xác định đồng vị kẽm trong mẫu sinh hóa bằng phương pháp khối phổ cao tàn cảm ứng plasma

Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ tiến hành có nội dung đánh giá mối liên hệ giữa bệnh lao và hàm lượng kẽm nội môi ở nhóm trẻ được điều trị lao và nhóm trẻ khỏe mạnh đối c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN MẠNH HÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG VỊ KẼM TRONG MẪU SINH HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KHỐI PHỔ CAO TẦN CẢM ỨNG PLASMA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN MẠNH HÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG VỊ KẼM TRONG MẪU SINH HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ CAO TẦN CẢM ỨNG PLASMA

Chuyên ngành: Hoá phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo

đã giao đề tài và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn này Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phạm Luận đã giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi trong quá trình làm luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Hóa phân tích đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành báo cáo nghiên cứu khoa học này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đề tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong

điều trị hiệu quả bệnh lao của trẻ em” do Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân

chủ trì, phối hợp với Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ đã giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 14 tháng 1 năm 2014

Học viên

NGUYỄN MẠNH HÀ

Lời cảm ơn

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Mục lục

Mở đầu 1

Chương 1 Tổng quan 3

1.1 Vai trò thiết yếu của vi lượng kẽm với sức khỏe và trong điều trị bệnh 2

1.2 Phương pháp phân tích và đánh giá thành phần đồng vị kẽm 5

1.2.1 Phương pháp phân tích phổ khối plasma cảm ứng (ICP – MS) 5

1.2.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ khối ICP - MS 6

1.2.1.2 các nghiên cứu phân tích đồng vị kẽm bằng phương pháp ICP- MS 7 1.3 Phương pháp xử lý mẫu, làm sạch mẫu sinh học 9

Chương 2 Thực nghiệm 10

2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm…… 10

2.1.1.Hóa chất 10

2.1.2 Thiết bị 11

2.1.3 Dụng cụ 12

2.2 Mẫu nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo ICP khi xác định đồng vị 13

2.3.1.1 Sơ đồ nguyên tắc của thiết bị ICP-MS 13

2.3.1.2 các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ phổ khối 14

2.3.1.3 khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo vào các tham số hoạt động của plasma 16

2.3.1.4 nghiên cứu lựa chọn axit dung làm môi trường dung dịch mẫu đo và khảo sát nồng độ axit tối ưu 17

2.3.2.1 Xử lý mẫu huyết tương 18

2.3.2.2 Xử lý mẫu nước tiểu 19

2.3.2.3.Xử lý mẫu phân 20

2.3.3 Phương pháp thống kê sử lý số liệu phân tích 20

2.3.3.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đồng vị 20

2.3.3.2 Khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị ……… .21

2.3.3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 22

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 25

3.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp trên thiết bị ICP-MS 25 3.1.1 Khảo sát và lựa chọn các tham số tối ưu của thiết bị đo 25

3.1.1.1 Ảnh hưởng của công suất cao tần 25

3.1.1.2 Ảnh hưởng của lưư lượng khí mang mẫu………… ………… … 28

3.1.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của công suất cao tần khi cố định LV và NGF.29 3.1.1.4 Lựa chọn tham số tối ưu cho chế độ làm việc của Plasma .30

3.1.2 Ảnh hưởng của loại axit và nồng độ axit… … …….….……….31

3.2 Đánh giá phương pháp phép đo ICP – MS ……….…… … 34

3.2.1 Đường chuẩn xác định đồng vị… ……… 34

3.2.2 Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượn.… …… 35

3.2.3 Đánh giá độ chính xác của phép đo xác định các đồng vị……….…….…….36

3.2.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi……… ……….……37

3.2.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch cột……… …… 37

3.2.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu phân ……… 39

3.2.4.3.Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu huyết tương 39

3.2.4.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu nước tiểu 39

3.2.5 Phân tích mẫu thực tế 43

3.2.5.1 Phân tích đồng vị kẽm trong viên thuốc 43

3.2.5.2 Phân tích đồng vị kẽm trong mẫu phân 43

3.2.5 Phân tích đồng vị kẽm trong mẫu nước tiểu 43

Kết luận 51 Tài liệu tham khảo 52 Phụ lục

Ký hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ICP-MS Inductively Coupled Plasma

Mass Spectrocopy

Khối phổ plasma cảm ứng

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương

đối

mẫu

Bảng 2.1 Các tham số được lựa chọn tự động của máy ICP – MS

ELAN 9000 16

Bảng 3.1 Các tham số tối ưu của máy ICP – MS ELAN 9000 33

Bảng 3.2 Nồng độ dung dịch chuẩn và nồng độ tương ứng của các đồng vị 34

Bảng 3.3 Phương trình đường chuẩn của các đồng vị kẽm 36

Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các đồng vị 36

Bảng 3.5 Độ chính xác của phép đo ICP-MS để xác định các đồng vị kẽm trong dung dịch chuẩn kiểm tra 37

Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch trên cột chiết pha rắn 38

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của quá trình phá mẫu phân 40

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của quá trình phá mẫu huyết tương 41

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của quá trình phá mẫu nước tiểu 42

Bảng 3.10 Hàm lượng kẽm trong viên thuốc (n=3) 43

Bảng 3.11Tỷ lệ 3 cặp đồng vị 67 Zn/ 66 Zn, 68 Zn/ 66 Zn, 70 Zn/ 66 Zn của bốn đối tượng nghiên cứu mẫu phân 45

Bảng 3.11Tỷ lệ 3 cặp đồng vị 67 Zn/ 66 Zn, 68 Zn/ 66 Zn, 70 Zn/ 66 Zn của bốn

đối tượng nghiên cứu mẫu huyết tuơng 48

Bảng 3.11Tỷ lệ 3 cặp đồng vị 67 Zn/ 66 Zn, 68 Zn/ 66 Zn, 70 Zn/ 66 Zn của bốn

đối tượng nghiên cứu mẫu huyết tuơng 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý các bộ phận của hệ máy ICP – MS 7

Hình 2.1: Hình ảnh máy ICP – MS (ELAN 9000- Perkin Elmer) 11

Hình 2.2: Sơ đồ nguyên tắc thiết bị phân tích ICP-MS 13

Hình 3.1 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64 Zn vào RFP

(NGF = 0,7 L/ph) 25

Hình 3.2 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph) 26

Hình 3.3 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph) 26

Hình 3.4 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph) 27

Hình 3.5 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph) 27

Hình 3.6 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP 29

Hình 3.7 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP 30

Hình 3.8 Ảnh hưởng trực tiếp của nền mẫu đối với phép đo đồng vị kẽm 32

Hình 3.9 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo Zn vào nồng độ axit 33

Hình 3.10 Đường chuẩn phân tích đồng vị 64 Zn 35

Hình 3.12 Đường chuẩn phân tích đồng vị 67

Zn 35 Hình 3.13 Đường chuẩn phân tích đồng vị 68

Zn 35 Hình 3.14 Đường chuẩn phân tích đồng vị 70

Zn 36

MỞ ĐẦU

Kẽm là nguyên tố vi lượng, đóng vai trò thiết yếu đối với sinh trưởng người và động vật Kẽm tham gia vào cấu tạo các enzym và trong thành phần một số deshydrogenaz, đóng vai trò điều hòa chuyển hóa lipit và ngăn ngừa mỡ hóa gan, tham gia vào chức năng tạo máu, cần thiết cho sự biệt hóa tế bào và sự

ổn định màng Thiếu kẽm ảnh hưởng xấu đến tốc độ hấp thu các axit amin Ngoài ra, kẽm giữ vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, kích thích sự phát triển

và biệt hóa lympho bào, đẩy mạnh sự xuất tiết các cytokin (nhất là interleukin 2)

Lượng kẽm trong cơ thể người khoảng 2 - 3g, phân phối không đồng đều nhưng nhiều nhất tại gan, thận, xương, tinh hoàn, da, tóc, móng Đặc điểm của kẽm là không dự trữ trong cơ thể, nửa đời sống sinh học ngắn (12,5 ngày) trong các cơ quan nội tạng, nên cơ thể dễ bị thiếu kẽm nếu khẩu phần cung cấp không

đủ Do rối loạn hấp thu hoặc bài tiết quá mức cũng làm thiếu hụt kẽm như mắc các bệnh di truyền, bệnh đường ruột (tiêu chảy mãn, cắt ruột…), các bệnh khác (xơ gan do nghiện rượu, tiểu đường, thiểu năng tuyến tụy…)

Kẽm cũng thuộc loại nguyên tố phổ biến trong thiên nhiên, có nhiều trong ngũ cốc và đậu (tập trung phần lớn ở vỏ ngoài), có nhiều trong hàu, gan, lòng đỏ trứng gà và có khả năng sinh học cao Song song với việc điều chỉnh lượng kẽm

từ thức ăn, thiếu kẽm cần được điều trị bổ sung từ uống viên kẽm hoặc tiêm Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra bổ sung kẽm có thể cải thiện hiệu quả điều trị lao

Một phần của đề tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong điều trị hiệu quả bệnh

lao của trẻ em” do Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân chủ trì, phối hợp với

Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ tiến hành có nội dung đánh giá mối liên hệ giữa bệnh lao và hàm lượng kẽm nội môi ở nhóm trẻ được điều trị lao và nhóm trẻ khỏe mạnh đối chứng ghép cặp thông qua việc phân tích các đồng vị bền của kẽm để xác định mức hấp thu kẽm của cơ thể theo đường bổ sung kẽm uống hoặc tiêm.

Để phân tích các đồng vị bền, phương pháp phổ biến hiện nay là phân tích phổ khối Plasma cảm ứng (ICP-MS) nhờ ưu điểm có tính chọn lọc và độ nhạy cao trong khoảng hàm lượng siêu vết

Mục tiêu của đề tài luận văn “Xác định đồng vị kẽm trong mẫu sinh hóa

bằng phương pháp khối phổ cao tần cảm ứng plasma ICP-MS” là nhằm xây

dựng qui trình phân tích các đồng vị bền của kẽm bằng phương pháp ICP-MS, trong các đối tượng sinh học gồm mẫu huyết tương, nước tiểu và phân thu thập

từ các bệnh nhân nhi đang điều trị lao được uống bổ sung viên kẽm hoặc tiêm tăng cường hiệu quả điều trị lao theo phác đồ khuyến cáo của WHO đối với trẻ

em Việt Nam

Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn gồm:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu phép đo ICP-MS khi xác định năm đồng vị kẽm 64

Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn và 70

Zn, bao gồm nghiên cứu tối

ưu hóa các tham số hoạt động của máy ICP – MS, ảnh hưởng của môi trường dung dịch mẫu đo đến phép phân tích

 Đánh giá các thông số đặc trưng của phương pháp phân tích như khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ, độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phép đo trên thiết bị ICP-MS

 Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu huyết tương, nước tiểu

và phân và hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích các đồng vị kẽm trên nền mẫu thực

 Ứng dụng qui trình phân tích xây dựng được để phân tích thành phần đồng vị kẽm trong mẫu thực tế

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vai trò thiết yếu của vi lượng kẽm với sức khỏe và trong điều trị bệnh

Kẽm là một chất khoáng vi lượng thiết yếu cho sinh vật và sức khỏe con người [36] Cơ thể người trưởng thành có khoảng 2–3 g kẽm, chiếm khoảng 0,1

% nhu cầu hàng ngày thiếu hụt.[21] Thiếu kẽm ảnh hưởng đến khoảng 2 tỷ người ở các nước đang phát triển và liên quan đến nguyên nhân một số bệnh [9] Ở trẻ em, thiếu kẽm gây ra chứng chậm phát triển, phát dục trễ, dễ nhiễm trùng và tiêu chảy, gây thiệt mạng khoảng 800.000 trẻ em trên toàn thế giới mỗi năm [36] Các enzym liên kết với kẽm trong trung tâm phản ứng có vai trò sinh hóa quan trọng như alcohol dehydrogenase ở người Ngược lại việc tiêu thụ quá mức kẽm có thể gây ra một số triệu chứng như hôn mê, bất động cơ và thiếu đồng

Kẽm đã được sử dụng theo kinh nghiệm để điều trị nhiều bệnh, kể cả tiêu chảy, trong thế kỷ thứ 19 Vào những năm 1930, kẽm đã được coi là thiết yếu đối với sự tăng trưởng của động vật và mức kẽm thấp đã được mô tả ở người trưởng thành tại Trung Quốc, nhưng hội chứng thiếu kẽm ở người mãi đến những năm 1960 mới được Prasad và cộng sự mô tả Mức nhu cầu khuyến nghị đối với kẽm mãi đến năm 1974 mới được Viện hàn lâm Khoa học Quốc gia đưa

ra Bổ sung kẽm được Sachdev và cộng sự đánh giá là can thiệp điều trị đối với bệnh tiêu chảy vào năm 1988, và trong những năm 1990, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá việc bổ sung kẽm đối với bệnh tiêu chảy, viêm phổi, sốt rét, với tăng trưởng và phát triển của trẻ em Theo nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị cho người Việt Nam cũng như khuyến nghị của FAO/WHO 2002, nhu cầu kẽm hàng ngày cho trẻ 4-6 tuổi là 3,1 - 10,3mg cho trẻ 7-9 tuổi là 3,3 - 11,3mg, cho trẻ nam 10-18 tuổi là 5,7 - 19,2mg và cho trẻ nữ 10-18 tuổi là 4,6 - 15,5mg tuỳ theo mức hấp thu tốt (giá trị sinh học kẽm tốt = 50%), mức hấp thu vừa (giá trị sinh học kẽm trung bình = 30%) và mức hấp thu kẽm kém (giá trị sinh học kẽm thấp = 15%) Theo đánh giá của tổ chức tư vấn quốc tế về kẽm, kẽm trong khẩu phần của người Việt Nam có tỷ số phytate/kẽm = 21,6, thuộc loại hấp thu trung bình Năm 2004, Tổ chức y tế thế giới đã khuyến cáo bổ sung kẽm là bắt buộc trong phòng và điều trị tiêu chảy trẻ em Sử dụng kẽm (10-

20mg/ngày) trong vòng 14 ngày cho toàn bộ trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, (10mg/ngày cho trẻ dưới 6 tháng tuổi, 20mg/ngày cho trẻ từ 6 tháng đến 5 tuổi) Tuy nhiên, chưa có khuyến cáo bắt buộc với các loại bệnh nhiễm trùng khác Bệnh lao ở trẻ em là một vấn đề sức khỏe chủ yếu cần quan tâm ở Việt Nam [16] Ước tính 75% số bệnh nhân lao xảy ra ở trên 22 quốc gia [23] Việt Nam cũng nằm trong số đó với 5,3% trường hợp bệnh nhân lao là ở trẻ dưới 15 tuổi [13,17] Biểu hiện bệnh lao có liên quan tới suy giảm nồng độ kẽm huyết thanh

ở cả người lớn và trẻ em [6,31], đồng thời nồng độ này cũng tăng lên ở những trường hợp điều trị có hiệu quả [26] Kẽm cần thiết về nhiều mặt trong chức năng miễn dịch [21] và người ta đã thấy kẽm làm tăng quá trình sản xuất cytokine trong đại thực bào phế nang ở những bệnh nhân bị lao phổi Hơn thế nữa, trẻ sau điều trị lao hấp thu kẽm từ khẩu phần ăn tốt hơn so với trẻ khỏe thuộc nhóm biến chứng, điều này gợi ra là nhu cầu kẽm của trẻ bị bệnh lao lớn hơn có thể do nhu cầu kẽm cao hơn của chính hệ miễn dịch Vì thế bổ sung kẽm

có thể cải thiện hiệu quả điều trị lao Mặc dù liều bổ sung đồng thời kẽm và vitamin A đã làm rút ngắn thời gian diệt khuẩn trong đờm dãi và cải thiện vùng tổn thương thấy trên chụp X quang ở điều trị bệnh nhân lao người lớn [22,11], nhưng chưa thấy có nghiên cứu nào về khả năng kẽm làm tăng hiệu quả điều trị lao ở trẻ em trên thế giới [14]

Để bổ sung kẽm vào cơ thể, có thể sử dụng viên kẽm dạng uống dưới dạng thực phẩm chức năng, như viên kẽm gluconat 30 mg, 50 mg hoặc kẽm sunfat Tuy kẽm rất cần thiết cho cơ thể, nhưng nếu cơ thể thừa kẽm sẽ ảnh hưởng tới sức khỏe, tổn thương tế bào gan, thiếu máu, giảm miễn dịch (người ta không dùng kẽm khi bị nhiễm trùng) Do vậy cần nghiên cứu cụ thể hiệu quả hấp thu và chuyển hóa kẽm trong cơ thể

Huyết tương hoặc huyết thanh kẽm thường được sử dụng để đánh giá thiếu hụt kẽm trong cơ thể Hàm lượng kẽm trong huyết tương giảm sau khi ăn, có liên quan giới tính và độ tuổi Hàm lượng thấp nhất của kẽm trong huyết tương khoảng 700 mg/L [36] Sau khi dùng kẽm qua đường uống, kẽm xuất hiện trong máu sau 15 phút và nồng độ đạt tối đa sau 2 - 4 giờ Kẽm bài tiết chủ yếu qua phân (10mg/ngày) và nước tiểu (0,5mg/ngày), qua mồ hôi (1 /1ml) và qua tóc, móng

Các nghiên cứu về hàm lượng các dạng đồng vị kẽm trong động thực vật còn

trong khoảng 0 - 0,4% trong não chuột và [24] cho biết 66Zn chiếm 0,8% trong

mô tế bào Các nghiên cứu về đồng vị kẽm trong cơ thể người mới có thông tin

66Zn chiếm 0,07 - 0,46% trong máu [36] Trong các đối tượng sinh học, bình thường tỷ lệ các đồng vị bền cũng gần giống với trong tự nhiên Ví dụ tỷ số hàm lượng các dạng đồng vị kẽm 67

Zn/66Zn trong sữa mẹ là 0,1472, trong máu là 0,1476 và trong huyết tương là 0,1475, gần với tỷ lệ các đồng vị trong tự nhiên của dung dịch chuẩn là 0,1470 Các giá trị trên tương ứng với tỷ số hàm lượng 70

Zn/66Zn lần lượt là 0,0224; 0,0222; 0,0221 còn trong tự nhiên tỷ số này là 0,0222 [19] Sự thay đổi tỷ lệ hàm lượng các đồng vị có lên quan đến các phản ứng bay hơi, ngưng tụ trong quá trình tinh chế kẽm hoặc các chuyển hóa sinh học trong cơ thể sống [25]

1.2 Phương pháp phân tích và đánh giá thành phần đồng vị kẽm

Trong tự nhiên, kẽm có năm đồng vị bền gồm 64

Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn và 70

Zn với phần trăm trung bình của mỗi dạng tương ứng là 48,63%, 27,90%, 4,10%, 18,75% và 0,72% [30]

Trong nghiên cứu về đối tượng sinh học, sự thay đổi tỷ lệ các đồng vị cho biết mức độ hấp thu và đào thải kẽm của cơ thể Hai tỷ lệ đồng vị thường được sử dụng để đánh giá là 67

1.2.1 Phương pháp phân tích phổ khối plasma cảm ứng (ICP-MS)

Các phương pháp phân tích phổ khối xác định đồng vị (kể cả đồng vị phóng xạ cũng như đồng vị bền) dựa trên tỷ số khối lượng/điện tích (m/z) của chúng

Phương pháp phân tích phổ khối ra đời khi Thompson nghiên cứu sự chuyển động của các ion mang điện tích dương trong trường điện từ vào năm

1910 Vào năm 1919, Aston đã lần đầu tiên ghi được phổ khối trên giấy ảnh, cũng từ đó Dempter đã thiết kế máy đo phổ khối đầu tiên với detector điện tử [14,21]

Phương pháp phân tích khối phổ bao gồm các quy trình: nạp mẫu, hóa hơi

và nguyên tử hóa, phân mảnh hóa và ion hóa các chất cần phân tích, tạo ra các ion dương 1 của chất phân tích dạng M1+

Phân giải và tách các ion theo giá trị m/z của chúng để tạo ra phổ khối của tất cả các chất phân tích và cuối cùng là phát hiện từng ion có giá trị m/z riêng Các số liệu thu được sau khi tiến hành phân tích giúp chúng ta định tính cũng như định lượng được các chất cần phân tích trong mẫu [1,2]

1.2.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ khối ICP – MS

ICP-MS là một phương pháp phân tích các chất vô cơ dựa trên sự ghi đo phổ theo tỷ số m/z của nguyên tử các nguyên tố và đồng vị cần phân tích ICP (Inductively Coupled Plasma) là ngọn lửa plasma tạo thành bằng dòng điện cao tần (cỡ MHz ) được cung cấp bằng một máy phát cao tần (RF) Ngọn lửa plasma

có nhiệt độ cao có tác dụng chuyển các nguyên tố có trong mẫu cần phân tích thành dạng ion MS (Mass Spectrometry) là phép ghi phổ theo tỷ số m/z

ICP-MS được phát triển vào đầu những năm 80 của thế kỷ trước, là sự kết hợp thành công của hai thiết bị phân tích là ICP và MS Có thể nói đây là một trong những phương pháp phân tích hiện đại nhất hiện nay và ngày càng chứng

tỏ được ưu điểm vượt trội so với các phương pháp phân tích khác trong nghiên cứu xác định lượng vết và siêu vết các nguyên tố cũng như thành phần đồng vị của chúng [3]

Phương pháp phân tích phổ khối ICP-MS dựa trên nguyên tắc của sự hóa hơi, nguyên tử hóa, ion hóa các nguyên tố hóa học khi chúng được đưa vào môi trường plasma, sau đó các ion này được tách ra khỏi nhau theo tỷ số m/z của chúng bằng thiết bị phân tách khối rồi được phát hiện, khuếch đại và đếm bằng thiết bị điện tử kỹ thuật số [3] Vì thế muốn thực hiện các công việc phân tích như trên chúng ta phải thực hiện theo trình tự sau [2]

- Trước tiên phải chuyển mẫu phân tích về dạng dung dịch đồng nhất

- Dẫn dung dịch vào hệ tạo sol khí, để tạo sol khí mẫu

- Dẫn thể sol khí vào ngọn lửa ICP (ICP Plasma Torch)

- Trong plasma Torch ICP, các chất sẽ hóa hơi các chất mẫu, nguyên tử hóa (phân ly thành nguyên tử tự do), ion hóa các nguyên tử của nguyên tố có trong chất mẫu

- Các quá trình xảy ra trong plasma ICP được biểu diễn như sau:

- Hóa hơi: MnXm (r)  MnXm (k)

- Phân ly: MnXm (k)  nM (k) + m X (k)

- Ion hóa: M(k)0 + E nhiệt  M(k)+

- Thu toàn bộ đám hơi ion khối m/z của chất mẫu, lọc, tách loại bỏ các phần

tử không ion sau đó dẫn chùm các ion M+

số khối (m/z) vào buồng phân giải phổ để phân ly chúng thành phổ theo số khối m/z của nó

- Dùng một loại detector phù hợp để thu nhận và phát hiện các số khối m/z của mỗi nguyên tố và đồng vị của nó có trong mẫu

- Ghi phổ khối để đách giá định tính và định lượng theo phổ thu được

Từ những nguyên tắc trên muốn thực hiện được phép đo phổ khối nguyên tử ICP-MS chúng ta phải có hệ thống trang bị hay máy quang phổ ICP-MS [1]

(8) Mẫu phân tích

(2) Nguồn ion hóa

(3)

Hệ quang ion

(5) Detector

(4) Phân giải khối

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý các bộ phận của hệ máy ICP – MS

1.2.1.2 Các nghiên cứu phân tích đồng vị kẽm bằng phương pháp

ICP-MS

Các nghiên cứu về phân tích đồng vị kẽm nhưng chủ yếu tập trung vào đối tượng thực vật, địa chất và môi trường được tiến hành bằng phương pháp ICP-

MS như [10,27,35]

Phép đo các đồng vị Zn trong phương pháp ICP-MS, thường được tiến hành trong nền HNO3 Với phép đo đồng vị kẽm có m/z+ là 64, 66, 67, 68 và 70 thì trong các môi trường khác nhau, ảnh hưởng mảnh ion đa nguyên tử cản trở đến phép đo có thể kể đến là : các mảnh 32

S16 O 16O+ (nếu đo trong nền H2SO4), 48

Ca16O+ nếu nền mẫu chứa nhiều thành phần khoáng, 31P18O2H+ (nều đo trong nền có axit photphoric Các mảnh ion của đa nguyên tử này trùng với phép đo đồng vị 64Zn Ngoài ra phép đo đồng vị 66

Zn+ sẽ bị ảnh hưởng bởi mảnh 31

P18O16OH+ [32] Các đối tượng mẫu có hàm lượng clorua cao có thể gây ảnh hưởng do trùng khối của phép đo 70Zn với 35

Cl2 +, 67Zn với 35

Cl16O2[19, 34] Khi xác định đồng vị kẽm trong đối tượng sinh học bằng thiết bị ICP-MS cũng cần lưu ý về việc dụng dung dịch thêm chuẩn của đồng vị giàu Trong số 5 đồng vị kẽm, vì hàm lượng 70Zn rất nhỏ so với các đồng vị còn lại nên cần được thêm vào mẫu để phân tích được, đồng thời có thể thêm đồng vị có hàm lượng lớn 67

Zn để so sánh [33]

Trong phương pháp này, hiện tượng trùng khối cần đặc biệt lưu ý đối với các thiết bị ICP-MS không sử dụng buồng va chạm động học để loại trừ ảnh hưởng Ví dụ trong phân tích mẫu địa chất, môi trường, ảnh hưởng của số khối 64

Ni trùng với phép đo 64Zn sẽ được hiệu chỉnh qua phép đo 62Ni Tương tự ảnh hưởng của 132

Ba2+, 134 Ba 2+ ,và 136

Ba2+( ảnh hưởng tới m/z+

của phép đo các đồng vị kẽm trong khoảng 66 đến 68) do đó cần xác định đồng vị 135

Ba2+và 138

Ba2+ để tính toán các ảnh hưởng của đồng vị này[12]

Vì vậy, khi nghiên cứu điều kiện tối ưu cần chọn nền mẫu đo phù hợp để loại trừ ảnh hưởng của mảnh ion đa nguyên tử hoặc dùng cột chiết pha rắn để tách loại ảnh hưởng của các chất đi kèm, đặc biệt đối với nền mẫu chứa nhiều chất béo, protein

1.3 Phương pháp xử lý mẫu, làm sạch mẫu sinh học

Xử lý mẫu là quá trình hòa tan và phá hủy cấu trúc của chất mẫu ban đầu, giải phóng và chuyển các chất cần xác định về dạng đồng thể phù hợp với phép đo

đã chọn, từ đó xác định hàm lượng các chất và đồng vị mà chúng ta mong muốn Việc phân tích thành phần các đồng vị kẽm trong đối tượng sinh học như mẫu huyết tương, nước tiểu và phân đòi hỏi quá trình xử lý mẫu phức tạp để tách lấy được kẽm ra khỏi các yếu tố ảnh hưởng đi kèm

Huyết tương trong máu cần tách khỏi tế bào và tiểu huyết cầu máu bằng phương pháp ly tâm, làm khô và tro hóa ở 4800C sau đó hòa tan tro bằng HCl 6M Mẫu phân sau khi làm khô được nghiền nhỏ, tro hóa và hòa tan như mẫu huyết tương [33] Sự có mặt của chất khoáng trong nền mẫu cũng gây ảnh hưởng rất lớn đến phép đo và cần loại trừ

Mẫu thực vật sau khi được phân hủy bằng HNO3 và H2O2 trong lò vi sóng được tách lấy kẽm ra khỏi nền mẫu bằng cột chiết pha rắn chứa nhựa Chelex-

100 sau đó đo tỷ số đồng vị (64

Zn + 66Zn)/68Zn bằng phương pháp ICP-MS [28]Trong một nghiên cứu khác[31] mẫu phân sau khi đã tro hóa ở 5000

C trong 10h được hòa tan trong HNO3 đặc và H2O2 đặc đến khi mất màu hoàn toàn

Việc tách và làm giàu ion kẽm hoặc các ion kim loại chuyển tiếp khác có thể thực hiện được bằng cách sử dụng nhựa trao đổi anion bazơ mạnh AG MP-1 có

hệ số phân bố cao [10]

Trong một nghiên cứu khác của [5], mẫu huyết tương được chuyển vào ống ly tâm 10 ml , thêm 2 giọt axit thiglycolic, trộn đều Thêm tiếp 3,0 ml HCl (2M) và 0,8 ml axit tricloroaxetic (40%), khuấy đều dung dịch trong 1 phút và ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút Để làm giàu Zn2+

và tách loại các ion cản trở trong các mẫu sinh học, nghiên cứu của, Zn2+

được hấp thụ dưới dạng phức với benzothiazolylazo)-8-hydroxyquinoline (BTAHQ) trên nhựa trao đổi anion dạng gel (Sephadex DEAE A-25)

5-(2-CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ thí nhiệm

2.1.1 Hoá chất

- Dung dịch chuẩn gốc : Zn2+ 1000 ppm trong HNO3 0,5M của hãng Merck

- Dung dịch chuẩn để xác định đồng vị : Từ nồng độ dung dịch chuẩn tổng đồng vị của kẽm, dựa trên phần trăm tồn tại các đồng vị trong tự nhiên lần lượt

là 64

Zn 48,63% ; 66Zn 27,90% ; 67Zn 4,10% ; 68Zn 18,75% ; 70Zn 0,72% sẽ tính được nồng độ mỗi đồng vị trong dung dịch chuẩn làm việc có chứa tổng nồng độ kẽm lần lượt là 10ppb ; 100ppb ; 200ppb ; 400ppb

- Dung dịch chuẩn làm việc Zn2+

được pha loãng hàng ngày từ dung dịch chuẩn gốc bằng axit HNO3 2%

- Nước deion, độ dẫn điện 18,2

- Amoni axetat 8M (Fisher, HPLC Grade, A639-500)

- Amoni axetat 1M (Fisher, HPLC Grade, A639-500)

- Các dung dịch để điều chỉnh pH: NaOH 3M, NaOH 10M, HCl 2M

- Axit HNO3 đặc, suprapure Merk

- Các dung dịch axit loãng HNO3 2,5M, HNO3 2M, HNO3 1% (OPTIMA, Fisher)

- Amoni hidroxit 2M Merck

- Các dung dịch axit loãng HCl 0,005M, HCl 0,5M, HCl 2,5M (OPTIMA, Fisher)

Hình 2.1: Hình ảnh máy ICP – MS (ELAN 9000- Perkin Elmer)

- Máy li tâm 800B (rotor cho các ống 50mL), hãng Hàn Quốc, tốc độ tối đa

4000 vòng/phút

- Cân phân tích OHAUS của mỹ có độ chính xác 0,01mg

- Máy đo pH, độ chính xác đến 0,01 đơn vị pH,của hãng HANNA

- Ống Cyro3,5mL chứa dung dịch gốc của AAS và ICP-MS

- Bình Teflon (đã được rửa axit) dung tích 50mL hoặc 100mL

- Khay đựng Pyrex và 4 cốc để bay hơi

- Cột sắc kí, chứa nhựa trao đổi ion Na+

, K+, Ca2+, Mg2+ với nắp đáy rad Poly-Prep (Cat No 731-1550, phòng thí nghiệm Bio-rad, Hercules, CA)

Bio Giá đựng ống tuýp, bình chứa dung môi (Poly-Prep Column Stack Cap, Cat No 731-1555, phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA)

- Micro pipet dung tích 1000 l và 500 l

- Đầu típ cho micro pipet 1000 l và 500 l

- Pipetmen và đầu típ

- Parafilm

- Giấy bọc bảo quản thực phẩm

2.2 Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu trong luận văn cũng là các mẫu nghiên cứu của đề tài đề

tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong điều trị hiệu quả bệnh lao của trẻ em” do

Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân chủ trì, phối hợp với Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ tiến hành có nội dung đánh giá mối liên hệ giữa bệnh lao và hàm lượng kẽm nội môi ở nhóm trẻ được điều trị lao và nhóm trẻ khỏe mạnh đối chứng ghép cặp thông qua việc phân tích các đồng vị bền của kẽm để xác định mức hấp thu kẽm của cơ thể theo đường bổ sung kẽm uống hoặc tiêm

Các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân được lấy từ trẻ em (9 đến 13 tuổi) bị bệnh lao tại Bệnh viện Phổi Trung ương được điều trị bằng bổ sung viên kẽm 7 mg/viên/ ngày và mẫu đối chứng Bệnh nhân sau khi uống thuốc 15 phút thì tiến hành lấy mẫu và lấy tất cả các mẫu nước tiểu và phân của bệnh nhân thải ra trong một ngày Mẫu máu được lấy 1 lần/ngày Mẫu thu thập xong thì bảo quản ngay trong tủ lạnh sâu – 400

C

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo ICP-MS khi xác định đồng vị

2.3.1.1 Sơ đồ nguyên tắc của thiết bị ICP-MS

Hệ thống phân tích ICP-MS có sơ đồ nguyên tắc theo như hình vẽ 2.2

9 8

7

6 5 4

Hình 2.2: Sơ đồ nguyên tắc thiết bị phân tích ICP-MS

1 Hệ bơm dẫn mẫu vào buồng tạo sol

khí

8 Detector

 Nhóm thứ 1: Là các thông số của máy đo phổ, như độ sâu của plasma

(SDe), thế của hệ thấu kính ion VTK, điều kiện chọn, lọc, hội tụ chùm ion, điều kiện tạo chân không, điều kiện thế quét và phân giải phổ chọn để đo, điều kiện

làm việc của detector EMD, v.v Các yếu tố này sẽ được khảo sát đơn biến

 Nhóm thứ 2: Các điều kiện tạo thể sol khí mẫu, điều kiện hoá hơi,

nguyên tử hoá chất mẫu và sự ion hoá nguyên tố phân tích tạo ra ion Me + , phần

tử sinh phổ Nhóm này là các yếu tố sau đây:

+ Công suất làm việc của máy phát cao tần HF, cung cấp năng lượng cho plasma ICP, để hoá hơi, nguyên tử hoá và ion hoá các nguyên tử của nguyên tố phân tích

+ Chiều sâu của plasma SDe (SDe: điểm thu dòng ion khối phổ),

+ Tốc độ dẫn mẫu vào buồng aerosol hoá, tạo thể sol khí

+ Loại kỹ thuật dùng để tạo sol khí mẫu (aerosol hoá mẫu)

+ Các điều kiện và cách khử phần đầu ngọn lửa ICP

Các điều kiện tối ưu phần này có thể khảo sát tự động theo chương trình của máy hoặc khảo sát đơn biến

 Nhóm thứ 3: Là chọn số khối m/Z của nguyên tố phân tích để phát hiện

và đo định lượng nó Đây là một yếu tố rất quan trọng, nếu chọn không đúng và

không phù hợp, có thể dẫn đến sự chen lấn của số khối của đồng vị khác, hay ion khối hai nguyên tử, gây ra sai số lớn Việc chọn số khối của nguyên tố phân tích phải:

+ Độc lập, không trùng, không bị chen lấn bởi khối của nguyên tố khác, + Pic phổ của chất phân tích phải nhạy và rõ ràng,

+ Nền 2 bên phải không lớn,

+ Cường độ của pic MS phải tuân theo đúng công thức tính cường độ Chỉ khi pic khối phổ m/Z của nguyên tố phân tích thoả mãn đầy đủ các điều kiện này mới được chọn để xác định một nguyên tố (cả định tính và định lượng)

Riêng với kẽm sẽ sử dụng cả 5 đồng vị để phân tích nên cần khảo sát các

yếu tố ảnh hưởng tới hiện tượng trùng khối do nền mẫu gây ra

 Nhóm thứ 4: Là các yếu tố vật lý, đặc biệt là độ nhớt của dung dịch

mẫu (tỷ trọng) Quyết định độ nhớt của dung dịch mẫu là thành phần chất nền

của mẫu phân tích, nồng độ axit và loại axit của dung dịch mẫu dẫn vào buồng tạo sol khí để đo phổ

Các axit lựa chọn để khảo sát là các axit thường sử dụng để xử lý mẫu và

các phi kim có mặt trong nền mẫu sau khi xử lý bằng axit

 Nhóm thứ 5: Là các yếu tố hoá học Có thể là:

+ Nồng độ và loại axit trong dung dịch mẫu đo phổ không dồng nhất, + Thành phần hoá học của mẫu phân tích,

+ Trạng thái, cấu trúc và dạng (loại) liên kết hóa học của chất phân tích, + Chất nền của mẫu và nồng độ của nó,

+ Yếu tố ảnh hưởng của một số cation và anion khác có trong mẫu phân tích (nguyên tố thứ ba),

+ Kỹ thuật chuẩn bị và xử lý mẫu phân tích

 Nhóm thứ 6: Là kiến thức và trình độ tay nghề của nguời làm phân

tích

Trong phạm vi luận văn, chúng tôi tập trung khảo sát ảnh hưởng của 3 yếu tố sau:

- Thế thấu kính ion - thuộc nhóm ảnh hưởng 1

- Công suất RF- thuộc nhóm ảnh hưởng 2

- Lưu lượng khí mang - thuộc nhóm ảnh hưởng 2

Với nhóm ảnh hưởng số 3; 4; 5 và 6, do đối tượng mẫu phân tích là mẫu huyết tương, nước tiểu và phân nên chỉ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của môi trường mẫu đo và nồng độ axit, một số ảnh hưởng trùng khối và sử dụng số khối mặc định cho 5 đồng vị kẽm để phân tích

2.3.1.3 Khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo vào các tham

số hoạt động của Plasma

Máy khối phổ plasma cảm ứng là một thiết bị hiện đại, phức tạp, có nhiều tham số hoạt động ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy và độ chọn lọc khi phân tích tổng hàm lượng cũng như thành phần đồng vị của nguyên tố Các tham số thuộc

về hệ thấu kính ion, hệ tứ cực, detector và các tham số thuộc về chế độ làm việc của plasma như công suất cao tần (radio frequency power-RFP), lưu lượng khí mang (carrier gas flow rate -CGFR), độ sâu mẫu (Sample depth -SDe), tốc độ bơm dẫn mẫu (peripump rate-PR)… cần được tối ưu để phép đo có độ nhạy cao , đồng thời sự hình thành các mảnh oxit và hidroxit thấp nhất, nhỏ hơn 1% và sự hình thành các ion đa nguyên tử nhỏ hơn 3% Các yếu tố ảnh hưởng không lớn

có thể tối ưu hóa một cách tự động hoặc có thể thay đổi theo phương pháp biến thiên từng yếu tố sao cho phù hợp với từng đối tượng mẫu khác nhau và chọn điều kiện đo sao cho đạt độ nhạy tốt và độ ổn định với phép đo cả 5 đồng vị kẽm

Để khảo sát, tìm các tham số hoạt động plasma tối ưu khi xác định 5 đồng vị của Zn với điều kiện PR là 0,1 v/s còn các tham số còn lại RFP, CGFR, SDe lần lượt thay đổi RFP thay đổi trong khoảng (900 đến 1500 W), CGFR thay đổi trong khoảng (1,0 đến 1,30 L/ph), SDe thay đổi trong khoảng (4,5 đến 8,5 mm), các tham số còn lại của máy ICP-MS như trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các tham số được lựa chọn tự động của máy ICP – MS ELAN 9000

đồng vị kẽm

Áp suất chân không

(khi đo mẫu)

1,0 -1,2 10-5 Torr

Áp suất chân không

(khi để máy Standby)

2.3.1.4 Nghiên cứu lựa chọn axit dùng làm môi trường dung dịch mẫu đo

và khảo sát nồng độ axit tối ưu

Dung dịch mẫu đo thường có môi trường axit Nhưng cần lựa chọn loại axit nào phù hợp nhất dùng làm môi trường trong dung dịch mẫu đo để hạn chế ảnh hưởng trùng khối của các mảnh khối đa nguyên tử Các khảo sát và lựa chọn nồng độ axit tối ưu được tiến hành bằng cách xác định đồng vị trong dung dịch chuẩn khi máy hoạt động với các tham số plasma tối ưu và nồng độ axit của dung dịch mẫu thay đổi

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu phân tích

Các qui trình xử lý mẫu được tham khảo từ các tài liệu, đã được nghiên cứu tối ưu và tiến hành tại Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Mỹ Do vậy, trong luận văn này chỉ đánh giá hiệu suất thu hồi khi thêm lượng biết trước các đồng vị kẽm vào các mẫu trắng phương pháp

2.3.2.1 Xử lý mẫu huyết tương

Cân khoảng từ 1,5-2,5g mẫu huyết tương trên cân phân tích và chuyển vào các bình Teflon của lò vi sóng Thêm 4,0 ml HNO3 đặc Đóng nắp bìnhvà đưa vào lò vi sóng Vận hành chương trình phá mẫu, (khoảng 40 phút) với thông số 600W, tăng tới 115 độ C trong 10 phút, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút Sau khi hoàn tất phá mẫu, để mẫu nguội trong 10 phút Lấy mẫu ra khỏi lò vi sóng, chuyển mẫu vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất đến vạch mức Đậy chặt nắp và lắc đều

Làm sạch mẫu trước khi phân tích bằng ICP-MS

- Lấy 10,00 ml mẫu sau khi đã định mức, cho vào cốc Teflon dung tích 50

mL, đun cho bay hơi (không đun sôi) toàn bộ mẫu đến khô (khoảng 2-3 giờ) trong tủ hút, ở nhiệt độ 1500C), cẩn thận không làm cháy mẫu Để nguội và thêm vào 10mL HCl 2,5M, khuấy đều và chuyển mẫu vào ống tuýp dung tích 15 ml để tiếp tục làm sạch Zn

Chuẩn bị cột chiết pha rắn: Xếp các cột sắc kí đã rửa sạch bằng axit lên giá

Tẩm ướt bông thủy tinh với nước loại ion để đảm bảo cột không bị tắc

Chuyển 1,0 ml nhựa AG1-X8 (cân bằng trước trong dung dịch HCl 0,005M) vào mỗi cột, thêm 10mL HCl 0,005M, sau đó bằng 10mL HCl 0,5M, tiếp theo là 5mL HCl 2,5M, cuối cùng bằng 1ml HCl 0,5M

Chuyển toàn bộ mẫu trong ống vào cột chiết pha rắn Rửa cột bằng 5mL HCl 2,5M, sau đó bằng 1mL HCl 0,5M Loại bỏ dung dịch chảy qua khỏi cột vào thùng chứa chất thải axit

- Cuối cùng rửa giải Zn2+ ra khỏi cột bằng 10mL HCl 0,005M vào ống tuýp nhựa Falcon

- Cho bay hơi phân đoạn rửa giải Zn2+ tới khô trong cốc Teflon đặt trong tủ hút (cẩn thận không đun sôi dễ làm cháy mẫu), khoảng 2h ở 150 độ C cho đến khi được chất rắn màu vàng nhạt

- Thêm 2mL HNO3 1% vào cặn rắn và chuyển tất cả vào ống cyro 2,5mL, chờ phân tích bằng ICP-MS Cứ 10 mẫu cần phân tích mẫu chuẩn và mẫu trắng

Công thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu huyết tương như sau:

V1 thể tích mẫu đo ICP-MS (lít)

ap khối lượng mẫu phân xử lý

n: độ pha loãng trong quá trình xử lý mẫu (n = 10)

Chú ý: Nếu nồng độ Zn trong dung dịch mẫu lớn khi phân tích bằng ICP-MS cần phải pha loãng mẫu 10 lần mẫu bằng cách thêm vào mỗi ống tuýp 200 l dung dịch mẫu gốc trong 3,8 ml HNO3 1% thành 4,00 ml dung dịch mẫu

2.3.2.2 Xử lý mẫu nước tiểu

Tiến hành giã đông hoàn toàn các mẫu nước tiểu thuộc cùng 1 đối tượng (16 mẫu trên 1 đối tượng) Sau khi giã đông xong tiến hành lắc xoáy kĩ Chuyển 45mL nước tiểu vào 3 ống nghiệm dung tích 15mL Li tâm mẫu bằng máy li tâm

ở 2000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó chuyển từng mẫu nước tiểu trong 3 ống nghiệm 15mL vào chung 1 ống nghiệm 50mL Thêm 70 L dung dịch amoni axetat 8M, lắc đều Điều chỉnh pH đến 5,3 ± 0,1 bằng dung dịch NaOH (3M hoặc 10M)

Tinh chế kẽm trong nước tiểu:

- Chuẩn bị nhựa Chelex:

+ Tiến hành cân bằng trước nhựa Chelex100 trong HNO3 2M trong 24h + Lắp cột sắc kí đã rửa bằng axít lên giá Làm ẩm bông thủy tinh bằng nước loại ion để đảm bảo cột không bị tắc Chuyển 2,0 mL nhựa Chelex vào mỗi cột, thêm 15mL nước đề ion, đậy nắp cột lại

- Trong tủ hút, thêm 7mL NH4OH 2M, bọc đầu cột bằng màng parafilm rồi lộn ngược cột, lắc đều và mở để NH4OH chảy qua cột (tránh tạo bọt trong cột) Rửa lại cột với ít nhất 30mL nước deion

- Chuyển toàn bộ mẫu nước tiểu lên cột, cho cột chảy với tốc độ 2 ml/phút, thêm 10mL dung dịch amoni axetat 1M bằng pipet 5mL để loại Na+

, Ca2+,

Mg2+ và K+

- Rửa giải kẽm ra khỏi cột bằng 15mL HNO3 2,5M vào các ống nghiệm nhựa 15mL Chuyển các mẫu sang cốc Teflon 50 hoặc 100mL đã rửa bằng axít, làm bay hơi đến khô ở 150 độ C, trong tủ hút khoảng 2 tiếng, có đậy đĩa Pyrex Khi mẫu đã khô, thêm 10mL dung dịch HCl 2,5N (2 lần mỗi lần 5mL) để chuyển qua cột sắc kí trao đổi anion

- Nếu không tiếp tục chạy sắc kí tiếp ngay, chuyển mẫu vào bình nón 15mL

có nắp

- Chuẩn bị cột sắc ký trao đổi ion AG1X-8

- Lắp các cột sắc kĩ đã rửa axit lên giá, tẩm ướt bông thủy tinh với nước loại ion để đảm bảo cột không bị tắc Chuyển 1,0ml nhựa AG1-X8 (đã được cho cân bằng trước sử dụng HCl 0,005M) lên từng cột Cân bằng nhựa với 10ml HCl 0,005M, sau đó bằng 10ml HCl 0,5M và 5ml HCl 2,5M

- Chuyển mẫu (đã qua cột Chelex trong môi trường HCl 2,5M) vào cột và cho chảy qua cột hoàn toàn Rửa cột với 5ml HCl 2,5M, sau đó với 1ml HCl 0,5M Loại bỏ nước rửa

- Cuối cùng rửa giải Zn2+ ra khỏi cột với 10ml HCl 0,005M vào ống nhựa 15ml

- Cho bay hơi hết dung môi trong bình Teflon, (cẩn thận không để mẫu bị cháy) trong tủ hút, ở 150 độ C trong khoảng 2 tiếng cho tới khi còn lại chất rắn màu vàng nhạt Chú ý không được để sôi mẫu

- Sau khi mẫu đã cạn thêm 2ml HNO3 1% Chuyển toàn bộ mẫu vào ống tuýp cyro 3,5ml để phân tích ICP-MS

- Công thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu nước tiểu như sau:

Trong đó: Cnt Nồng độ mẫu đo trên máy ICP – MS (ppb)

V1 Thể tích mẫu nước tiểu ban đầu (ml)

V2 Thể tích mẫu sau xử lý đo trên ICP-MS (lít)

n: Độ pha loãng trong cả quá trình phá mẫu với n = 10

2.3.2.3.Xử lý mẫu phân

Mẫu phân sau khi đã đông khô được nghiền mịn trong các bình xay bằng nhựa với máy xay Osterizer Các mẫu thu thập trong cùng một ngày có thể trộn chung và nghiền cùng nhau, đảm bảo rằng các mẫu được trộn đều trong máy xay

trước khi chuyển mẫu ra giấy nến và chuyển vào trong bình Phải đảm bảo tất cả

các mẫu trong hộp chứa được chuyển hết vào trong bình xay Mẫu sau khi nghiền được chuyển ra giấy nến, sau đó chuyển vào các bình Nalgen mới (đã được cân từ trước), tiến hành phá mẫu sử dụng lò vi sóng

Cân mỗi mẫu (từ 0,1 – 0,2g) và chuyển vào các bình Teflon, thêm 4,0 ml HNO3 đặc Đóng nắp ống và đưa vào lò vi sóng Tiến hành phá mẫu khoảng 40

phút với thông số 600W, 25% công suất lớn nhất, tăng nhiệt độ tới 115 độ C trong 10 phút, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút Sau khi hoàn tất phá mẫu, để mẫu nguội trong 10 phút Lấy mẫu ra khỏi lò vi song, định mức bằng nước deion đến 50 ml Đậy chặt nắp và lắc đều Mỗi lần phá đều tiến hành mẫu blank (mẫu trắng chỉ gồm axit và nước deion)

Cho bay hơi 10ml dung dịch mẫu vừa phá trên bếp gia nhiệt tới khô khô (trong tủ hút, ở nhiệt độ 150 độ C, khoảng 2h) trong bình Teflon 50 mL đã được rửa acid, cẩn thận không làm cháy mẫu, đậy mẫu bằng đĩa Pyrex bay hơi hết tới khô Để nguội và thêm vào mẫu 10mL HCl 2,5M

Mẫu phân tích chứa Zn2+

được làm sạch khỏi nền mẫu đi kèm bằng cột sắc ký chứa nhựa AG1-X8 như mẫu nước tiểu vá huyết tương ở trên

Công thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu phân như sau:

Trong đó: CF là nồng độ mẫu thực phân tích trên ICP – MS (ppb)

V1 thể tích mẫu sau xử lý, phân tích trên ICP-MS (lít)

aF khối lượng mẫu phân xử lý (g)

n: độ pha loãng trong quá trình xử lý mẫu (n = 50)

2.3.2.4 Phân tích tổng hàm lƣợng kẽm và đồng vị kẽm bằng trong viên thuốc kẽm

Bệnh nhân nhi đang điều trị lao được uống bổ sung viên kẽm (sản xuất từ muối kẽm gluconat hoặc kẽm sunfat và phụ gia có hàm lượng dự kiến ban đầu là

10 mg Zn/viên

Lấy 10 viên thuốc, bỏ vỏ bọc bên ngoài, cân tổng khối lượng thuốc có trong

10 viên (m1 gam) Cân khối lượng tương ứng với 1 viên thuốc (m2 gam), thêm HNO3 1 %, rung siêu âm đến khi thuốc tan hoàn toàn và định mức thành 50 ml Tiến hành phân tích bằng hai phương pháp AAS và ICP – MS

Công thức tính tổng hàm lượng kẽm

2 1

m2 là khối lượng của một viên thuốc đem đi phân tích (g)

700 là hàm lượng kẽm có trong 10 viên thuốc Công thức tính các đồng vị kẽm từ nồng độ Cx theo phương trình đường chuẩn là:

m1 là lượng cân mẫu thuốc đem đi xác định

50 là thể tích định mức sau khi đã xử lý mẫu

2.3.3 Phương pháp thống kê xử lý số liệu phân tích

2.3.3.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đồng vị

Giới hạn phát hiện là nồng độ của chất phân tích tương ứng với tín hiệu đo nhỏ nhất mà thiết bị có thể phát hiện được (định tính)

Giới hạn định lượng là nồng độ của chất phân tích tương ứng với tín hiệu

đo nhỏ nhất mà thiết bị có thể xác định được (định lượng)

Đối với thiết bị quang phổ plasma ICP – MS [3], giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của đồng vị được tính theo các công thức sau:

3 SbLOD

Trong đó: LOD là giới hạn phát hiện đồng vị (Limit of Detection)

LOQ là giới hạn định lượng đồng vị (Limit of Quantification)

b

S là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng

b là hệ số góc của đường chuẩn xác định đồng vị

Đo lặp mẫu trắng 10 lần, tính Sb theo công thức sau

2 1

1

n

i i

b

x x S

x là giá trị trung bình tín hiệu mẫu trắng của n lần đo lặp;

n là số lần đo lặp mẫu trắng

2.3.3.2 Khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị

Trong phép đo ICP – MS [15], việc định lượng một đồng vị dựa vào phương trình cơ bản

b ms

Để xác định khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị cần thiết lập đường chuẩn xác định đồng vị Tuy nhiên, phương pháp ICP –MS tín hiệu của phép đo

có thể thay đổi trong khoảng giá trị rất lớn nên khoảng tuyến tính của phép đo rất rộng (từ vài ppt cho đến vài chục hay vài trăm ppm) Do đó, đối với phép đo quang phổ plasma ICP – MS không cần chú ý nhiều đến giới hạn tuyến tính Thiết lập đường chuẩn xác định đồng vị bằng dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng phù hợp, nồng dộ thấp nhất của đồng vị trong dung dịch chuẩn không nhỏ hơn giới hạn định lượng của đồng vị đó Phải đảm bảo độ chính xác của phép đo ở mọi khoảng nồng độ của đường chuẩn, mỗi phép đo được thực hiện lặp lại 3 lần Sau đó sử dụng đường chuẩn được thiết lập để xác định nồng độ của đồng vị trong dung dịch chuẩn kiểm tra Đánh giá độ chính xác của phép đo qua kết quả tính toán độ chệch và độ lệch chuẩn tương đối của nồng độ đồng vị vừa xác định

2.3.3.3 Đánh giá phương pháp phân tích

Từ kết quả nghiên cứu thu được, tiến hành xây dựng phương pháp phân tích đồng vị kẽm trong các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân sau đó đánh giá phương pháp qua thông số như độ chính xác và độ thu hồi

*Đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích

Độ chính xác của phương pháp phân tích bao gồm độ đúng và độ chụm [4]

- Đánh giá độ đúng của phép phân tích qua độ lệch chuẩn (B) giữa giá trị kết quả phân tích SRM và giá trị đã được chứng nhận

Độ chệch kết quả phân tích được

SRM

X X B

RSD là độ lệch chuẩn tương đối (%)

X là lượng đồng vị xác định được (giá trị trung bình)

SRM

X là lượng đồng vị được chứng nhận (giá trị trung bình)

SD là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức sau:

X X SD

Thêm một lượng nhất định đồng vị cần xác định vào mẫu phân tích, tiến hành xử lý mẫu qua tất cả các bước theo quy trình phân tích, so sánh kết quả phân tích hàm lượng đồng vị trong mẫu sau khi được thêm vào đồng vị và kết quả phân tích hàm lượng đồng vị trong mẫu ban đầu

Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau:

C : Tổng lượng đồng vị xác định được trong mẫu sau khi

thêm dung dịch chuẩn

Sau khi đã kết luận được độ chính xác của phương pháp phân tích, áp dụng quy trình phân tích để xác định đồng vị kẽm trong các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp trên thiết bị ICP-MS

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn các tham số tối ưu của thiết bị đo

Phép đo các đồng vị kẽm trong mẫu sinh học và đánh giá sự biến đổi hàm lượng của các đồng vị được tiến hành với cả 5 đồng vị 64

Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn,

70Zn Vì vậy cần tìm điều kiện tối ưu có thể phân tích đồng thời 5 đồng vị này thông qua việc đánh giá sự phụ thuộc cường độ tín hiệu (CPS) của phép đo vào các tham số hoạt động plasma sao cho đạt được độ nhạy tốt và độ ổn định cao (RSD nhỏ)

3.1.1.1 Ảnh hưởng của thế thấu kính

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của cường độ tín hiệu phép đo hay số đếm (CPS) Zn vào RFP khi xác định các đồng vị 64

Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được trình bày từ hình 3.1 đến hình 3.5 (xem thêm trong phụ lục P1.6 đến P1.20) Khi cố định tốc độ bơm mẫu (PR) là 26 vòng/s, lưu lượng khí mang argon (NGF) là 0,7 lit/phút và thay đổi lần lượt thế thấu kinh ion từ 3V đến 9V thì cường độ tín hiệu thu được khi đo riêng rẽ 5 đồng vị kẽm phụ thuộc vào công suất máy phát cao tần được biểu diễn trong các hình từ 3.1 đến 3.5

Hình 3.1 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Hình 3.2 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Hình 3.3 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Hình 3.4 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Hình 3.5 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70 Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Kết quả biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị kẽm vào công suất cao tần (RFP) khi lượng khí mang (NGF) là 0,7 L/ph từ hình 3.1 đến hình 3.5 cho thấy đối với phép đo các đồng vị 64

Zn, 67Zn, 70Zn thì cường độ

tín hiệu tăng dần khi RFP tăng từ 900 đến 1400W (so với giới hạn cho phép của thiết bị đo là 1500W) do khả năng ion hóa mẫu cũng tăng, số lượng ion M+

hình thành tăng Thế thấu kính ion càng lớn thì sự tăng tín hiệu khi công suất máy phát cao tần tăng càng nhanh, kèm theo tín hiệu kém ổn định hơn Tuy nhiên, cường độ tín hiệu các phép đo đồng vị 66

Zn, 68Zn lại ít thay đổi Vì hàm lượng đồng vị 70

Zn trong mẫu rất nhỏ nên để tăng độ nhạy của phép đo chúng tôi lựa chọn thế thấu kính ion là 9V (lớn nhất có thể của máy đo) để cường độ tín hiệu phép đo cả 5 đồng vị kẽm với các thông số khác nhau đều thu các giá trị là cao nhất

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của công suất cao tần đến tín hiệu đo khi thay đổi lưu lượng khí mang là 0,8; 0,9 và 1,0L/phút (các hình P1.6 đến P1.20) cũng cho thấy qui luật biến thiên cường độ tín hiệu phép đo của các đồng vị 64

Zn, 67Zn và 70

Zn tăng tuyến tính theo RFP, còn đối với các đồng vị 66Zn và

68Zn thì cường độ tín hiệu phép đo phổ thay đổi không đáng kể Qui luật biến thiên tín hiệu này cũng không khác so với khi NGF là 0,7 L/phút

3.1.1.2 Ảnh hưởng của lưu lượng khí mang mẫu (NGF)

Dựa theo kết quả khảo sát ảnh hưởng của công suất máy cao tần (Phần

3.1.1.1) đến cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn với các giá trị NGF khác nhau tại

các vị trí thế thấu kính khác nhau đã xác định được với giá trị thế thấu kính LV

= 9V cho cường độ tín hiệu phép đo là lớn nhất Do đó trong phần này chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng khí mang NGF đến cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị Zn tại vị trí thế thấu kính LV = 9Volts nhằm mục đích tìm ra giá trị lưu lượng khí mang tối ưu nhất cho phép đo

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo vào NGF khi xác định các đồng vị 64

Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được trình bày ở các hình từ Hình P2.1 đến Hình P2.5

Đối với hai đồng vị 66Zn và 68Zn (hình P2.1 và P2.2) khi thay đổi lưu lượng khí mang NGF từ 0,6 – 0,9 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ tăng dần lên, nhưng khi lưu lượng khí mang lớn hơn 0,9 L/ph thì cường độ tín hiệu phổ bắt đầu giảm Trên đồ thị cho thấy tại NGF = 0,9 L/ph thì cho cường độ tín hiệu phép đo phổ đồng vị 66Zn và 68Zn đạt cực đại Do vậy chúng tôi chọn lưu lượng khí mang NGF = 0,9 L/ph và vị trí thế thấu kính LV = 9Volts khảo sát để xác định giá trị công suất cao tần RFP tối ưu cho phép đo phổ đồng vị 66Zn và 68

Zn

Kết quả khảo sát từ hình P2.3 đến hình P2.5 của các đồng vị 64

LV = 9V để tiến hành khảo sát công suất cao tần đối với phép phân tích các đồng vị 64

Zn, 67Zn và 68

Zn

3.1.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của công suất cao tần khi cố định LV và NGF

Để xác định công suất cao tần tối ưu cho các phép đo phổ các đồng vị Zn, trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép

đo phổ vào công suất cao tần RFP cụ thể cho từng đồng vị Zn như sau:

Hình 3.6 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP

Để xác định công suất cao tần tối ưu cho phép đo 2 đồng vị 66Zn và 68

Zn

chúng tôi lựa chọn NGF = 0,9L/ph và LV = 9 Volts (là giá trị tối ưu đã được

xác định theo phần 3.1.1.1 và 3.1.1.2) Kết quả khảo sát đồ thị hình P2.6 cho

thấy khi công suất cao tần tăng từ 900 - 1200 cường độ tín hiệu phép đo tăng điều này có thể giả thích là do khi năng lượng tăng sự hình thành ion của phép

đo tăng do đó cường độ tín hiệu phép đo tăng theo Nhưng khi công suất tăng vượt quá 1200W cường độ tín hiệu phép đo giảm dần nguyên nhân do năng lượng cao dẫn đến sự hình thành nhiều loại ion không mong muốn làm giảm lượng ion của phép đo do vậy cường độ tín hiệu phép đo phổ giảm Cường độ

tín hiệu phép đo đạt cực đại khi RFP = 1200W Sau khi đã khảo sát các như trên, chúng tôi chọn NGF = 0,9L/ph, RFP = 1200W và LV = 9 Volts cho phép đo phổ xác định 2 đồng vị 66Zn và 68

Zn

Biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ 64

Zn, 67Zn và 70

Zn theo công suất cao tần RFP khi NGF = 0,6L/ph (là lưu lượng khí mang tối ưu

đã khảo sát ở mục 3.1.1.2) ở hình 3.7 ta thấy, khi tăng công suất cao tần từ 900 – 1400W cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn tăng dần Điều này có thể giải thích khi cố định lưu lượng khí mang và thế thấu kính tăng công suất cao tần làm tăng

sự hình thành ion của phép đo do đó cường độ tín hiệu phép đo tăng theo Cường độ tín hiệu phép đo lớn nhất khi RFP = 1400W chúng tôi chọn NGF = 0,6L/ph, RFP = 1400W và LV = 9 Volts cho phép đo phổ xác định 2 đồng vị 64

Zn, 67Zn và 70

Zn

Hình 3.7 Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP

Nếu so sánh cường độ tín hiệu tại công suất cao tần lớn nhất có thể là 1400W và biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị của Zn vào lưu lượng khí mang NGF thay đổi từ 0,7 – 1,0 L/phút ở thế thế thấu kính là 9V thì tất cả đều cho thấy giá trị cường độ tín hệu phép đo lớn nhất khi

NFG là 1,0L/phút (hình 3.7) Do vậy, chúng tôi chọn 3 điều kiện này để phân tích các đồng vị 64

Zn, 67 Zn và 70 Zn Còn với hai đồng vị 66 Zn và 68 Zn thì chỉ cần chọn các điều kiện phân tích là NGF = 0,6L/ph, RFP = 1400W và LV = 9V (hình 3.6)