Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực : Trịnh Thị Cẩm Tú MSSV: 1211100227 Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu , kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thơng tin trích dẫn Đồ án rõ nguồn gốc Học viên thực đồ án Trịnh Thị Cẩm Tú i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hồn thành tốt khóa học 2012 – 2016 Em xin cảm ơn thầy Khoa CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG tận tình dạy truyền đạt cho em kiến thức quan trọng tạo tảng kiến thức vững để hoàn thành tốt Đồ án sau ứng dụng vào công việc thực tiễn Em xin cảm ơn thầy phụ trách phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Và em gửi lời cảm ơn đến bạn khóa tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần , trải qua khó khăn suốt trình thực Đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình ln bên cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo điều kiện để hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp TP HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thục Trịnh Thị Cẩm Tú ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại hạt 1.1.1Tình trạng nhiễm nấm g 1.1.2Tình trạng nhiễm nấm tr 1.1.3Tình trạng nhiễm nấm s 1.1.4Độc tố nấm 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản 1.2.1Kháng nấm phươn 1.2.2Kháng nấm phươn 1.3 sản Một số vi sinh vật điển hình có khả đối kháng nấm 1.3.1Nấm Trichoderma spp 1.3.2Lactobacillus spp 1.3.3Bacillus subtilis spp 1.4 Cơ chế kháng nấm vi khuẩn 1.4.1Cấu tạo thành tế bào củ 1.4.2Cơ chế tác động mộ 1.4.3Cơ chế kháng nấm 1.4.4Một số phương pháp th khuẩn 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao bảo quản hạ 1.6 Một số nghiên cứu nước ứng dụng hợp chất thứ cấ 1.7 Một số nghiên cứu nước ứng dụng hợp chất thứ cấp iii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.2.1Vật liệu 2.2.2Thiết bị dụng cụ 2.2.3Môi trường - Hóa chất 2.3Phương pháp nghiên cứu 2.3.1Mục đích 2.3.2Mục tiêu 2.3.3Nội dung 2.4Bố trí thí nghiêm phương pháp 2.4.1Khảo sát khả đối kh 2.4.2Ứng dụng sản phẩm trao quản hạt CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp CĐP1 làm cảm ứ cho vi khuẩn Bacillus sp CS1b 3.2Xác định thời gian nuôi cấy để khả đối kháng nấm 3.2.1Dịch nuôi cấy sau ly tâm 3.2.2Dịch nuôi cấy sau ly tâm 3.2.3So sánh khả đối kh dịch nuôi cấy CS1b thời gian nuôi cấy điều kiện xử lý nhiệt 3.3Khảo sát khả đối kháng nấm protein kết tủa từ CS1b sau ly tâm 3.3.1Quy trình thu hồi protein 3.3.2Định tính enzyme protea 3.3.3Khảo sát khả đối protein kết tủa với CĐb1 3.4Khảo sát khả đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1 3.4.1Quá trình thu cao EA iv Đồ án tốt nghiệp 3.4.2 Khảo sát ức chế cao EA với nấm CĐP1 61 3.5 Khảo sát thành phần hóa học sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Bacillus sp CS1b có hoat tính kháng nấm 64 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1 Kết luận 76 4.2 Kiến nghị 76 TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC 78 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 78 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar EA: ethyl acetate NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MT: Môi trường PDA: Potato dextrose agar HPLC: High pressure liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography UV: Ultraviolet VK: vi khuẩn vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ảnh hưởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật nuôi Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin đường sinh học 13 Bảng 1.3: Các thành phần thành tế bào số nấm 22 Bảng 1.4: Cơ chế tác động mộ số hợp chất thứ cấp 26 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng .47 Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1 53 Bảng 3.2: Đường kính phân giải enzyme protein kết tủa ethanol 56 Bảng 3.3: Khả đối kháng với CĐP1 protein kết tủa ethanol 58 Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo nồng độ cao ethyl acetate với nấm CĐP1……………………………………………………………………………….63 Bảng 3.5: Định tính số chất có dịch sau ly tâm, protein kết tủa cao ethyl acetate 63 Bảng 3.6: Khả ức chế nấm mốc vi khuẩn phát triển hạt đậu phộng bao màng chitosan sản phẩm trao đổi chất CS1b 66 Bảng 3.7:Kết ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng……………… 71 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả kháng nấm CĐP1 dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm .36 Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1 .37 Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa ethanol 96 40 Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA 42 Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng màng bao chitosan .46 Hình 3.1: Nấm CĐP1 mơi trường PDB 49 Hình 3.2: Kết đối kháng dịch sau ly tâm VK CS1b với nấm CĐP1 51 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả đối kháng nấm CĐP1 dịch nuôi cấy CS1b thời gian nuôi cấy điều kiện xử lý dịch sau ly tâm 54 Hình 3.4: Khả phân giải chitin protein kết tủa 56 Hình 3.5: Khả phân giải casein protein kết tủa 57 Hình 3.6 Khả phân giải protein kết tủa…………………… 57 − Hình 3.7: Khả ức chế nấm mốc CĐP1 dung dịch protein kết tủa……… 59 Hình 3.8: Khả đối kháng nấm CĐP1 cao EA…………………………….61 Hình 3.9: : Khả đối kháng nấm CĐP1 cao EA, 62 Hình 3.10: Định tính số chất có dịch ni cấy ly tâm (i), protein kết tủa (ii),……………………………………………………… 64 Hình 3.11: Định tính lipid .65 Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1………………………………… 72 Hình 3.13: Quy trình cơng nghệ sản xuất cao EA………………………………….73 viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lương thực, thực phẩm đặc biệt nơng sản thóc, gạo, ngơ, khoai, sắn, đậu, đỗ lạc nguồn lượng ni sống lồi người Vì thế, việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản vấn đề tổ chức quốc tế quan khoa học lương thực, thực phẩm giới đặc biệt quan tâm Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm kỹ thuật bảo quản gìn giữ giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn chất độc hại nhiễm nông sản đó, đồng thời chế biến nơng sản thành thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phần cần thiết ngành nông nghiệp nước ta Độc tố aflatoxin chủ yếu loài vi nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus tạo ra, độc tố nguy hiểm thường nhiễm nông sản, gây độc cho người gia súc, gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao dẫn tới tử vong Trong nhiều loại aflatoxin tự nhiên aflatoxin B1 coi chất độc nguy hiểm Mặc dù diện Aspergillus flavus lúc gắn liền với việc tồn aflatoxin với hàm lượng gây độc, thể nguy lớn việc nhiễm aflatoxin Ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm khơng khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa, phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khơ ráo, thống mát điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc cho thực phẩm thức ăn chăn nuôi Khi phát triển lương thực nấm mốc sử dụng chất dinh dưỡng gây tổn thất lượng chất hạt Không thế, số loài nấm mốc phát triển sinh loại độc tố khác gọi chung mycotoxin Đồ án tốt nghiệp Sinh khối CĐP1 1% Môi trường NB1(hấp khử trùng 121 C, 15phút) Cấy giống CS1b (1%) Làm nguội (30 C) Nuôi cấy (150 vòng/phút 24 giờ, 30 C) Ly tâm (4000v/p, 20 phút) Dịch sau ly tâm Na2SO4 Trích ly với ethyl acetate Tỉ lệ 1:1 lập lại lần Pha hữu nước Lọc Pha hữu DMSO % Bay 50 C thu cắn Xác định khối lượng (mg) Cao EA DMSO 5% (mg/ml) 75 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sau khảo sát khả đối kháng với nấm CĐP1 dịch sau ly tâm từ canh trường nuôi cấy VK CS1b thời gian điều kiện xử lý nhiệt thời gian 24 nuôi cấy không xử lý nhiệt cho kết đối kháng tốt 60,1 % Trong protein kết tủa từa dịch nuôi cấy sau ly tâm 24 có hoạt tính enzyme protease, chitinase khơng cịn beta – glucanase Nhưng khả đối kháng với nấm CĐP1 chưa xác định hoạt tính enzyme có protein kết tủa hay không Khả đối kháng cao EA với nấm CĐP1 phương pháp đục lỗ thạch cho tỷ lệ gần với đối chứng DMSO %, phương pháp sử dụng cao EA đun 70 1C bổ sung 10 % vào mơi trường PDA cho kết cao EA thu dịch nuôi cấy sau 24 có khả làm màu bào tử CĐP1 rõ rệt Trong cao ethyl acetate lipid, nhiên lipid không bổ sung vào môi trường nên sản phẩm vi khuẩn Kết khảo sát ảnh hưởng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lên phát triển nấm hạt đậu phộng tạo màng bao với chitosan 0,2 % cho thấy sử dụng cao ethyl acetate để ngăn nảy mầm nấm CĐP1 cấy vào đậu phộng với mật độ 10 bào tử/g ngăn nhiễm nấm mốc vi khuẩn từ môi trường đến sau 12 ngày bảo quản 4.2 Kiến nghị Qua khảo sát thấy cao EA thực có tiềm ức chế nấm mốc in vitro in vivo Nhưng hợp chất có cao EA có khả ức chế nấm mốc chưa xác định Vì chúng tơi kiến nghị: 76 Đồ án tốt nghiệp Tiến hành phương pháp định tính HPLC/MS để xác định rõ chất có cao EA Khảo sát dung mơi trích ly khác để thu hợp chất kháng nấm tốt Ứng dụng quy trình cơng nghệ vào sản xuất cao EA vào sử dụng cao EA để bảo quản nông sản 77 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC TÀI LIỆU KHAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, (2002) Thức ăn dinh dưỡng động vật NXB nông nghiệp [2] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp [3] Đỗ Tuyết Mai Nguyễn Văn Hương (2015) “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng bảo quản nông sản” Luận văn tốt nghiệp Đại học Công Nghệ TP.HCM [4] Huỳnh Văn Phục (2006) Khảo sát tính đối kháng Trichoderma spp Rhizoctonia solani Kühn lúa bắp Bước đầu khảo sát Fusarium oxysporum gây bệnh thối thân bắp [5] Lê Thanh Huân (2011) Phân lập, tuyển chọn đánh giá tiềm sử dụng proboitic chủng Lactobacillus phân lập cá chim vây vàng [6] Phạm Hoàng Thái (2007) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập Luận án tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh [7] Bùi Thị Hồng Gấm (2009) Thu nhận tinh chế enzyme Luận án tốt nghiệp Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Thanh Nhật (2015) Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi phương pháp lên men lactic Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Công Nghệ TP.HCM 78 Đồ án tốt nghiệp Tài liệu tiếng anh [1] Christensen, R.B.A Hartlay, R D, and Okelley, J Toxicity va fluorescence properties of the aflatoxin, Nature (lond), 200:1101 [2] Mahmoud A Ghannoum, and Louis B Rice(1999) Antifungal Agents: Mode of Action, Mechanisms of Resistance, and Correlation of These Mechanisms with Bacterial Resistance [3] Anthony J De Lucca and Thomas J Walsh (1999) Antifungal peptides: Novel therapeutic compounds against Emerging Pathogens [4] Muhammad Abdul Mojid Mondol, Hee Jae Shin, and Mohammad Tofazzal Islam (2013) Diversity of Secondary Metabolites from Marine Bacillus Species: Chemistry and Biological Activity [5] Ting Zhang, Zhi-Qi Shi, Liang-Bin Hu, Luo-Gen Cheng, Fei Wang (2007) Antifungal compounds from Bacillus subtilis B-FS06m inhibitingthe growth of J Aspergillus flavus World MicrobiolBiotechnol (2008) 24:783–788, DOI 10.1007/s11274-007-9533-1 [6] Md Rezuanul Islam ctv (2012) Isolation and Identification of Antifungal Compounds from Bacillus subtilis C9 Inhibiting the Growth of Plant Pathogenic Fungi [7] Mohsen Farzaneh ctv (2016) Inhibition of the Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin B1 Contamination on Pistachio Nut by Fengycin and Surfactin-Producing Bacillus subtilis 79 UTBSP Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG VÀ TÍNH CHẤT VẬT LIỆU SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A1 Thành phần môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) D – glucose Agar Dịch chiết khoai tây A2 Thành phần môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) D – glucose Dịch chiết khoai tây Lưu ý: - Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, cho thêm vào 1000 ml đun sôi 30 phút, thu dịch chiết định mức lên 1000 ml Bảo quản tủ mát chưa sử dụng - Khi ni cấy nấm mốc, bổ sung Chloramphenicol vào thành phần môi trường với tỉ lệ 0.02% Đồ án tốt nghiệp A3 Thành phần môi trường Nutrient Broth (NB) Peptone Meat extract NaCl Nước cất A Thành phần môi trường Nutrient Broth_1 (NB1) Peptone Meat extract NaCl Nước cất A Thành phần môi trường Casein 1% Môi trường Casein Agar Casein Đệm phosphate (pH=7) Đồ án tốt nghiệp A Thành phần môi trƣờng Chitin 1% Môi trường Chitin Agar Chitin Đệm phosphate (pH=7) Lưu ý: - Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hòa vào 100ml HCl đậm đặc Khuấy 10 phút Sau cho từ từ nước cất làm lạnh đến 500ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa Để qua đêm ngăn mát tủ lạnh Huyền phù rửa cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dich có pH = đến huyền phù đạt pH = Bảo quản huyền phù tủ mát A Thành phần môi trường β - glucan 1% Môi trường β – glucan Agar β - glucan Đệm phosphate (pH=7) A Tình chất chitosan cơng ty Hùng Tiến Cần Thơ Độ hòa tan 1% acetic acid : (87,6 0,72) % Khối lượng phân tử : (576350 3835,34) Da Độ deacetyl hóa: (97,4 0,24) % Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình B.1: Kết thử nghiệm khả bảo quản nước cất, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.2: Kết thử nghiệm khả bảo quản chitoosan, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Đồ án tốt nghiệp Hình B.3: Kết thử nghiệm khả bảo quản DMSO %, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.4: Kết thử nghiệm khả bảo quản Nystatin, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Đồ án tốt nghiệp Hình B.5: Kết thử nghiệm khả bảo quản sinh khối CS1b NB1, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.6: Kết thử nghiệm khả bảo quản sinh khối CS1b NB, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Đồ án tốt nghiệp Hình B.7: Kết thử nghiệm khả bảo quản dịch sau ly tâm, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.8: Kết thử nghiệm khả bảo quản dịch sau ly tâm xử lý 100 C, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Đồ án tốt nghiệp Hình B.9: Kết thử nghiệm khả bảo quản canh trường CS1b NB, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.10: Kết thử nghiệm khả bảo quản canh trường CS1b NB1, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Đồ án tốt nghiệp Hình B.11: Kết thử nghiệm khả bảo quản cao EA, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày ... Để áp dụng “ bảo quản sinh học” việc bảo quản hạt nông sản, sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường áp dụng Đó lý chúng tơi chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin Bacillus. .. spp (CS1b) ứng dụng bảo quản nông sản” Mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu Khảo sát khả đối kháng nấm sinh aflatoxin sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp CS1b ứng dụng. .. xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt 2.3.2 Mục tiêu Khảo sát khả đối kháng nấm sinh aflatoxin sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp CS1b ứng dụng việc bảo quản hạt đậu phộng