Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG VÀ ĐẤT CANH TÁC Ở VŨNG TÀU Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm Sinh viên thực MSSV: 1151110125 : Trần Thị Ngọc Hạnh Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM nói chung anh chị cơng tác phịng Vi sinh nói riêng, tạo điều kiện cho em tham gia làm đồ án tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn Thị Thùy Dương trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm trình làm đồ án tốt nghiệp em Trung tâm Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM quý thầy cô tận tình giảng dạy cung cấp kiến thức cần thiết, bổ ích để chúng em hồn thành tốt trình học tập Cuối em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đồng hành ủng hộ em suốt trình XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN TP.HCM, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên thực Trần Thị Ngọc Hạnh Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu cá nhân Các kết số liệu đồ án trung thực Ngƣời cam đoan Trần Thị Ngọc Hạnh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Vòng đời 1.1.3 Cấu tạo trứng tuyến trùng 1.1.4 Cấu tạo thành thể tuyến trùng 1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Điều kiện sống 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng 1.2.5 Khả tiết enzyme ngoại bào 1.2.6 Độc tố P lilacinum 10 1.2.7 Q trình kí sinh 11 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu 12 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 12 2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 12 2.2.3 Hóa chất 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase nấm P lilacinum 16 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả xâm nhập trứng tuyến trùng Meloidogyne spp nấm P lilacinum 18 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 19 i Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào chủng nấm P lilacinum 20 3.1.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào protease 20 3.1.2 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase chủng nấm P lilacinum 26 3.2 Kết khảo sát khả ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum 30 3.2.1 Kết khảo sát khả ký sinh trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum 31 3.2.2 Kết khảo sát khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp 36 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu 12 Bảng 3.1 Vòng phân giải casein chủng nấm phân lập từ đất rừng Vũng Tàu khoảng thời gian khác 20 Bảng 3.2 Vòng phân giải casein chủng nấm phân lập từ đất canh tác Vũng Tàu khoảng thời gian khác 22 Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 25 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin chủng nấm phân lập từ đất rừng Vũng Tàu theo khoảng thời gian khác 26 Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin chủng nấm phân lập từ đất canh tác Vũng Tàu theo khoảng thời gian khác 27 Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 30 Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu 32 Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 35 Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu 36 Bảng 3.10 Mức độ ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 38 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Vịng phân giải casein trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu theo thời gian 24 Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu theo thời gian 29 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập đất rừng đất canh tác khoảng thời gian khác 34 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh Meloidogyne spp trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác khoảng thời gian khác 37 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vòng đời tuyến trùng ký sinh thực vật Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng Meloidogyne sp Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy môi trường PDA Hình 1.4 Hình thái quan mang bào tử bào tử nấm P lilacinum Hình 1.3 Cấu tạo hóa học độc tố paecilotoxin 11 Hình 3.1 Vịng phân giải casein chủng PB 2.10 khoảng thời gian 24 giờ; 48 72 21 Hình 3.2 Vịng phân giải casein chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 48 21 Hình 3.3 Vòng phân giải casein chủng KL 5.3 KL 6.2 KL 5.2 72 24 Hình 3.4 Vòng phân giải casein chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác sau 24 , 48 giờ, 72 25 Hình 3.5 Vòng phân giải chitin chủng PB 3.3 sau 24 , 48 , 72 27 Hình 3.6 Vòng phân giải chitin chủng HT 5.1 sau 24 , 48 giờ, 72 29 Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh 33 Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh hình dạng ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, bị kí sinh 37 v Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT Khảo sát khả tiết enzyme ngoại bào 38 chủng nấm Purpureocillium lilacinum phương pháp đo vịng phân giải chất mơi trường thạch Sau thử nghiệm, chọn lọc chủng nấm tiêu biểu có khả tiết enzyme ngoại bào protease chitinase mạnh để thử nghiệm khả ký sinh khối trứng Meloidogyne spp trực tiếp đĩa Petri Kết quả, tất chủng nấm Purpureocillium lilacinum có khả tiết enzyme ngoại bào khả tiết enzyme protease mạnh so với chitinase Đối với enzyme chitinase, đường kính vịng phân giải chất tối ưu đạt sau 48 Các chủng có khả phân hủy chitin mạnh PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2 KL 5.3 Đối với enzyme protease chủng nấm khảo sát có khả tiết mạnh sau 72 Các chủng có khả phân hủy casein mạnh PB 2.10, PB 1.3, KL 5.3 KL 6.2 Khơng có khác biệt mặt thống kê khả tiết enzyme ngoại bào chủng nấm phân lập từ đất rừng đất canh tác Kết thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 ký sinh Meloidogyne spp nhanh mạnh so với khối trứng vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Tuyến trùng ký sinh thực vật gây thiệt hại đáng kể mặt kinh tế nhiều loại trồng có giá trị thương nghiệp Hàng năm, tuyến trùng gây tổn thất 11% suất loại ngũ cốc, rau ăn lá, chuối, khoai mì, dừa, khoai tây, củ cải đường, mía đường, khoai lang, làm giảm 15% suất loại trồng kinh tế quan trọng (Agrios, 2005) Ở Việt Nam, năm gần đây, tuyến trùng phát triển mạnh gây tác hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp nhiều vùng, đặc biệt rau loại cơng nghiệp có hồ tiêu Cây hồ tiêu cơng nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế, trồng nhiều nơi có giá trị xuất cao giới Diện tích đất canh tác Vũng Tàu chiếm 9047 ha, có khoảng gần 0,5% diện tích đất trồng bị nhiễm bệnh nguyên nhân tuyến trùng gây nên.Việc dùng thuốc hóa học để tiêu diệt tuyến trùng hại thực vật kéo theo tác động tiêu cực đến mơi trường an tồn sức khỏe cho người vật ni Bên cạnh đó, cịn tăng tính kháng thuốc sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngày khó khăn Vì vậy, người ta tìm kiếm tác nhân sinh học để sử dụng thay phần hoàn toàn thuốc hóa học kiểm sốt tuyến trùng gây hại Do việc nghiên cứu tìm chủng nấm có khả ký sinh tuyến trùng vấn đề quan tâm Nấm Purpureocillium chứng minh có khả ký sinh tuyến trùng hiệu sống hoại sinh vùng rễ nhiều loại trồng Chúng nghiên cứu từ lâu giới Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phân lập hay xác định khả ký sinh tuyến trùng nấm Purpureocillium hạn chế đặc biệt chủng nấm phân lập vùng Đông Nam Bộ Do đó, năm 2014, Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Tp Hồ Chí Minh xác định phân bố nấm hệ sinh thái đất (đất tự nhiên-đất rừng, đất canh tác-đất trồng) vùng Kết cho thấy nấm xuất hầu hết vùng, có hệ sinh thái rừng ngập mặn Vũng Tàu Việc xác định khả tiết enzyme ngoại bào ký sinh tuyến trùng chủng nấm cần thiết giúp ích việc kiểm Đồ án tốt nghiệp C C C C C Ngày Class T Number of Observations Read Number of Observations Used R-Square 0.591563 Source DF T Means with 28 Đồ án tốt nghiệp B Ngày Class T Number Number R-Square 0.586999 Source DF T Means w 29 Đồ án tốt nghiệp D D D D D Ngày Class T Number of Observations Read Number of Observations Used R-Square 0.604516 Source DF T Means with B B B B B B B 30 Đồ án tốt nghiệp D D D D D Ngày R-Sq 0.59 Source DF T 31 Đồ án tốt nghiệp D D D D D Ngày 10 Source T Means with the same letter are not signifi 32 Đồ án tốt nghiệp B B B B B Ngày 11 Source DF T Means with 33 Đồ án tốt nghiệp C C C C C Ngày 12 Source DF T 34 Đồ án tốt nghiệp B B B B B Ngày 13 Class T Number of Observations Read Number of Observations Used R-Square 0.578880 Source DF T Means w 35 Đồ án tốt nghiệp Number of Observations Used Source T Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different 36 Đồ án tốt nghiệp B B B B B Phụ lục B.2: Khả ký sinh chủng nấm P lilacinum Bảng số liệu thô tỷ lệ ký sinh(%) TỶ LỆ KÝ SINH TRÊN CON CÁI (%) STT T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Kết xử lý thống kê tỷ lệ ký sinh theo ngày T: Tên chủng Ngày Source DF T 37 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of Least Significant Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B B Ngày Class T Number of Observations Read Number of Observations Used R-Square 0.551855 Source T Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 38 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of Least Significant Means with the same letter are not significantly different t Grouping B B B B B B B B B D B D B D D D D D Ngày Source T 39 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping B B B B B B B B B B B B B Ngày Source T 40 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of Least Significant Means with the same letter are not significantly different B B B B B B B B B B B B B B B 41 ... - Khảo sát so sánh khả tiết enzyme ngoại bào protease chitinase chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu - So sánh khả xâm nhập khối trứng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum. .. trăm số chủng tiết enzyme mức độ yếu đất canh tác so với đất rừng Ở 72 giờ, hầu hết chủng phân lập đất rừng có khả tiết enzyme khơng có chủng tiết enzyme yếu Trong đó, khả tiết enzyme ngoại bào chủng. .. spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu 36 Bảng 3.10 Mức độ ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu