phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp hplc

DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.1 Điều

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Như Hoa

PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH

HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- Nguyễn Thị Như Hoa

Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10

1.1 Giới thiệu về kháng sinh β-lactam 10

1.1.1 Lịch sử ra đời 10

1.1.2 Phân loại 10

1.1.3 Đánh giá tác dụng 10

1.2 Kháng sinh β-lactam 11

1.2.1 Định nghĩa 11

1.2.2 Cấu trúc và phân loại 11

1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học 15

1.2.4 Tác dụng 15

1.2.5 Điều chế 16

1.2.6 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 17

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 19

1.3.1 Phương pháp quang học 19

1.3.2 Phương pháp điện hóa 20

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 20

1.3.4 Sắc ký bản mỏng ( TLC) 22

1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) 22

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 25

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26

2.2.1 Thiết bị 26

2.2.2 Dụng cụ 26

2.2.3 Hóa chất 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS 28

3.1.1 Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ 28

3.1.2 Chọn pha tĩnh 30

3.1.3 Chọn pha động 30

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 32

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 32

3.2.2 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 37

3.3 Phân tích mẫu thực tế 38

3.3.1 Phân tích mẫu nước tiểu 38

3.3.2 Phân tích mẫu dược phẩm 49

3.4 Hướng phát triển của đề tài 58

KẾT LUẬN 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ

Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá và các ion con của beta-lactam

Bảng 3.4 Chương trình chạy gradien tối ưu rửa giải các chất beta-lactam

Bảng 3.5 Thời gian lưu tr của các kháng sinh nhóm beta-lactam

Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các beta-lactam

Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các beta-lactam

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 1

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2

Bảng 3.10 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu

Bảng 3.13 Kết quả thực hiện trên mẫu nước tiểu thực

Bảng 3.14 Thông tin mẫu thuốc phân tích

Bảng 3.15 Bảng tính khối lượng trung bình viên của các mẫu thuốc

Bảng 3.16 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc

Bảng 3.17 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp beta-lactam 100ppb

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 6h

Hình 3.11 Sắc đồ phân tích mẫu thuốc

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrile

AMO Amoxicillin

AMP Ampicillin

APCI Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

CAD Áp suất khí mang trong tứ cực Q2

DP Thế đầu vào áp vào màn chắn

EP Thế áp vào nguồn ion mẹ

ESI Ion hóa phun điện tử

GC – MS: Sắc kí khí khối phổ

GS1 Áp suất khí hai bên đầu phun

GS2 Áp suất của luồng khí nóng

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IS Thế ion hóa

LC-MS Sắc kí lỏng khối phổ

LOD Giới hạn phát hiện

LOQ Giới hạn định lượng

RSD% Độ lệch chuẩn tương đối

SPE Chiết pha rắn

TLC Sắc kí bản mỏng

tr Thời gian lưu

MỞ ĐẦU

Các kháng sinh là một trong những nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, cúm, và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các loại virus, vi khuẩn Đối với các nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất quan trọng vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các dịch bệnh Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện Kể

từ khi penicillin được ALEXANDER FLEMING phát hiện năm 1929 và được chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 thì trong hơn nửa thế kỷ qua kháng sinh đã trở thành dược phẩm không thể thiếu được trong việc điều trị các loại bệnh

do virus, vi khuẩn gây ra và nó có tác dụng hơn hẳn so với các thuốc kháng khuẩn khác [1, 13]

β -Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do virus không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây các bệnh về thận, đặc biệt là người cao tuổi Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng

Hai phương pháp thường dùng để phân tích các β -lactam là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp điện di mao quản (CE) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector hiện đại như huỳnh quang, MS

trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm nổi bật của nó về độ nhạy và độ chọn lọc ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ Xuất phát từ những lý do đó nên tôi

đã chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam [1, 2, 11]

1.1.1 Lịch sử ra đời

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm

Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là

hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác

Giới y học định nghĩa : Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học,

có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên

- Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh thiên

nhiên, không nguyên chất

- Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm

kháng sinh bán tổng hợp

1.2 Kháng sinh β-lactam

1.2.1 Định nghĩa

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA)

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên

1.2.2 Cấu trúc và phân loại

* Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng

O

C O R

C O O M

2 3 4 1

5 6 7

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

Oxacillin

(OXA)

N

O

C-CH3

phenyl-1,2-oxazole-4-

6-{[3-(2-Là các Penicillin bán tổng hợp Phổ hẹp như nhóm I Kháng penicilliiase,không tác động vào vòng β –

Lactam được

Ampicillin

(AMP)

NH2

CH- 2-phenylacetyl]amino)

2-(4-hydroxyphenyl)-Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-) Không kháng β-lactamase

và penicilliiase

* Các cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với

1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau bởi các gốc R

N H

O

C O

R 1

N S

R 3

R 2

C O O M

1 2 3 4 5

6 7 8

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin

Kháng sinh R1 R2 R3

Cephalexin (CEP)

-CH2

Cefaclor (CEF)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin)

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

kết tinh và muối natri hoặc kali Để cho độ thu hồi cao thường gây đột biến bằng

mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh tổng hợp Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình nên men Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men

Tổng hợp hoá học:

Chưa được ứng dụng rộng rãi

1.2.6 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Như đã trình bày ở trên ta thấy có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Việc lạm dụng thuốc kháng sinh hiện nay xảy ra phổ biến do cả bệnh nhân và thầy thuốc cùng tham gia thực hiện để gây nên hiện tượng kháng thuốc sớm Điều này đã mang lại những hậu quả xấu, làm cho việc đáp ứng điều trị kém hiệu quả, người bệnh không được chữa khỏi hoặc để bệnh kéo dài, ảnh hưởng đến sức khỏe kể cả tính mạng của bệnh nhân Bệnh nhân, người nhà bệnh nhân và nhiều người khác trong cộng đồng người dân thường quan niệm rằng thuốc kháng sinh có thể chữa được mọi thứ bệnh tật Mỗi khi bị cảm cúm, đau đầu, sổ mũi ,sốt,

ho, viêm họng thông thường…đều đã dùng kháng sinh ngay để chữa trị Mặc dù kháng sinh đã được Bộ Y tế quy định là loại thuốc cần phải có đơn kê của thầy thuốc, không ở trong các nhóm thuốc được bán không cần kê đơn (OTC) nhưng trên thực tế hiện nay việc mua bán kháng sinh rất dễ dàng.[14]

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết Theo R Gonzales

[4,31], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị được bằng kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo của A.W McCormick [16] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus

sẽ đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ D.P Raymond [21] mỗi năm ở Hoa kỳ có

2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker [7], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày)

Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các

nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh” Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.3.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam

A Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu

được 4.10-7M (0.16 mg/l) Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…

Theo [23], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống

bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMO là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [33], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.3.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều Theo [19], Daniela P Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [27] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện

di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5 Tiến hành phân tích tại thế điện di

10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15% Độ thu hồi trên 96%

Biyang Deng và cộng sự [18] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2%và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu

Attila Gaspar và cộng sự [17] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [29] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông,

nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%

1.3.4 Sắc ký bản mỏng ( TLC)

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng một lúc song song rất tiện lợi Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy

đo quang có thể phân tích định tính và định lượng Tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng để định tính

1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh β -lactam bằng phương pháp HPLC

Theo [34], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg

J.M Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích lactam trong nước sông và nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột

β-450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý

Tác giả Titus A.M Msagati và cộng sự [32] đã sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định hàm lượng các Penicillin trong mô gan, thận và sữa Các giới hạn phát hiện (LOD) thu được được là 1 ng/kg đối với penicillin G, penicillin

V trong mô gan, thận và 0,7 µg/L trong sữa Đối với ampicillin, giới hạn phát hiện (LOD) là 1,4 µg/kg trong mô gan, thận và 1,7 µg/L trong sữa

Theo [35], David N.Heller và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS) để nghiên cứu phương pháp xác định nồng độ các penicillin trong huyết tương bò, thận và nước tiểu Phát hiện dựa trên sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS) Phenethecillin được sử dụng làm chất nội chuẩn Mẫu huyết tương được chiết với Acetonitril là phương pháp có giới hạn định lượng

12 ng/ml Mẫu thận được đồng nhất trong nước và Acetonitril sau đó được làm sạch trên cột chiết pha rắn C18 Giới hạn định lượng của phương pháp này là 10 ng/ml Nước tiểu được pha loãng, lọc và phân tích trực tiếp Giới hạn định lượng của phương pháp phân tích này là 63 ng/ml Độ chính xác cho mẫu huyết tương là 103% với hệ số biến thiên là 3 %, với mẫu thận là 96% và 11% tương ứng, mẫu nước tiểu là 98 % và 4 % tương ứng Những phương pháp này được áp dụng để phân tích mẫu huyết tương , nước tiểu, thận, mẫu sinh tiết được lấy từ động vật đã được định lượng với penicillin

Trong [25, 24], Boison J.O và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2 (250mm*4,6mm, 5μm)’; pha động : ACN –Na2S2O3 15,7mM trong đệm photphat 0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5 μ g/kg

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam

Trong [20], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO, OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt độ thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91% Còn trong [34], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách penịillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, độ thu hồi đạt 89-117%

Khi tách và làm giàu các β -lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao đổi ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ

K Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C18 và dung môi rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt độ thu hồi 83-89% Còn trong [26] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt độ thu hồi 77,1-95,9%

Trong [22] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước thải cho độ thu hồi 76-100%

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích β -lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề cấp thiết đang được quan tâm Trong đó chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng Như chúng tôi

đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là ampicillin (AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) và Amoxicillin (AMO), benzylpenicillin sodium (PEN G), Penicillin V Kali ( PEN V), Oxacillin (OXA), Cloxacillin (CLOX) là các kháng sinh β-Lactam được sử dụng phổ biến, rộng rãi hiện nay Mục tiêu của đề tài là xây dựng và phát triển phương pháp xác định đồng thời các kháng sinh nhóm β-Lactam trong thuốc và trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector khối phổ ( LC-MS/MS)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Tập trung nghiên cứu các vấn đề sau:

1 Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo sử dụng detector khối phổ

- Điều kiện vận hành máy LC-MS/MS

- Chọn pha tĩnh

- Tối ưu hoá pha động: Thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,…

2 Điều kiện định lượng

- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Độ đúng và độ lặp lại của phép đo

3 Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp

- Phân tích mẫu thuốc

- Phân tích mẫu nước tiểu

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.2.1 Thiết bị

• Hệ thống sắc ký lỏng HPLC của Shimazu (Nhật Bản) gồm: Bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt, cột sắc ký C18 của Dionex (150mm × 2,1mm × 3μm) ghép nối với detector khối phổ MS/MS Triple Quad 5500 của AB Sciex (Hoa Kì)

• Ống đong, phễu, giấy lọc

• Pipetman loại 200µl, 1000µl và đầu côn

• Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45µm, bể siêu âm, tủ lạnh, tủ sấy, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác

2.2.3 Hóa chất

- Chất chuẩn β – lactam gồm các chất chuẩn: AMP,OXA, CEP, CEF, AMO, PEN

V, PEN G, CLOX do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48A Hai Bà Trưng – Hà Nội) sản xuất và cung cấp

- MeOH, ACN tinh khiết cho chạy HPLC Merck (Đức) Các hoá chất khác: Axit acetic, nước cất hai lần

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 0,01g các chất chuẩn trên cân phân tích (độ đọc 0,01mg) của từng β – lactam, hoà tan cho vào từng bình định mức 50

ml và định mức đến vạch bằng nước cất Chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C, tránh ánh sáng trực tiếp Hạn sử dụng trong 3 tháng

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 ppm: lấy chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc của mỗi chuẩn gốc β – lactam vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng nước cất Chuẩn trung gian được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C, tránh ánh sáng trực tiếp, sử dụng trong ngày

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: lấy chính xác thể tích hỗn hợp dung môi ACN : H2O (1 : 1) và thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian cho vào vial loại 1,5

ml thu được các chuẩn làm việc 1 ppb, 5 ppb, 10 ppb, 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb,

300 ppb, 500 ppb Chuẩn làm việc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C, tránh ánh sáng trực tiếp, sử dụng trong ngày

Chuẩn bị dung môi pha động

- Kênh A: dung dịch acid acetic 0,1% trong nước: lấy chính xác 1 ml acid acetic vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất Dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào cột sắc ký

- Kênh B: ACN

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS

3.1.1 Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ

Theo tài liệu tham khảo [9], tác giả Lê Ngọc Sơn đã tiến hành phân tích các kháng sinh họ beta-lactam trên thiết bị LC/MS/MS tại phòng thí nghiệm của viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2012 Do vẫn tiến hành trên cùng thiết bị đó nên để tiết kiệm thời gian phân tích chúng tôi đã sử dụng một số kết quả khảo sát đã được trình bày trong đề tài của tác giả Lê Ngọc Sơn [9] như sau:

1 Điều kiện tối ưu của thiết bị khối phổ

Các điều điện tối ưu của thiết bị khối phổ được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Curtain Gas (CUR) 35,0 psi Collision Gas (CAD) 7,0 psi IonSpray Voltage (IS) 5000 V Temperature (TEM) 300oC IonSource (GS1) 30 psi IonSource (GS2) 20 psi

Ý nghĩa của các thông số

CUR: Luồng khí mang N2 tinh khiết thổi vào khe giữa 2 màn chắn của bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích phổ

CAD: Kiểm soát áp suất khí N2 trong Q2 , tạo năng lượng để phân mảnh ion mẹ IS: Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phận phân tich ion

TEM: Nhiệt độ của luồng khí nóng thổi vào Gas 2

GS1: Áp suất hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự hình thành câc giọt được dễ dàng hơn

GS2: Áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi

2 Kết quả bắn phá các ion mẹ

Trong kĩ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ

thường ở dạng (M+1 ) Kết quả bắn phá các ion mẹ được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ

β – lactam Khối lượng phân tử M Ion mẹ (M +1 )

3.Điều kiện bắn phá các ion con

Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện

đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng Ion con phải có tín

hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao thì

cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp Qua một số tài liệu tham

khảo chúng tôi lựa chọn được kết quả tối ưu hóa mức năng lượng bắn phá ion mẹ để

tạo các ion con được trình bày trong bảng 3.3 Các ion con cho tín hiệu cao hơn

được dùng để định lượng, đối với các kháng sinh beta-lactam chúng tôi chọn mảnh

dùng để định lượng là các mảnh có khối lượng nhỏ

Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá và các ion con của β – lactam

B - lactam Ion mẹ Ion con DP (V) CE (V) CXP (V)

Ampicillin 350

Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất Các chất

nhóm β – lactam là các chất kém phân cực, do đó chúng tôi vẫn sử dụng cột tách là

cột tách pha đảo cho quá trình phân tích Trong điều kiện phòng thí nghiệm cho

phép, chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để tách các chất β – lactam Để bảo vệ cột,

chúng tôi sử dụng thêm tiền cột Thông số cột tách và tiền cột:

- Cột Acclaim C18 của Dionex (150mm x 2,1mm x 3µm)

- Tiền cột Acclaim C18 của Dionex

3.1.3 Chọn pha động

Theo tài liệu tham khảo [9] chúng tôi sử dụng pha động như sau:

- Kênh A: Axit acetic 0,1% trong nước

- Kênh B: ACN

Trong [9] sử dụng chương trình gradien chạy trong 12 phút với tốc độ dòng 0,4

ml/phút nhưng để tiết kiệm thời gian phân tích chúng tôi chọn chương trình gradien

chạy trong 10 phút như sau:

Bảng 3.4 Chương trình chạy gradient tối ưu rửa giải các chất β-lactam

Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) CH 3 COOH 0,1 % ACN

Như vậy các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau:

- Cột Symestry C18 của Dionex (150mm x 2,1 mm x 3µm)

- Tiền cột C18 của Dionex

- Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid acetic 0,1% trong nước, kênh B là dung môi ACN

- Chương trình chạy gradient ở bảng 3.4

- Tốc độ dòng 0,4ml/phút

- Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3

Tiến hành chạy sắc kí đối với chuẩn hỗn hợp 8 kháng sinh β – lactam với các

điều kiện tối ưu thu được thời gian lưu tr theo bảng 3.5:

Bảng 3.5 Thời gian lưu t r của các kháng sinh nhóm β – lactam trong điều kiện tối ưu

Thông

số AMP PEN G PEN V OXA CLOX CEP CEF AMO

t r (phút) 5,27 6,31 6,44 6,55 6,63 5,30 5,26 1,54

Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 8 kháng sinh β - lactam ở nồng độ 100 ppb

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính

Từ các điều kiện đã tối ưu ở trên tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của phép đo với các điều kiện sau:

- Khoảng nồng độ: 1ppb – 500 ppb

- Phương pháp đo diện tích S

Kết quả thu được ở bảng 3.6 Từ kết quả đó, ta xây dựng đường chuẩn đối với từng kháng sinh nhóm β – lactam

Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ β – lactam

Diện tích pic Nồng

Từ bảng số liệu trên ta thấy nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích tuyến

tính trong khoảng 1ppb – 300 ppb.Sử dụng phần mềm origin 6.0 lập phương trình

đường chuẩn của các chất phân tích như sau:

0 50 100 150 200 250 300 0

5000000 10000000 15000000

20000000

Y = A + B * X Parameter Value Error -

A -9402.20483 27989.27006

B 68943.02863 209.32884 -

0.99997 60741.98549 8 <0.0001 -

0 50 100 150 200 250 300 0

A -134.04749 7584.29437

B 72626.92767 56.72215 -

-1 16459.34665 8 <0.0001 -

A 4635.19949 4125.31954

B 23296.81983 30.85284 -

0.99999 8952.72007 8 <0.0001 -

0 50 100 150 200 250 300 0

A 22948.94984 9363.47859

B 13276.25131 70.02848 -

0.99992 20320.51138 8 <0.0001 -

A -758.53518 6413.18244

B 10746.30945 47.96352 -

0.99994 13917.81329 8 <0.0001 -

0 50 100 150 200 250 300 0

A 7997.09625 15414.48025

B 22870.29625 115.2833 -

0.99992 33452.32418 8 <0.0001 -

A 1954.96399 2627.40539

B 15785.07331 19.65009 -