro

được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn

rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của

ống nghiệm [3]

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống

vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những

ưu điểm như tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm; Chủ động sản xuất,

không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới [3]

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng[13]

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận

thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh

vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [13]

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng

của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [13]

Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy

mô tế bào thực vật Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6]

- Sự phân hóa và phản phân hóa

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của

mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm

vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng [6]

Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong

trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào [13]

Hình 2.1: Sơ đồ phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có

một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử acid deoxyribonucleic của mỗi

tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [6]

2.2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô [12]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [12]

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó, có ý nghĩa quyết định đến thành công trong nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử

lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất

Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng cấy và tủ cấy vô trùng, phòng nuôi cây [12]

- Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá

trình sinh trưởng của mô nuôi cấy

+ Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày Cường độ ánh sáng tác động

đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [12]

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo, ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000lux (Morein, 1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái

của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so

với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-

2500 lux, người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35-40 cm [12]

+ Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt

độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nhiều loài cây là 250

2.2.3.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên

cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp [12]

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực

vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục

đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như

trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1

lá mầm, 2 lá mầm Hay môi trường B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương [12] Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [3], [13]:

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Nguồn cacbon

Các vitamin và aminoacid

Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

Các chất điều hòa sinh trưởng

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ

là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein Ngoài ra, các nguyên

tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết cho hoạt động sống của tế bào [13]

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy

tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme [13]

Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật Ví dụ: K, Ca rất quan trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào [13]

- Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường có khả năng quang hợp

thấp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào [13]

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là

đường saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế

cho saccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật [13]

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường cần chú ý không nên kéo dài thời gian

để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa làm cho môi trường chuyển sang màu

vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào

- Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro

ở các loài khác nhau là khác nhau [13]

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin

cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino axít Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật Vitamin B3 và B6 cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [13]

- Các chất bổ sung

+ Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô là Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941) [23] Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [17]

Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau

đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh [17]

Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn [17]

Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi

+ Khoai tây

Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin như

trưởng và phát triển của mô, tế bào Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác [28] Nồng độ khoai tây thường sử dụng là 20mg/l [23]

+ Dịch chiết nấm men

Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g/l nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

+ Agar

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì

+ pH môi trường

Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của môi trường thường từ 5,6-6,0 [2] Nếu pH của môi trường thấp hơn 5,0 thì agar sẽ khó đông và cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng

- Các chất điều tiết sinh trưởng:

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

+ Auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều kiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4-diclophenoxy axit (2,4 D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá

trình hình thành rễ [1], [2], [6]

NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ Kết quả nghiên cứu của Butenco (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzyme và kích hoạt enzyme hoạt động Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin kích thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và các enzyme phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thay đổi tính thấm của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA kết dính vào màng tế bào làm

bào mềm và kéo dài ra do đó tê bào lớn lên và sinh trưởng Trong tế bào, NAA

có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [3]

Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây

+ Cytokinin

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia

tế bào Các cytokinin thường gặp là Kinetin, BA Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axit nucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn Kinetin Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian động của tế bào phân sinh và làm hạt chế sự hoá già của tế bào Ngoài

ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [3], [13], [14]

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin

và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của

tế bào và mô Những nghiên cứu của tác giả Skoog cho thấy tỷ lệ

auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát

triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai

đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và

Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển [3], [13], [14]

+ Gibberellin

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3 và A4 Do gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham

gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác [13]

Trong cây gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó

được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem

2.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Lan Kim Tuyến trên thế giới

và trong nước

2.3.1.Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến trên thế giới

Năm 2001, Yih-Juh Shiau và cs đã tiến hành phương pháp nhân giống hàng

loạt Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách thụ phấn chéo và nuôi cấy hạt

nảy mầm Sau khi thụ phấn số quả đậu đạt 86,7% Những hạt 7 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8% chuối trong 4 tháng Cây nảy mầm được nuôi cấy ở môi trường ½ MS chứa BA 2 mg/l trong bình nón 125 ml trong 2 tháng Trước khi tiến hành thụ phấn trong ống nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi được nuôi cấy trên môi trường ½

MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l [27]

Năm 2011, Lazarus Agus Sukamto và cs đã tìm ra môi trường nuôi cấy A

setaceus tốt nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A formosanus với TDZ là 0,5 mg/l Số lá

cao nhất của A.setaceus với TDZ 0,001 mg/l, còn A formosanus với hàm lượng

TDZ là 0,005 mg/l Số chồi cao nhất được tạo ra trên môi trường TDZ đối với

loài A setaceus là 0,01 mg/l còn với A formosanus là 0,05mg/l Số rễ cao nhất của A setaceus trên TDZ là 0,001 mg/l trong khi của A formosanus là 0,005

mg/l [20]

Năm 2012, N Ahamed Sherif và cs đã nghiên cứu thành công quy trình tái

sinh tạo cây hoàn chỉnh loài Anoectochilus elatus Lindley từ nguyên liệu ban

đầu là mắt đốt thân và chồi đỉnh Chồi phát triển tốt nhất ở nồng độ TDZ 3,0

mg/l và chiều dài chồi đạt cao nhất ở nồng độ Kinetine 3,5 mg/l với mắt đốt

thân, ở 0,01 mg/l đối với chồi đỉnh Anoectochilus elatus Lindley ra rễ 100% ở môi

trường có bổ sung than hoạt tính 0,3g/l [21]

Năm 2008, Yang Bai-yun đã nghiên cứu về loài Anoectochilus

roxburghii đã kết luận môi trường tốt nhất cho nhân nhanh protocom là MS +

BA 2,0 mg/l + NAA 0,2 mg/l cho hệ số nhân của 9,4 lần Môi trường ra rễ phù hợp nhất là 1/2 MS + NAA 0,2 mg/l + than hoạt tính 0,05% + agar 7g/l,

số rễ/cây đạt 4,4 rễ [26]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến ở Việt Nam

Năm 2009, Phùng Văn Phê và cs đã đưa ra kết quả nghiên cứu về đặc

điểm hình thái và phân bố của loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus

Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10]

Năm 2010, Phùng Văn Phê và cs tiến hành nghiên cứu kỹ thuật nhân

nhanh chồi in vitro loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl

Kết quả cho thấy: Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

in vitro là Knud Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ

2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud bổ sung BAP 0,5 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,3 mg/l + nước dừa 100 ml/l + dịch

chiết khoai tây 100 g/l + sucrose 20 g/l + agar 7 g/l + AC 0,5 g/l [9]

Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs đã tiến hành nghiên cứu kĩ thuật

nhân giống loài Lan Kim Tuyến in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý Kết quả

cho thấy: Cơ quan vào mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân được

khử trùng và đưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson) Sau

đó, các chồi và mắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung

BA, Kinetin, αNAA trong 4 tuần Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud + BAP 0,5 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l + αNAA 0,3m g/l + sucrose 20 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + agar 7 g/l cho hệ số nhân chồi

là 6,55 chồi/mẫu Các chồi có chiều cao từ 3-4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro

Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có

bổ sung αNAA 1 mg/l [11]

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nuôi cấy là giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghi)

đang trong giai đoạn nhân nhanh ở phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Tế

bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus

roxburghii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện khoa học Sự

sống, Đại học Nông LâmThái Nguyên

3.2.2 Thời gian tiến hành

Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014

3.3 Hóa chất và thiết bị

3.3.1 Dụng cụ

- Micropipette 200µl

- Đầu côn vô trùng

- Pank, dao, kéo, đĩa cấy

- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, Kinetine, NAA

- Chất hữu cơ tự nhiên: Khoai tây, nước dừa, chuối xanh

3.3.3 Thiết bị

- Máy đo pH

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh

trưởng (BAP, Kinetin, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

(Anoectochilus roxburghii)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP tốt nhất kết hợp với Kinetin

đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP và Kinetin tốt nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên

(khoai tây, nước dừa, chuối xanh) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu

3.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một

số chất kích thích sinh trưởng (BAP, Kinetin, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii)

- Cách tiến hành

Chồi tái sinh từ mẫu cấy khoảng 4-6 tuần sinh trưởng và phát triển bình thường có đầy đủ thân, lá được sử dụng làm mẫu cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh

Sử dụng dao đã khử trùng cắt lấy đoạn chồi có chiều dài từ 1,5-2 cm, dùng

pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi cấy vào môi trường nhân nhanh

Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều Sau khi cấy xong các bình này được đưa vào phòng nuôi Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường)

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng

nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi

bình cấy 5 chồi Thí nghiệm được bố trí như sau:

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP tốt nhất kết

hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi bình cấy 5 chồi Kinetine và A (nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến xác định ở thí nghiệm 1) được bổ sung vào môi trường nền với các nồng độ sau:

Nồng độ BAP và kinetine thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

ở thí nghiệm 2 (kí hiệu B) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine tốt

nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 6

công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi bình cấy 5 chồi NAA được bổ sung vào môi trường nền và B ( nồng độ BAP và kinetine thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến được xác định ở thí nghiệm 2)

Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi

Ghi chú: Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20 g/l + agar 6 g/l + Inositol 0,1 g /l, pH = 5,7

Nồng độ BAP, kinetine và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ở thí nghiệm 3 (kí hiệu C) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.4.2.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên (khoai tây, nước dừa, chuối xanh) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii)

- Cách tiến hành: như nội dung 1

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine,

NAA tốt nhất kết hợp với nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi bình cấy 5 chồi Nước dừa được bổ sung vào môi trường nền và C (nồng độ BAP, Kinetinen, NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến được xác