Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft Word Luan van ban nop 1 1 doc 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa PHÂN TÍCH BETA LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN V[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Như Hoa PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 z HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa Phân tích beta-lactam mẫu dược phẩm sinh học phương pháp HPLC Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Ri Hà Nội – Năm 2012 z MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10 1.1 Giới thiệu kháng sinh β -lactam 10 1.1.1 Lịch sử đời 10 1.1.2 Phân loại 10 1.1.3 Đánh giá tác dụng 10 1.2 Kháng sinh β-lactam 11 1.2.1 Định nghĩa .11 1.2.2 Cấu trúc phân loại .11 1.2.3 Tính chất vật lí hóa học .15 1.2.4 Tác dụng 15 1.2.5 Điều chế 16 1.2.6 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới .17 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 19 1.3.1 Phương pháp quang học .19 1.3.2 Phương pháp điện hóa 20 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) .20 1.3.4 Sắc ký mỏng ( TLC) 22 1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC) 22 CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu .25 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26 2.2.1 Thiết bị 26 2.2.2 Dụng cụ 26 2.2.3 Hóa chất 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.1 Khảo sát điều kiện xác định β – lactam LC/MS/MS 28 3.1.1 Khảo sát điều kiện chạy detector khối phổ .28 3.1.2 Chọn pha tĩnh 30 3.1.3 Chọn pha động .30 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 32 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 32 3.2.2 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ 37 3.3 Phân tích mẫu thực tế 38 3.3.1 Phân tích mẫu nước tiểu 38 3.3.2 Phân tích mẫu dược phẩm 49 3.4 Hướng phát triển đề tài 58 KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 z DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Phân loại cấu trúc số penicillin Phân loại cấu trúc cephalosporin Hằng số axit kháng sinh nghiên cứu Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Kết khảo sát bắn phá ion mẹ Năng lượng bắn phá ion beta-lactam Chương trình chạy gradien tối ưu rửa giải chất beta-lactam Thời gian lưu tr kháng sinh nhóm beta-lactam Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ beta-lactam Giới hạn phát giới hạn định lượng beta-lactam Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu Bảng 3.9 Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu Bảng 3.10 Khảo sát độ lặp lại độ thu hồi quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn nồng độ ppb Bảng 3.11 Khảo sát độ lặp lại độ thu hồi quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn nồng độ 100 ppb Bảng 3.12 Khảo sát độ lặp lại độ thu hồi quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn nồng độ 200 ppb Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Kết thực mẫu nước tiểu thực Thông tin mẫu thuốc phân tích Bảng tính khối lượng trung bình viên mẫu thuốc Khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc Khảo sát độ lặp lại độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn nồng độ 5ppb Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn nồng độ 100ppb Bảng 3.19 Khảo sát độ lặp lại độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn nồng độ 200ppb Bảng 3.20 Kết phân tích mẫu thuốc thực z DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo kháng sinh cephalosporin Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp beta-lactam 100ppb Hình 3.2 Đường chuẩn AMP Hình 3.3 Đường chuẩn PEN G Hình 3.4 Đường chuẩn PEN V Hình 3.5 Đường chuẩn OXA Hình 3.6 Đường chuẩn CLOX Hình 3.7 Đường chuẩn CEP Hình 3.8 Đường chuẩn CEF Hình 3.9 Đường chuẩn AMO Hình 3.10 Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 6h Hình 3.11 Sắc đồ phân tích mẫu thuốc z DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN: AMO AMP APCI CAD CE CEF CEP CLOX CUR CXP DP EP ESI GC – MS: GS1 GS2 HPLC IS LC-MS LOD LOQ MeOH OXA PEN G PEN V R% RSD% SPE TLC tr Acetonitrile Amoxicillin Ampicillin Ion hóa hóa học áp suất khí Áp suất khí mang tứ cực Q2 Thế áp vào tứ cực Q1 Cefaclor Cephalexin Cloxacillin Khí mang Thế áp vào tứ cực Q2 Q3 Thế đầu vào áp vào chắn Thế áp vào nguồn ion mẹ Ion hóa phun điện tử Sắc kí khí khối phổ Áp suất khí hai bên đầu phun Áp suất luồng khí nóng Sắc kí lỏng hiệu cao Thế ion hóa Sắc kí lỏng khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Methanol Oxacillin Penicillin G Penicillin V Độ thu hồi Độ lệch chuẩn tương đối Chiết pha rắn Sắc kí mỏng Thời gian lưu z MỞ ĐẦU Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, cúm, điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây loại virus, vi khuẩn Đối với nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ vị trí quan trọng nước điều kiện vệ sinh mức sống thấp nên thường xảy dịch bệnh Hiện giới người ta phát 8000 kháng sinh năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh phát Kể từ penicillin ALEXANDER FLEMING phát năm 1929 chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 nửa kỷ qua kháng sinh trở thành dược phẩm thiếu việc điều trị loại bệnh virus, vi khuẩn gây có tác dụng hẳn so với thuốc kháng khuẩn khác [1, 13] β -Lactam thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho người, thú y từ chúng giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 loại kháng sinh dùng nhiều Liều lượng cách dùng kháng sinh không dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ việc chữa trị khó khăn Ngồi cịn gây lãng phí cho người bệnh có bệnh virus khơng chữa kháng sinh dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đốn bệnh ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh máu gây bệnh thận, đặc biệt người cao tuổi Vì vậy, kiểm sốt phân tích thuốc kháng sinh người bệnh biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu sử dụng chúng Hai phương pháp thường dùng để phân tích β -lactam sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp điện di mao quản (CE) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu thời gian phân tích ngắn Tách xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector đại huỳnh quang, MS z mẫu dược phẩm sinh học hướng nghiên cứu mới, với ưu điểm bật độ nhạy độ chọn lọc ngày áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Xuất phát từ lý nên tơi chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam mẫu dược phẩm sinh học phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS z CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu kháng sinh β -lactam [1, 2, 11] 1.1.1 Lịch sử đời Năm 1929, Alexander Fleming phát khả kháng khuẩn nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu sử dụng kháng sinh, sau hàng loạt nghiên cứu, sản xuất sử dụng kháng sinh phát triển mạnh tác dụng hẳn điều trị bệnh nhiễm khuẩn so với thuốc kháng sinh khác Giới y học định nghĩa : Kháng sinh chất tạo thành chuyển hố sinh học, có tác dụng ngăn cản tồn phát triển vi khuẩn nồng độ thấp, sản xuất sinh tổng hợp tổng hợp theo mẫu kháng sinh tự nhiên 1.1.2 Phân loại Kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hố học gồm nhóm sau: - Kháng sinh β-lactam - Kháng sinh Aminoglycosid - Kháng sinh Tetracylin - Cloramphenicol dẫn xuất - Kháng sinh Macrolid - Kháng sinh Lincosamid - Kháng sinh polypeptide - Các kháng sinh khác: Rifamycin 1.1.3 Đánh giá tác dụng - Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho sản phẩm kháng sinh thiên nhiên, không nguyên chất - Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho chế phẩm kháng sinh bán tổng hợp z 1.2 Kháng sinh β-lactam 1.2.1 Định nghĩa Là kháng sinh mà phân tử chứa vịng β-Lactam Gồm nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem hai nhóm sử dụng phổ biến lớn penicillin cephalosporin Các penicillin thu từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA) Các cephalosporin tự nhiên phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ kháng sinh thiên nhiên 1.2.2 Cấu trúc phân loại * Các penicillin Các penicillin có cấu trúc gồm vòng: vòng thiazolidin, vòng β-Lactam R CO S N H C H3 N C H3 O COOM Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin Tên gọi chung cơng thức penicillin chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay R gốc khác nhau, cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có penicilin có độ bền, dược động học phổ kháng khuẩn khác Với M gốc cation thường là: K, Na, H Nhóm kháng sinh penicillin chia thành nhóm với hoạt tính khác z ...HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa Phân tích beta-lactam mẫu dược phẩm sinh học phương pháp HPLC Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN... hiệu kháng sinh, hạn chế chi phí y tế cứu đươc nhiều sinh mạng 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1 Phương pháp quang học Phương pháp đo quang phương pháp phân tích dựa tính... áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Xuất phát từ lý nên tơi chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam mẫu dược phẩm sinh học phương pháp HPLC? ?? sử dụng detector MS/MS z