Phân tích beta lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Th ị Như Hoa PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Th ị Như Hoa Phân tích beta-lactam mẫu dược ph ẩm sinh học phương pháp HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Ri Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10 1.1 Giới thiệu kháng sinh β -lactam 10 1.1.1 Lịch sử đời 10 1.1.2 Phân loại 10 1.1.3 Đánh giá tác dụng 10 1.2 Kháng sinh β-lactam 11 1.2.1 Định nghĩa 11 1.2.2 Cấu trúc phân loại 11 1.2.3 Tính chất vật lí hóa học 15 1.2.4 Tác dụng 15 1.2.5 Điều chế 16 1.2.6 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới 17 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 19 1.3.1 Phương pháp quang học 19 1.3.2 Phương pháp điện hóa 20 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 20 1.3.4 Sắc ký mỏng ( TLC) 22 1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC) 22 CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu 25 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26 2.2.1 Thiết bị 26 2.2.2 Dụng cụ 26 2.2.3 Hóa chất 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Khảo sát điều kiện xác định β – lactam LC/MS/MS 28 3.1.1 Khảo sát điều kiện chạy detector khối phổ 28 3.1.2 Chọn pha tĩnh 30 3.1.3 Chọn pha động 30 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 32 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 32 3.2.2 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ 37 3.3 Phân tích mẫu thực tế 38 3.3.1 Phân tích mẫu nước tiểu 38 3.3.2 Phân tích mẫu dược phẩm 49 3.4 Hướng phát triển đề tài 58 KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 ACN: AMO AMP APCI CAD CE CEF CEP CLOX CUR CXP DP EP ESI GC – MS: GS1 GS2 HPLC IS LC-MS LOD LOQ MeOH OXA PEN G PEN V R% RSD% SPE TLC tr MỞ ĐẦU Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, cúm, điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây loại virus, vi khuẩn Đối với nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ vị trí quan trọng nước điều kiện vệ sinh mức sống thấp nên thường xảy dịch bệnh Hiện giới người ta phát 8000 kháng sinh năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh phát Kể từ penicillin ALEXANDER FLEMING phát năm 1929 chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 nửa kỷ qua kháng sinh trở thành dược phẩm thiếu việc điều trị loại bệnh virus, vi khuẩn gây có tác dụng hẳn so với thuốc kháng khuẩn khác [1, 13] β -Lactam thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho người, thú y từ chúng giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 loại kháng sinh dùng nhiều Liều lượng cách dùng kháng sinh không dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ việc chữa trị khó khăn Ngồi cịn gây lãng phí cho người bệnh có bệnh virus khơng chữa kháng sinh dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đốn bệnh ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh máu gây bệnh thận, đặc biệt người cao tuổi Vì vậy, kiểm sốt phân tích thuốc kháng sinh người bệnh biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu sử dụng chúng Hai phương pháp thường dùng để phân tích β -lactam sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp điện di mao quản (CE) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu thời gian phân tích ngắn Tách xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector đại huỳnh quang, MS mẫu dược phẩm sinh học hướng nghiên cứu mới, với ưu điểm bật độ nhạy độ chọn lọc ngày áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Xuất phát từ lý nên tơi chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam mẫu dược phẩm sinh học phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu kháng sinh β -lactam [1, 2, 11] 1.1.1 Lịch sử đời Năm 1929, Alexander Fleming phát khả kháng khuẩn nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu sử dụng kháng sinh, sau hàng loạt nghiên cứu, sản xuất sử dụng kháng sinh phát triển mạnh tác dụng hẳn điều trị bệnh nhiễm khuẩn so với thuốc kháng sinh khác Giới y học định nghĩa : Kháng sinh chất tạo thành chuyển hố sinh học, có tác dụng ngăn cản tồn phát triển vi khuẩn nồng độ thấp, sản xuất sinh tổng hợp tổng hợp theo mẫu kháng sinh tự nhiên 1.1.2 Phân loại Kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hố học gồm nhóm sau: - Kháng sinh β-lactam - Kháng sinh Aminoglycosid - Kháng sinh Tetracylin - Cloramphenicol dẫn xuất - Kháng sinh Macrolid - Kháng sinh Lincosamid - Kháng sinh polypeptide - Các kháng sinh khác: Rifamycin 1.1.3 Đánh giá tác dụng - Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho sản phẩm kháng sinh thiên nhiên, không nguyên chất - Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho chế phẩm kháng sinh bán tổng hợp 1.2 Kháng sinh β-lactam 1.2.1 Định nghĩa Là kháng sinh mà phân tử chứa vịng β-Lactam Gồm nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem hai nhóm sử dụng phổ biến lớn penicillin cephalosporin Các penicillin thu từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA) Các cephalosporin tự nhiên phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ kháng sinh thiên nhiên 1.2.2 Cấu trúc phân loại * Các penicillin Các penicillin có cấu trúc gồm vòng: vòng thiazolidin, vòng β-Lactam R O COOM Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức penicillin chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay R gốc khác nhau, cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có penicilin có độ bền, dược động học phổ kháng khuẩn khác Với M gốc cation thường là: K, Na, H Nhóm kháng sinh penicillin chia thành nhóm với hoạt tính khác % Với phương pháp phân tích mẫu nước tiểu: độ thu hồi từ 80% – 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (1998), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội Nội Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất lần thứ 3, Nhà xuất Y học, Hà Trần Thị Dung (2011) “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam mẫu sinh học dược phẩm”, luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Văn Đích (2005), "Khơng nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học đời sống, số 27 Nguyễn Minh Đức( 2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, dược liệu hợp chất tự nhiên, Nhà xuất y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh Phạm Nho (2011) “Nghiên cứu điều kiện phân tích beta-lactam phương pháp điện di mao quản”,luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội Ngọc Phương ( 2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo laodong.com.vn, 10-10-2006 Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội Lê Ngọc Sơn (2011), :" Xác định hàm lượng kháng sinh β – lactam thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)”, khóa luận tốt nghiệp, ĐH Quốc Gia Hà Nội 10 PGS.TS Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình mơn học thống kê hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội 11 Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hóa Dược, Tài liệu lưu hành nội cho sinh viên trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội 12 Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB Khoa học Kĩ thuật 13 http://updatebook.vn/nong-lam-ngu-186/nghien-cuu-qua-trinh-san-xuat-chatkhang- sinh-penicillin-tu-vi-sinh-vat-11856/ 14 http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=1104&ID=4 464 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 A Fernandez-Gonzalez, R Badia and M.E.Diaz-Gar (2003), “Micellemediated spectrofluorinetric determination of ampicillin based on metal ioncatalysed hydrolysis”, Analytica Chimica Acta, volume 484( isues 2), pages 239246 16 Althea W McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States", Journal Nature medicine, volume 9(issues 4), pages 424 – 430 17 Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), “Application of capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins”, Journal of Chromatography B, volume 775( isues 2), pages 239-246 18 Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008), "Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, volume 48(issues 4), pages 12491253 19 Daniela P Santos, Marcio F Bergamini and Maria Valnice B Zanoni (2008), “Voltammetric sensor for amoxicillin determination in human urine using polyglutamic acid/glutaraldehyde film”, Sensors and Actuators B: Chemical, volume 133( issues 2), pages 398-403 20 D Hurtaud, Deleeine B; Sanders P (1994), “Particle beam liquid chromatography-mas spectrometry method with negative ion chemical ionization for the confirmation of oxacillin, cloxacillin and dicloxacillin residues in bovine muscle”, Analyst, volume 199( issues 12), pages 2731-2736 21 D.P Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care Medicin, volume 29( issues 6), pages 1101-1108 22 E Benito-pena, A.I.Partal-Rodera, M.E.Leon-Gonzalez, M.C.Moreno-Bondi (2005), “Evaluation of mixed mode solid phase extraction cartridges for the preconcentration of beta-lactam antibiotics in wastewater using liquid chromatography with UV-DAD detection”, Analytical Chimica Acta, volume 556( issues 2), pages 415-422 23 F Belal, M M El-Kerdawy, S M El-Ashry and D R El-Wasseef (2000), "Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in dosage forms", Il Farmaco, volume 55(issues 11-12), pages 680-686 24 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y (1998), “ Improvement in the Multiresidue liquid chromatographic analysis of residues of mono and dibasic penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC International, volume 81( issues 6), pages 1267-1272 25 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y (1998), “Multiresidue liquid chromatographic method for determining resideues of mono and dibasic penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC International,volume 81( issues 6), pages 1113-1120 26 J.M Cha, S Yang, K.H Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, volume 1115(isues 1-2), pages 46-57 27 L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening method for analytical control of antibiotic residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of AnalyticaChimicaActa, volume 523 (issues ), pages 21–28 28 MILAP C NAHATA, High performance liquid chromatographic determination of cephalexin in human plasma, urine and saliva Journal of Chromatography, volume 225 (issuse 2), pages 532-538 29 M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C Cruces-Blanco, M del Olmo Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary electrophoresis", Journal of Chromatography A, volume 185(issuse 2), pages 273-280 30 Nigel J.K Simpson (2000), Solid-phase extraction, Marcel Dekker, New York 31 R Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago Press, volume 23, pages 757-762 32 Titus A.M Msagati *, Mathew M Nindi (2007), Determination of b-lactam residues in foodstuffs of animal origin using supported liquid membrane extraction and liquid chromatography–mass spectrometry, Food Chemistry, volume 100 ( issues 2), pages 836 -844 33 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line solid phase extraction", Analytica Chimica Acta, volume 592( issues 2), pages 187–192 34 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, volume 119( issues 12), pages 2595-2601 35 David N Heller, Michelle L Smith, O Alberto Chiesa (2006), LC/MS/MS measurement of penicillin G in bovine plasma, urine, and biopsy samples taken from kidneys of standing animals, Journal of Chromatography B, volume 830, pages 91-99 PHỤ LỤC Sắc đồ khảo sát nước tiểu theo quy trình Sắc đồ chất phân tích khơng pha lỗng ( QT1-1) Pha loãng lần( QT1-2) Pha loãng 10 lần( QT1-3) Pha loãng 20 lần( QT1-4) Pha loãng 50 lần (QT1-5) Sắc đồ điều kiện tối ưu xử lý nước tiểu theo quy trình Chạy trực tiếp ( QT2-1) Pha loãng lần( QT2-2) Pha loãng 10 lần ( QT2-3) Pha loãng 50 lần ( QT2-4) Pha loãng 200 lần ( QT2-6) Sắc đồ quy trình xử lý mẫu thuốc Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 12h uống thuốc Sắc đồ mẫu nước tiểu sau uống thuốc 24h ...HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Th ị Như Hoa Phân tích beta- lactam mẫu dược ph ẩm sinh học phương pháp HPLC Chun ngành: Hóa phân tích Mã số:... hiệu kháng sinh, hạn chế chi phí y tế cứu đươc nhiều sinh mạng 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β -lactam 1.3.1 Phương pháp quang học Phương pháp đo quang phương pháp phân tích dựa tính... áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Xuất phát từ lý nên tơi chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta- lactam mẫu dược phẩm sinh học phương pháp HPLC? ?? sử dụng detector MS/MS CHƯƠNG