Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở e coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Huyền NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thu Huyền NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E COLI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Thọ Sơn TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh Hà Nội - 2019 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian học tập nghiên cứu môn Di truyền học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN hành trang q báu giúp em trưởng thành có ích sống Lời em xin cảm ơn thầy cô môn Di truyền học với tri thức tâm huyết để truyền đạt kiến thức chun mơn cho chúng em Thầy cô quan tâm chúng em có mơi trường học tập tồn diện gần gũi Em coi môn Di truyền ngơi nhà thứ hai Tiếp theo, em xin cảm ơn hai thầy cô TS Lê Thọ Sơn TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh đồng ý hướng dẫn cho em luận văn tốt nghiệp Thầy khơng động viên em q trình học tập mà cho em nhiều lời khuyên sống Em xin gửi lời cảm ơn trìu mến tới gia đình bạn bè, người ln tin tưởng, hỗ trợ dìu dắt em suốt thời gian qua Đặc biệt bố, mẹ người hy sinh thầm lặng cho sống em Sau cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Văn Sáng Thầy cho em có hội hồn thành luận văn tốt nghiệp Thầy động lực để em phát triển cố gắng ngày Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN.02-2016.58 Nghiên cứu có hợp tác hỗ trợ cung cấp trình tự gen mã hóa bới Cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Thu Huyền i Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU vii CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát DNA polymerase 1.1.1 Phân loại DNA polymerase 1.1.2 Cấu trúc chức DNA polymerase 1.1.3 Quá trình chép DNA 1.2 Ứng dụng DNA polymerase 1.2.1 Kỹ thuật giải trình tự 1.2.2 Kỹ thuật PCR 1.3 Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase 1.3.1 Phân loại nguồn gốc 1.3.2 Nghiên cứu biểu Pwo DNA polymerase tái tổ hợp 1.3.3 Các đặc tính quan trọng DNA polymerase dùng cho PCR 1.4 Công nghệ protein tái tổ hợp 10 1.4.1 Tổng hợp gen, tối ưu mã codon 10 1.4.2 Nhân dịng gen đích vào vector mong muốn 11 1.4.3 Biểu protein tái tổ hợp 12 1.4.4 Các phương pháp tinh protein tái tổ hợp 16 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên vật liệu 19 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 19 2.1.3 Hóa chất môi trường 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase 21 ii Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu 2.2.2 Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase 22 2.2.3 Biểu protein Pwo DNA polymerase E coli 27 2.2.4 Tinh protein Pwo DNA polymerase 27 2.2.5 Xác định hoạt tính protein Pwo DNA polymerase 30 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp 33 3.2 Nhân dịng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase 34 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo 34 3.2.2 Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) .35 3.2.3 Tách plasmid, kiểm tra trình tự 36 3.3 Biểu protein Pwo DNA polymerase vi khuẩn E coli 38 3.4 Tinh protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase 38 3.4.1 Phương pháp tinh sắc ký lực nickel 39 3.4.2 Phương pháp tinh kết tủa muối ammonium sulfate 43 3.5 Xác định hoạt tính protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase 44 3.5.1 Tối ưu thành phần buffer PCR 44 3.5.2 Hoạt tính chép 45 3.5.3 Khả chịu nhiệt độ cao 47 3.5.4 Hoạt tính có mặt chất ức chế 47 CHƯƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 iii Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sự đa dạng cấu trúc số loại DNA polymerase Hình 2: Thành phần phức hệ chép DNA (replisome) vi khuẩn Cổ .3 Hình 3: Cây phát sinh nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho DNA polymerase Hình 5: Sơ đồ minh họa bước tổng hợp gen phương pháp POS 10 Hình 6: Thiết kế mồi nhân dịng gen mã hóa protein Pwo-pol 12 Hình 7: Cấu trúc vector biểu protein tái tổ hợp E coli 15 Hình 8: Sơ đồ mơ tả q trình nhân dịng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo .22 Hình 9: Sơ đồ trình tinh protein Pwo-pol 27 Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol xử lý enzyme cắt giới hạn 34 Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo .35 Hình 12: Tách chiết kiểm tra plasmid tái tổ hợp 36 Hình 13: So sánh trình tự amino acid gen mã hóa Pwo DNA polymerase 37 Hình 14: Biểu protein DNA polymerase E coli 38 Hình 15: So sánh phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao 39 Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sắc ký lực 40 o Hình 17: Tinh sắc ký lực kết hợp xử lý nhiệt độ 70 C 41 o Hình 18: Tinh sắc ký lực kết hợp xử lý nhiệt độ 95 C 42 o Hình 19: Tinh kết tủa muối AS bão hòa C 43 Hình 20: Ảnh hưởng pH đến ổn định buffer PCR 44 Hình 21: Ảnh hưởng nồng độ KCl đến khả khuếch đại đoạn gen ngắn 45 Hình 22: Hoạt tính chép Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh 46 o Hình 23: Phản ứng enzyme protein tái tổ hợp nhiệt độ biến tính 98 C .47 Hình 24: Hoạt tính proein Pwo-pol phản ứng sử dụng khuôn genome 48 iv Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự Bảng 2: Đặc tính số enzyme DNA polymerase bền nhiệt Bảng 3: Các chủng E coli phổ biến cho biểu protein tái tổ hợp 13 Bảng 4: Vị trí đặc điểm vector biểu pEtM 16 Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock 20 Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dịng gen mã hóa Pwo DNA 22 Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dịng gen mã hóa Pwo-pol .23 Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen plasmid 24 Bảng 9: Trình tự cặp mồi giải trình tự 26 Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE 30 Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH 30 Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD 31 Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol 32 Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính protein Pwo-pol 32 Bảng 15: Phân tích sử dụng codon gen mã hóa Pwo DNA polymerase 33 v Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu aa Tên đầy đủ APS Ammonium persulfate bp Base pair BSA Bovine serum albumin CAI Codon adaptation index DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleoside triphosphate DTT Dithiothreitol E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid His Histidine IMAC Immobilized metal affinity chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo dalton Kod-pol T kodakarensis DNA polymerase LB Luria-Bertani NTA Nitrilotriacetic acid PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase Chain Reaction Pfu-pol P furiosus DNA polymerase Pwo-pol P woesei DNA polymerase RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate Taq-pol T aquaticus DNA polymerase TEMED Tetramethylethylenediamine Acid amin vi Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu MỞ ĐẦU Enzyme DNA polymerase enzyme quan trọng ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: (1) sinh học phân tử, nhằm nghiên cứu gen hệ gen; (2) y học, để chẩn đoán phát bệnh di truyền, tầm sốt ung thư; (3) nơng nghiệp, xác định tác nhân gây bệnh cho trồng vật nuôi, thực vật biến đổi gen; (4) khoa học hình sự, để nhận diện dấu chuẩn di truyền Mặc dù có vai trị quan trọng, Việt Nam việc tự sản xuất enzyme DNA polymerase gặp nhiều khó khăn mặt quy trình đánh giá chất lượng Các nghiên cứu có đến nay, hầu hết quy trình tối ưu cho dịng enzyme DNA polymerase hệ cũ với hoạt tính bền, ổn định Do vậy, nguồn enzyme DNA polymerase hệ sử dụng cho mục đích phát triển khoa học công nghệ Việt Nam phải nhập từ nước ngồi Q trình nhập thường kèm theo nhiều vấn đề không mong muốn cho người sử dụng (1) thời gian vận chuyển kéo dài từ đến vài tháng làm chậm tiến độ đề tài, dự án; (2) chất lượng enzyme bị ảnh hưởng điều kiện bảo quản không đảm bảo thời gian dài; (3) yếu tố rủi ro mà giá thành mua enzyme từ cơng ty hóa chất đắt đỏ Hiện nay, công ty công nghệ sinh học Việt Nam cần nguồn enzyme sản xuất nước với chất lượng tốt, tương đương với quốc tế có giá thành rẻ hơn, thời gian cung cấp nhanh để làm nguyên liệu đầu vào cho việc phát triển loại kit khác Do cần thiết phải xây dựng quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase có chất lượng tốt sở nghiên cứu nước Việc sản xuất enzyme nước giúp chủ động nguồn nguyên liệu, giảm giá thành chi phí vận chuyển phải nhập enzyme từ nước ngoài, tạo động lực cho phát triển công ty công nghệ sinh học Việt Nam Pwo-pol enzyme có hoạt động ổn định với chuỗi DNA kích thước kb Hiện thị trường, enzyme thương mại hóa số hãng Roche (Sigma), Genaxis peQlab (Avantor) nhiên quy trình sản xuất lại khơng cơng bố Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: “Nhân dòng, biểu hiện, tinh xác định hoạt tính protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp E coli” Mục đích nghiên cứu nhằm góp phần đánh giá xác hiệu sử dụng enzyme Pwo-pol quy mơ phịng thí nghiệm đồng thời vii Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu định hướng cải tiến hiệu enzyme ứng dụng Việt Nam Nghiên cứu thực dựa mục tiêu cụ thể sau: Thiết kế tối ưu mã ba cho gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng công cụ tin sinh Tổng hợp nhân dịng gen mã hóa Pwo DNA polymerase, tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo Biểu protein Pwo DNA polymerase vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Tinh protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp Xác định hoạt tính protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp tinh viii Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu 3.4.1 Phương pháp tinh sắc ký lực nickel Dưới kết so sánh phá vỡ tế bào có kết hợp phương pháp siêu âm với nhiệt độ cao Bước đầu đánh giá khả tinh phương pháp khác kDa 72 55 42 26 Hình 15: So sánh phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao Mẫu vi khuẩn biểu nồng độ IPTG 0.3 mM/16h siêu âm phá vỡ tế bào, sau xử lý nhiệt tương ứng Ở đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2: dịch siêu âm sau ly tâm, không xử lý nhiệt, đường chạy số 3; cặn phá vỡ tế bào thu sau siêu o o âm kết hợp xử lý với nhiệt độ 70 C 95 C, đường chạy số 5; dịch phá vỡ tế o o bào sau siêu âm kết hợp xử lý nhiệt độ 70 C 95 C Các mẫu protein điên di gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút o Pwo-pol có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ ưa nhiệt, độ bền 2h 100 C o Do đó, chúng tơi tiến hành xử lý tế bào nhiệt độ cao khoảng từ 70-95 C trước tinh Kết so sánh với mẫu tế bào không xử lý nhiệt (mẫu tế bào siêu âm đá lạnh) Tuy nhiên, thử mẫu với nhiệt độ cao thời gian dài làm giảm hoạt tính protein thu sau tinh [15] Nên thực o o xử lý tế bào với nhiệt độ 70 C tối đa 1h ủ mẫu liên tục, với nhiệt độ 95 C tối đa 30 phút liên tục Kết đáng ý, mức độ loại bỏ protein E coli o dịch phá vỡ tế bào biểu tăng dần theo nhiệt độ: đá lạnh < 70 C < o 95 C Từ kết này, tiếp tục tối ưu phương pháp tinh với cột sắc ký lực nilel để loại bỏ protein khơng có gắn 6xHis-tag a Sử dụng mẫu tế bào biểu phá vỡ sóng siêu âm Trong quy trình này, chúng tơi tiến hành tất thao tác đá lạnh, đảm bảo protein khơng bị biến tính, hay ảnh hưởng khác nhiệt độ 39 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu Mk kDa 72 55 42 26 a1 Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sắc ký lực a- Quy trình tinh sắc ký lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; mẫu đối chứng khơng có IPTG mẫu biểu IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; cặn dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 6: dịch qua cột sau ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh chứa protein Pwo-pol b- Tối ưu quy trình tinh hình a cách tăng nồng độ imidazol đệm rửa, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3; 4; tương ứng đệm rửa (30 mM imidazole), đệm rửa (60 mM imidazole), đệm rửa (100 mM imidazole), đường chạy 5: mẫu tinh sau sử dụng loại đêm rửa Các mẫu protein điên di gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút Kết điện di quy trình tinh sắc ký lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào (hình 16a) mẫu sử dụng tinh mẫu biểu IPTG 0.3 mM Trong đó, băng protein biểu có kích thước khoảng 92 kDa có mẫu biểu so sánh với mẫu đối chứng Thêm vào đó, lượng protein Pwo-pol nhiều cặn phá vỡ máy siêu âm so sánh với dịch phá vỡ thu Do đó, cần tiếp tục tối ưu trình phá vỡ tế bào để hiệu suất protein tái tổ hợp thu cao Dịch tinh protein tái tổ hợp thu có độ tinh Hầu hết protein E coli chưa loại bỏ, lượng nhỏ protein không bám với nickel qua cột Vì vậy, protein tạp có khả liên kết với nickel nên cần tối ưu thêm bước rửa tăng nồng độ imidazole đệm rửa Kết tối ưu bước rửa protein tạp E coli phương pháp tinh với cột sắc lý lực (hình 16b) không đạt hiệu mong muốn Khi tăng nồng độ imdazole dung dịch đệm rửa từ 30 mM lên 60mM 100mM, lượng protein tái tổ hợp bị rửa trơi nhiều Trong đó, lượng protein tạp bị rửa trôi không đáng kể Điều chứng tỏ có khả protein liên kết với 40 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu liên kết với protein tái tổ hợp Vì vậy, chúng giữ lại cột với protein tái tổ hợp b Sử dụng mẫu tế bào biểu phá vỡ sóng siêu âm kết hợp xử lý o nhiệt độ 70 C o Hình 17: Tinh sắc ký lực kết hợp xử lý nhiệt độ 70 C Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; mẫu đối chứng khơng có IPTG mẫu biểu IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; cặn dịch siêu âm phá vỡ tế o bào xử lý với nhiệt độ 70 C, đường chạy 5; cặn dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 8: dịch qua cột sau ủ mẫu với nickel, đường chạy 9: dịch tinh chứa protein Pwo-pol, đường chạy 10: rửa cột với nước Các mẫu protein điên di gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút Kết điện di mẫu tinh protein Pwo-pol phương pháp sắc ký o lực kết hợp ủ hỗn hợp siêu âm 70 C/1h chưa loại bỏ protein không o mong muốn Kết cho thấy, lượng protein Pwo-pol lại cặn phá vỡ 70 C o cặn siêu âm dịch phá vỡ 70 C lại chứa nhiều dịch siêu âm Do đó, o khả ly giải tế bào giải phóng protein tái tổ hợp 70 C hiệu so với siêu âm phá vỡ tế bào Thêm vào đó, lượng protein tạp dịch đun nóng o 70 C lại giảm so với dịch siêu âm Kết chứng tỏ việc đun nóng giúp loại bỏ protein tạp Tuy nhiên, mức độ tinh protein Pwo-pol chưa cải thiện so với quy trình tiến hành trước c Sử dụng mẫu tế bào biểu phá vỡ sóng siêu âm kết hợp xử lý o nhiệt độ 95 C 41 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu Mk kDa 92 kDa 72 55 42 26 o Hình 18: Tinh sắc ký lực kết hợp xử lý nhiệt độ 95 C Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; mẫu đối chứng khơng có IPTG mẫu biểu IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; cặn dịch siêu âm phá vỡ tế o bào xử lý với nhiệt độ 95 C, đường chạy 6: dịch qua cột sau ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh chứa protein Pwo-pol, đường chạy 8: rửa cột với nước Các mẫu protein điên di gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút Quá trình xử lý mẫu với nhiệt độ cao lên đến 95% mang lại hiệu loại bỏ phần lớn protein tạp vi khuẩn E coli Như kết điện di hình 18, phần lớn protein Pwo-pol nằm pha dịch Độ tinh mẫu protein thu cao, hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp đạt 50% Bên cạnh đó, tế bào biểu o xử lý với nhiệt độ cao 95 C thời gian 30 phút dễ dàng giải phóng protein Pwo-pol mà khơng cần tiến hành bước siêu âm phá vỡ tế bào Đây điều kiện giúp tinh protein Pwo-pol tái tổ hợp nhanh chóng dễ dàng o Mặc dù tiến hành đun nóng tế bào nhiệt độ 95 C liên tục 30 phút khơng thể loại bỏ hồn tồn protein tạp khác Vấn đề tồn trình tinh protein DNA polymerase cho có tương tác protein tham gia vào máy chép DNA liên kết chúng với protein khác [27] Do đó, protein Pwo-pol giữ lại cột protein giữ lại Vì vậy, cách giải sử dụng số muối có khả gây biến tính tạm thời cho protein, làm giảm khả liên kết chúng Một số nghiên cứu trước sử dụng muối ammonium sulfate (AS) để tinh với Taq-pol Pfu-pol thu kết tốt 42 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu 3.4.2 Phương pháp tinh kết tủa muối ammonium sulfate Tinh protein Pwo DNA polymerase phương pháp kết tủa AS thực nhằm khắc phục vấn đề chưa tinh protein phương pháp cột sắc ký lực Nickel-resin o Hình 19: Tinh kết tủa muối AS bão hòa C Đường chạy 1-6 tương ứng với dịch siêu âm phá vỡ tế bào bổ sung muối AS có nồng độ từ 20-60% Đường chạy 7-11 tương ứng với dịch phá vỡ tế bào sucrose bổ sung muối AS có nồng độ từ 20-60% Như phần tinh protein phương pháp sắc ký lực cho thấy, khả ly giải tế bào sóng siêu âm khơng hiệu phương pháp đun nóng Ở phương pháp tinh protein kết tủa với muối (NH 4)2SO4 tiếp tục so sánh dịch phá vỡ tế bào sóng siêu âm với phương pháp sốc thẩm thấu (có nồng độ sucrose cao) Đem dung dịch kết tủa với muối (NH 4)2SO4 nồng độ từ 20-60% (hình 19), lượng protein kết tủa từ dịch phá vỡ sucrose nhiều so với dịch siêu âm Kết dịch siêu âm có muối NaCl với nồng độ cao, độ phân cực tốt, nên hạn chế khả tủa muối (NH4)2SO4 protein Tuy nhiên, với phương pháp này, chưa tinh protein tái tổ hợp Hơn nữa, phương pháp tốn nhiều thời gian để tối ưu khả tủa muối (NH4)2SO4 bị ảnh hưởng thành phần dung dịch ly giải Hầu tất protein bị tủa dải nồng độ 20-60% độ muối (NH4)2SO4 bão hòa 43 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu 3.5 Xác định hoạt tính protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase 3.5.1 Tối ưu thành phần buffer PCR 10X buffer 7.5 o Mk No he at 70 C 500bp 300bp 100bp kb kb kb Hình 20: Ảnh hưởng pH đến ổn định buffer PCR Hàng trên: Sản phẩm nhân gen kích thước nhỏ protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sắc ký lực Hàng dưới: Sản phẩm nhân gen kích thước lớn protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sắc ký lực Các protein theo thứ tự Pwo-pol tinh sắc ký lực, Pwo-pol tinh sắc ký lực sau xử lý o o nhiệt độ 70 C, Pwo-pol tinh sắc ký lực sau xử lý nhiệt độ 95 C Đường chay 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4: phản ứng PCR với buffer pH 7.5, đường chạy 5; 6; 7: phản ứng PCR với buffer pH 8.0, đường chạy 8; 9; 10: phản ứng PCR với buffer pH 8.8 Kết điện di gel agrose 1%, 100V, 30 phút Theo nghiên cứu trước đây, pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả hoạt động loại enzyme DNA-pol Thơng thường enzyme nhóm DNA-polB có hoạt động tốt dải pH từ 8.0 – 9.0 [22] Do đó, chúng tơi thử hoạt tính enzyme với loại buffer PCR có pH 7.5; 8.0; 8.8 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen AcrH hình 20 cho thấy protein Pwo-pol tinh quy trình sắc ký lực có hoạt tính 10X buffer, pH 8.0 Trong đó, protein Pwo-pol tinh quy trình sắc ký lực xử lý với nhiệt độ cao lại có phản ứng ổn định loại buffer với pH khác Do đó, mức độ tinh protein tái tổ hợp ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme điều kiện pH chưa tối ưu Chúng tiếp tục so sánh kết điện di sản phẩm PCR có kích thước lớn (> kb), có protein Pwo-pol tinh quy trình sắc ký lực xử lý o với nhiệt độ 95 C Và protein có độ tinh tốt nên cho hoạt tính ổn định với kích thước nhỏ kích thước lớn Tuy nhiên băng sản 44 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu phẩm PCR kích thước lớn nhân khơng sáng rõ sản phẩm PCR kích thước nhỏ mờ, cịn có thêm số băng phụ Vì vậy, tiếp tục tối ưu yếu tố khác nồng độ KCl cho buffer PCR với pH 8.8, ptrong điều kiện giảm nồng độ khuôn mẫu Mk 100mM KCl 250mM KCl Hình 21: Ảnh hưởng nồng độ KCl đến khả khuếch đại đoạn gen ngắn Hàng trên: phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl 100 mM, hàng phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl 250 mM Các thành phần khác buffer PCR bao gồm 200 mM Tris-HCl pH 8.8, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X, mg/ml BSA Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4; 5; tương ứng với nồng độ giảm dần protein Pwo-pol tinh theo phương pháp sắc ký lực sau xử lý với o nhiệt độ 95 C từ – 0.4 mg/ml Kết điện di gel agarose 1%, 100V, 15 phút Muối KCl thành phần quan trọng giúp ổn đinh DNA polymerase trình kéo dài, nhiên chúng làm giảm khả biến tính DNA Tăng nồng độ KCl giúp làm tăng lượng sản phẩm PCR cho kích thước đoạn gen ngắn khoảng 400 bp (hình 21) Kết đánh giá phần ảnh hưởng nồng độ protein thử hoạt tính đến độ sáng băng sản phẩm PCR Với buffer PCR bao gồm 100 mM KCl, độ sáng băng giảm nồng độ enzyme 0.8 mg/ml Trong đó, với buffer bao gồm 250 mM KCl thu kết sản phẩm PCR có độ sáng tương đương nồng độ protein khác Điều cho thấy KCl giúp làm tăng hoạt độ protein Pwo-pol tái tổ hợp 3.5.2 Hoạt tính chép Bên cạnh việc so sánh nồng độ, độ tinh protein tái tổ hợp điện di gel SDS-PAGE, cần đảm bảo sau phương pháp tinh protein tái 45 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu tổ hợp thu có hoạt tính ổn định, khơng bị biến tính hay bị ảnh hưởng thành phần hóa chất từ phương pháp tinh a- Mk 1kb 2kb 1kb 500bp 250bp Hình 22: Hoạt tính chép Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh a Phản ứng PCR cho protein Pwo-pol (1) tinh theo phương pháp sắc ký lực, kết so sánh với enzyme thương mại i-Taq điều kiện, đường chạy 1: marker 1kb o iNtRon, đường chạy 2; 3; phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95 C, đường chạy 4: phản o ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98 C; b Pwo-pol (2) tinh theo phương pháp kết tủa 20% AS, kết so sánh với protein Pwo-pol (1) tinh theo phương pháp sắc ký lực, điều kiện, đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; phản ứng o PCR với nhiệt độ biến tính 95 C, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến o tính 98 C Kết điện di gel agarose 1%, 100V, 30 phút Protein Pwo-pol ban đầu thử nghiệm với phương pháp tinh sắc ký lực có hoạt tính chép tương đương với enzyme i-Taq thương mại (hình 22a) nhân băng có kích thước khoảng 400 bp gen AcrH Mặt khác sử dụng o nhiệt độ giai đoạn biến tính 95 C, sản phẩm PCR protein Pwo-pol (đường chạy 2) có vệt smear, nhiều dimer Điều bị gây protein chưa tinh tốt Mặc dù, hai protein Pwo-pol (1) tinh theo phương pháp sắc ký lực Pwo-pol (2) tinh theo phương pháp kết tủa chưa đảm bảo độ tinh sạch, nhiên từ kết điện di sản phẩm PCR (hình 22b) cho thấy protein tinh cột sắc ký lực có hoạt tính tốt (đường chạy 2) so với tinh muối (NH4)2SO4 Nguyên nhân việc tinh kết tủa có hoạt tính nồng độ protein Pwo-pol thu thấp Mặt khác nồng độ muối cao gây kết tủa làm giảm khả cuộn gập tự nhiên protein Từ kết này, kết luận phương pháp tinh protein Pwo-pol tái tổ hợp cột sắc ký lực cho hoạt tính chép tốt phương pháp tinh kết tủa muối AS (20% bão hòa) Tiếp tục thử kiểm tra hoạt tính o protein nhiệt độ biến tính cao 95 C 46 Luận văn thạc sĩ 2019 3.5.3 Khả chịu nhiệt độ cao Mk 100bp o Hình 23: Phản ứng enzyme protein tái tổ hợp nhiệt độ biến tính 98 C Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: enzyme PhusionMCB, đường chạy 3; 7: enzyme i-Taq pha loãng theo tỉ lệ 1:1; 1:8, đường chạy 4; 5; 6; 8: protein Pwo-pol o tinh với phương pháp sắc ký lực kết hợp xử lý mẫu nhiệt độ 70 C pha loãng theo tỉ lệ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 buffer bảo quản Kết điện di gel agarose 1%, 100V, 15 phút Protein Pwo-pol tái tổ hợp tinh với phương pháp sắc ký lực sau ủ o mẫu nhiệt độ 70 C có hoạt tính ổn định nhân đoạn gen AcrH (từ kết tối ưu buffer PCR) Thêm vào đó, nồng độ protein ảnh hưởng đến hoạt tính nhân gen chúng Vì vậy, chúng tơi tiến hành pha lỗng protein Pwo-pol tái tổ hợp với buffer bảo quản theo tỉ lệ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 Như kết điện di (hình 23), cho thấy tỉ lệ pha loãng 1:8 lượng sản phẩm nhân gen giảm đáng kể so với tỉ lệ khác Chứng tỏ nồng độ protein Pwo-pol thu cao, pha lỗng lần cịn hoạt tính nhân gen Kết thử nghiệm nồng độ quan trọng để đánh giá khả o chịu nhiệt độ cao lên đến 98 C protein tái tổ hợp Mẫu pha lỗng 1:8 giảm hiệu suất khơng gây biến tính nhiệt độ cao Kết so sánh với enzyme khác PhusionMCB i-Taq Cả mẫu có sử dụng thành phần enzyme iTaq khơng có phản ứng khuếch đại Kết chứng minh protein Pwo-pol tái tổ hợp thu có khả chịu nhiệt cao so với Taq DNA polymerase theo lý thuyết 3.5.4 Hoạt tính có mặt chất ức chế Một yêu cầu với việc sản xuất enzyme DNA polymerase ngồi khả chịu nhiệt chúng phải đảm bảo hoạt tính ổn định phản ứng có mặt chất ức chế Vì vậy, chúng tơi sử dụng khuôn DNA 47 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu genome tách chiết từ mô động vật theo phương pháp tách chiết phenol-chloroform để kiểm tra hoạt tính cho protein Pwo-pol tái tổ hợp thu Mk a800bp 500bp 300bp Mk b800bp 500bp 300bp Hình 24: Hoạt tính proein Pwo-pol phản ứng sử dụng khuôn genome a Protein Pwo-pol tinh theo phương pháp sắc ký lực kết hợp xử lý với nhiệt o độ 70 C; b Protein Pwo-pol tinh theo phương pháp sắc ký lực kết hợp xử lý o với nhiệt độ 95 C Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: đối chứng âm không bổ sung khuôn DNA, đường chạy 3: đối chứng dương bổ sung khn DNA có chất lượng tốt, đường chạy – 11: mẫu genome tách chiết từ mẫu mô dơi bảo quản cồn thời gian dài Kết điện di gel agarose 1%, 100V, 15 phút Kết điện di cho thấy phần gen COI (~750 bp) khuếch đại với protein Pwo-pol tinh theo phương pháp sắc ký lực kết hợp xử lý o với nhiệt độ 95 C (hình 24a) Nếu hình a, sản phẩm khuếch đại khơng thể nhìn rõ hình b xuất băng đồng nhiều mẫu, băng sáng rõ, kích thước đối chứng dương Kết chứng tỏ chúng tơi tối ưu quy trình tinh protein Pwo-pol tái tổ hợp có hoạt tính tốt, đảm bảo hoạt tính vốn có DNA polymerase bền nhiệt Từ kết thu được, cho quy trình phá vỡ tế bào nhiệt o độ 95 C/30’ kết hợp ly tâm nhiệt độ cao tinh sắc ký lực nickel phương pháp đơn giản để sản xuất protein Pwo-pol tái tổ hợp 48 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu CHƯƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài đạt số kết sau: Tối ưu mã ba gen mã hóa protein Pwo DNA polymerase Nhân dịng thành cơng gen mã hóa Pwo DNA polymerase vào vector pET-M Biểu lượng lớn protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Tinh protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp có độ tinh lên đến 95% áp dụng phương pháp đun nóng nhiệt độ cao kết hợp sắc ký lực đuôi 6xHis-tag Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu sau tinh nhiệt độ cao có hoạt tính chép ổn định Kiến nghị Kiểm tra mức độ nhiễm plasmid protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu sau tinh Tối ưu quy trình xử lý DNA enzyme cắt DNase I trước tinh protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp Kiểm tra độ xác protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp sử dụng cặp mồi gây đột biến trực tiếp 49 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu TÀI LIỆU THAM KHẢO Abu Al-Soud W., Râdström P (1998), "Capacity of nine thermostable DNA polymerases To mediate DNA amplification in the presence of PCRinhibiting samples", Applied and environmental microbiology, 64, PP 37483753 Albà M M (2001), "Replicative DNA polymerases", Genome Biology, 2, PP reviews3002.1 Asif A., Mohsin H., Tanvir R., Rehman Y (2017), "Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation", Frontiers in microbiology, 8, PP 2169-2169 Block H., Maertens B., Spriestersbach A., Brinker N., Kubicek J., Fabis R., Labahn J., Schäfer F (2009), Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review, Academic Press, Elsevier Chen C.-Y (2014), "DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present", Frontiers in microbiology, 5, PP 305305 Dąbrowski S., Kur J (1998), "Cloning and Expression in Escherichia coli of the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei", Protein Expression and Purification, 14, PP 131-138 Das-Bradoo S., Bielinsky A.-K (2010), "DNA replication and checkpoint control in S phase", Nature, 9, PP 74-79 DasSarma S., Coker J A., DasSarma P (2009), Archaea (overview), Academic Press, Oxford Dumon-Seignovert L., Cariot G., Vuillard L (2004), "The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3)", Protein Expression and Purification, 37, PP 203-206 10 Duong-Ly K C., Gabelli S B (2014), Chapter Seven - Salting out of Proteins Using Ammonium Sulfate Precipitation, Academic Press, Elsevier 11 Ecker D., Khan M I., Marsh J., Butt T R., Crooke S T (1987), "Chemical synthesis and expression of a cassette adapted ubiquitin gene", Journal of Biological Chemistry, 262, PP 3524-3527 12 Ghasemi A., Salmanian A H., Sadeghifard N., Salarian A A., Gholi M K (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, PP 118-122 13 Hayat S M., Farahani N., Golichenari B., Sahebkar A (2018), "Recombinant Protein Expression in Escherichia coli (E coli): What We Need to Know", Current pharmaceutical design, 24, PP 718-725 14 Henry I., Sharp P M (2006), "Predicting Gene Expression Level from Codon Usage Bias", Molecular Biology and Evolution, 24, PP 10-12 15 Heo J H., Kim S W (2013), "Cloning the Pfu DNA polymerase from DNA contaminants in preparations of commercial Pfu DNA polymerase", African Journal of Microbiology Research, 7, PP 745-750 16 Hoseini S S., Sauer M G (2015), "Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering", Journal of biological engineering, 9, PP 2-2 50 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu 17 Jia B., Jeon C O (2016), "High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives", Open biology, 6, PP 160196 18 Kane J F (1995), "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli", Current Opinion in Biotechnology, 6, PP 494-500 19 Kanoksilapatham W., González J M., Maeder D L., DiRuggiero J., Robb F T (2004), "A proposal to rename the hyperthermophile Pyrococcus woesei as Pyrococcus furiosus subsp woesei", Archaea (Vancouver, B.C.), 1, PP 277283 20 Kary M., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H (1992), "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction 1986", Biotechnology (Reading, Mass.), 24, PP 17-27 21 Khosravinia H., Ramesha K (2007), "Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction", African Journal of Biotechnology (ISSN: 1684-5315) Vol Num 3, 6, PP 184-187 22 Killelea T., Ralec C., Bossé A., Henneke G (2014), "PCR performance of a thermostable heterodimeric archaeal DNA polymerase", Frontiers in microbiology, 5, PP 195-195 23 Kim S W., Kim D.-U., Kim J K., Kang L.-W., Cho H.-S (2008), "Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus", International journal of biological macromolecules, 42, PP 356361 24 Kimple M E., Brill A L., Pasker R L (2013), "Overview of affinity tags for protein purification", Current protocols in protein science, 73, PP 9.9.19.9.23 25 Lehman I (2003), "Discovery of DNA polymerase", The Journal of biological chemistry, 278, PP 34733-8 26 Li X., Sui X., Zhang Y., Sun Y., Zhao Y., Zhai Y., Wang Q (2009), "An improved calcium chloride method preparation and transformation of competent cells", Afr J Biotechnol., 9, PP 8549-8554 27 Li Z., Santangelo T J., Čuboňová Ľ., Reeve J N., Kelman Z (2010), "Affinity Purification of an Archaeal DNA Replication Protein Network", mBio, 1, PP e00221-10 28 Makino T., Skretas G., Georgiou G (2011), "Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria", Microbial cell factories, 10, AP 32-32 29 Mandecki W., Boiling T J (1988), "FokI method of gene synthesis", Gene, 68, AP 101-107 30 Marsic D., Hughes R C., Byrne-Steele M L., Ng J D (2008), "PCR-based gene synthesis to produce recombinant proteins for crystallization", BMC Biotechnology, 8, PP 44 31 Pavlov A R., Pavlova N V., Kozyavkin S A., Slesarev A I (2004), "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications", Trends in Biotechnology, 22, PP 253-260 32 Pluthero F G (1993), "Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase", Nucleic acids research, 21, PP 4850-4851 51 Luận văn thạc sĩ 2019 Huyền Nguyễn Thị Thu 33 Puigbò P., Bravo I G., Garcia-Vallve S (2008), "CAIcal: A combined set of 34 35 36 37 38 39 40 41 43 44 45 46 tools to assess codon usage adaptation", Biology Direct, 3, PP 38 Robb F T., Maeder D L., Brown J R., DiRuggiero J., Stump M D., Yeh R K., Weiss R B., Dunn D M (2001), Genomic sequence of hyperthermophile, Pyrococcus furiosus: implications for physiology and enzymology, Academic Press, Elsevier Roymondal U., Das S., Sahoo S (2009), "Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application to Escherichia coli genome", DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes, 16, PP 13-30 Sanger F., Coulson A R (1975), "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase", Journal of Molecular Biology, 94, PP 441-448 Sclafani R A., Holzen T M (2007), "Cell cycle regulation of DNA replication", Annual review of genetics, 41, PP 237-280 Spriestersbach A., Kubicek J., Schäfer F., Block H., Maertens B (2015), Chapter One - Purification of His-Tagged Proteins, Academic Press, Elsevier Steitz T A (1999), "DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms", The Journal of biological chemistry, 274, PP 17395-17398 Terpe K (2013), "Overview of thermostable DNA polymerases for classical PCR applications: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems", Applied Microbiology and Biotechnology, 97, PP 10243-10254 Wingfield P (2001), "Protein precipitation using ammonium sulfate", Current protocols in protein science, Appendix 3, PP Appendix-3F 42 Yang G., Wang S., Wei H., Ping J., Liu J., Xu L., Zhang W (2011), "Patch oligodeoxynucleotide synthesis (POS): A novel method for synthesis of long DNA sequences and full-length genes", Biotechnology letters, 34, PP 721-8 Yoda T., Tanabe M., Tsuji T., Yoda T., Ishino S., Shirai T., Ishino Y., Takeyama H., Nishida H (2017), "Exonuclease processivity of archaeal replicative DNA polymerase in association with PCNA is expedited by mismatches in DNA", Scientific reports, 7, PP 44582-44582 Zhang L., Kang M., Xu J., Huang Y (2015), "Archaeal DNA polymerases in biotechnology", Applied microbiology and biotechnology, 99, PP 6585-6597 Zhang Z., Kuipers G., Niemiec Ł., Baumgarten T., Slotboom D J., de Gier J.W., Hjelm A (2015), "High-level production of membrane proteins in E coli BL21(DE3) by omitting the inducer IPTG", Microbial cell factories, 14, PP 142-142 Zillig W., Holz I., Klenk H.-P., Trent J., Wunderl S., Janekovic D., Imsel E., Haas B (1987), "Pyrococcus woesei, sp nov., an ultra-thermophilic marine archaebacterium, representing a novel order, Thermococcales", Systematic and Applied Microbiology, 9, PP 62-70 52 ... polymerase, tạo vector tái tổ hợp pEtM -Pwo Biểu protein Pwo DNA polymerase vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Tinh protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp Xác định hoạt tính protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp. .. Fragments Escherichia coli DNA polymerase I Bacillus, Thermus aquaticus DNA polymerase, T7 RNA – DNA polymerases Họ polymerase B phụ thuộc DNA bao gồm DNA polymerase phage T4, RB69 Họ polymerase. .. Pwo DNA polymerase tái tổ hợp 33 3.2 Nhân dịng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase 34 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pEtM -Pwo 34 3.2.2 Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM -Pwo vào