Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (semliki forest virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở việt nam

Kenneth Lundstrom hãng d ược phẩm Roche, ThụySĩ và ngu ồn cADN mã hóa cho th ụ thể kết cặp G-protein neurokinin 1 NK1 củangười Việt Nam đã được phân l ập và nhân dòng thành công t ừ đề t

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 1.1 CÔNG NGH Ệ SINH HỌC PHÂN T Ử TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 3

1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm 3

1.1.2 Các hệ thống vector 4

1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein 9

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 13

1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) 13

1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản 14

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác ủca hệ vector SFV 17

1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN C ỨU 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 27

2.2.1 Chuẩn bị tế bào kh ả biến và bi ến nạp 28

2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit 29

2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dòng 29

2.2.4 Thiết kế mồi 30

2.2.5 Khuếch đại gen nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 31

2.2.6 Cắt ADN sử dụng enzym giới hạn và ch ống tự nối/đóng vòng 31

2.2.7 Tạo cácđoạn ADN sợi đôi và các linker từ cácđoạn oligonucleotit 32

2.2.8 Phản ứng nối cácđoạn ADN 33

2.2.9 Sàng l ọc khuẩn lạc 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ TH ẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào kh ả biến và bi ến nạp 35

3.4 Tạo ADN tái ổt hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến 463.5 Sàng l ọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1 50

KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ

Kết luận 52 Kiến nghị 52

TÀI LI ỆU THAM KHẢO

Tài li ệu tiếng Việt 53 Tài li ệu tiếng Anh 53 Tài li ệu tiếng web 57 PHỤ LỤC

Hình 1 Bốn họ thụ thể chính 3

Hình 2 Quy trình và th ời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái ổt hợp trong các hệ thống biểu hiện khác nhau 9

Hình 3 Hệ gen SFV tự nhiên 13

Hình 4 Cấu trúc vector pSFV cơ bản 15

Hình 5 Cấu trúc vector pHelper 15

Hình 6 Mô hình ho ạt động của hệ vector SFV 16

Hình 7 Cấu trúc của vector pJET1.2 23

Hình 8 Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1 25

Hình 9 Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7 25

Hình 10 Sơ đồ nghiên ứcu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 27

Hình 11 Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cải tiến 27

Hình 12 Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cơ bản 28

Hình 13 Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α 35

Hình 14 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã v ỏ capsit của SFV 38

Hình 15 Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã v ỏ capsit của SFV 39

Hình 16 Vị trí của đoạn chèn thứ 2 trong pHelper 39

Hình 17 Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1% 40

Hình 18 Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng cải biến 41

Hình 19 Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7 42

Hình 20 Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 43

Hình 21 Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase 43

Hình 22 Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV đã m ở vòng b ằng SmaI 45

Hình 25 Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8 48Hình 26 Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn

chèn NK1 50Hình 27 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 51

Bảng 1 Một số promoter được bổ sung vào các vectơ biểu hiện 6

Bảng 2 Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực 8

Bảng 3 Các vị trí cắt của một số protease phổ biến 8

Bảng 4 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên ứcu 24

Bảng 5 Trình tự các oligonucleotit ửs dụng trong nghiên ứcu 24

Bảng 6 Phản ứng cắt với enzym giới hạn 31

Bảng 7 Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN 32

Bảng 8 Thành ph ần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng 33

Bảng 9 Thành ph ần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính 33

Bảng 10 Điều kiện của phản ứng nối linker 34

Bảng 11 Tần số biến nạp của một số lô t ế bào kh ả biến 36

Bảng 12 Thành ph ần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã v ỏ capsit của SFV 38

Bảng 13 Thành ph ần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2 40

Bảng 14 Thành ph ần và điều kiện phản ứng PCR sàng l ọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 41

Bảng 15 Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho th ụ thể NK1 44

Bảng 16 Thành ph ần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI 44

Bảng 17 Thành ph ần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV đã m ở vòng b ằng XhoI 45

Bảng 18 Thành ph ần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vòng c ủa pSFV 46

Bảng 19 Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính 47

Bảng 20 Quy trình mở vòng pSFV c ải biến và ki ểm tra hiệu suất mở vòng .48 Bảng 21 Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến 49

Bảng 22 Thành ph ần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xácđịnh khuẩn lạc tái ổt hợp pSFV-NK1 50

Escherichia coli

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diaminetetraacetic)

Thụ thể kết cặp G- proteinkilobase (= 1000 bp)Lubertani BrothNeurokinin-1NucleotitOptical density (Mật độ quang học)Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)Axit ribonucleic

Semliki Forest VirutSuper Optimal broth with Catabolite repressionĐệm Tris/Axit acetic/EDTA

BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN

Ala (A): alanin

Ser (S): serinThr (T): threoninTry (W): trytophan

MỞ ĐẦU

Mặc dù là m ột ngành m ới ra đời nhưng những thành t ựu mà công ngh

ệ sinh học phân t ử (molecular biotechnology) đã mang l ại là r ất lớn Những

bước phát triển nhanh chóng c ủa công ngh ệ sinh học phân t ử trong các ĩlnh

vực như điều chế dược liệu, tạo ra kháng thể đơn dòng, s ản xuất vacxin,

thành công trong giải trình tự hệ gen người đã góp ph ần đắc lực giúp con

người trong công cu ộc đấu tranh chống bệnh tật và không ng ừng cải thiện,

nâng cao ch ất lượng cuộc sống

Ngày nay, bi ểu hiện protein tái ổt hợp là m ột phần quan trọng của công nghệ sinh học phân t ử với nhiều ứng dụng rộng rãi trong l ĩnh vực y dược Biểu

hiện được protein quan tâm trên tế bào động vật và ng ười có th ể giúp thiết lập

những mô hình điều trị bệnh bằng liệu pháp gen, bao gồm cả điều trị ung thư Biểuhiện protein tái ổt hợp đặc biệt là các protein thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor, viết tắt là GPCR) ph ục vụ hữu ích cho các nghiênứcu phát triển thuốc, tìm hiểu cấu trúc và chức năng sinh học của các thụ thể, qua đó làm sáng tỏ các conđường truyền tin nội bào Các protein thụ thể kết cặp G-protein liên quan

trực tiếp đến sự phát sinh nhiều bệnh lý ở người, là “ đích” có vai trò quan tr ọng bậc nhất trong các chương trình sàng l ọc các dược chất mới Các nhà khoa học

luôn mong mu ốn xây d ựng được các hệ thống biểu hiện GPCR chủ động ở mức

độ cao để dùng cho các nghiênứcu dược lý h ọc phân t ử, các thí nghiệm sàng l ọc

để phát hiện các dược chất mới và phát triển dược phẩm

Trên thế giới, một số hệ thống biểu hiện GPCR tiềm năng đã được thiếtlập và th ử nghiệm, chẳng hạn như hệ thống dịch mã phi t ế bào, các hệ thống biểu

hiện ở tế bào nhân s ơ (E.coli và Halobacterium salinarum) và nhân chu ẩn (nấm

men, côn trùng và động vật có vú) Một số GPCR đã được biểu hiện thành côngtrên các ệh thống này ở mức độ cao từ 1 đến 10 mg/l môi tr ường nuôi c ấy

[19] Trong các hệ thống biểu hiện trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki ForestVirut (SFV) được ghi nhận là m ột trong những hệ thống có nhi ều đặc

được thương mại hóa r ộng rãi do s ự độc quyền sử dụng tại một số phòng thínghiệm của các hãng dược phẩm (như Roche, Novartis).

Với tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực sinh – y – d ược và h ệ vectorSFV cơ bản được tặng từ GS Kenneth Lundstrom (hãng d ược phẩm Roche, ThụySĩ) và ngu ồn cADN mã hóa cho th ụ thể kết cặp G-protein neurokinin 1 (NK1) củangười Việt Nam đã được phân l ập và nhân dòng thành công t ừ đề tài ĐT-

PTNTĐ.2011-G/04, chúng tôi đề xuất và th ực hiện đề tài: “ Nghiên ứcu

phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và bi ểu hiện gen mã hóa th ụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiênứcu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam” v ới mục tiêu lâu dài là xây đựng được hệ thống biểu

hiện các protein GPCR có thể được dùng như một công c ụ công ngh ệ sinh họchiệu quả trong các nghiênứcu về sinh học thụ thể ở người Việt Nam sau này,đồng thời phục vụ cho các nghiênứcu dược lý h ọc, sàng l ọc và phát triển dược phẩm ở cấp độ phân t ử và t ế bào

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LI ỆU

1.1 CÔNG NGH Ệ SINH HỌC PHÂN T Ử TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR)

1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm

Thụ thể là m ột lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệungoại bào, truy ền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào d ẫn đến đápứng tếbào giúp cơ thể đápứng kịp thời với sự thay đổi của môi tr ường Để thực hiệnđược chức năng đó, th ụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một sốphân t ử tín hiệu đặc thù được gọi là ph ối tử (ligand) và ph ức hệ “ligand – th ụthể” s ẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đápứng tế bào [3]

Có 4 h ọ thụ thể chính (Hình 1), trong đó th ụ thể kết cặp G-protein (viếttắt là GPCR) là h ọ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33] Thụ thể kết cặpG-protein là nhóm th ụ thể xuyên màng sinh chất và ho ạt động nhờ sự kết cặpvới một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein) GPCR d

ẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thầnkinh, các chemokine…Trong c ơ thể, các GPCRđược biểu hiện trên hầu hết cáckiểu tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhauở người [52]

Hình 1 Bốn họ thụ thể chính (nguồn: Gunnar Schulte, 2008 [18])

Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa c ủa các GPCR là nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính nh ư tiểu đường, các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung th ư [31] Các GPCR là đích tác động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị

Riêng năm 2001, nhóm thu ốc này đem đến doanh thu trên 30 ỷt USD và ước

tính con số hiện nay còn cao h ơn [25]

Mặc dù GPCR có ý ngh ĩa thực tiễn to lớn song có hai tr ở ngại lớn khi

sử dụng các GPCR ựt nhiên (native) trong các nghiênứucdược lý h ọc phân t ử

và sàng l ọc thuốc Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở mức độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng t ế bào) nên thường không s

ẵn có để dùng cho các thí nghiệm sàng l ọc Thứ hai là trong các mô hình thử

nghiệm ở cácđộng vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic

alleles) khác nhau, dẫn đến có th ể có nh ững nhận định nhầm về khả năng

tương tác ủca các “thu ốc thử” (test compound) v ới các thụ thể đích nếu đối

tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm ph ổ biến nhất (các alen kiểu dại) Có thể nhận thấy những khó kh ăn trên có thể được khắc

phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR táiổ thợp của người Các GPCR tái ổt hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung

cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xácđịnh hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein Chính bởi vậy, xây d ựng các hệ thống biểu hiện GPCR nhanh và hi ệu quả là m ột hướng nghiên ứcu có ý ngh ĩa quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng l ọc và nghiên cứu pháttriển dược phẩm

1.1.2 Các hệ thống vector

Ý t ưởng về vector mang gen ngoại lai bắt nguồn từ các plasmit vi khuẩn Vector là phân t ử ADN có kh

ả năng tự tái bản, tồn tại độc lập trong tế bào ch ủ

và mang các gen cần chuyển Sau khi vector ngoại lai được đưa vào t ế bào ch

ủ, chúng sử dụng bộ máy sao chép ủca tế bào ch ủ để nhân b ản đến số lượngcần thiết và bi ểu hiện các gen chúng mang [1]

Đến nay, đã có h ơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit(nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhi ễm sắc thể nhân t ạo

[46] Chuyển gen vào các tế bào động vật có th ể tiến hành b ằng cách gây nhiễm các phagơ mang gen tái ổt hợp quan tâm ho ặc chuyển gen trực tiếp thông qua plasmit Có r ất nhiều vector biểu hiện trênđộng vật có vú có ngu ồn gốc từ virut

được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ lục-1).

Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn ph ụ thuộc vào nhi ều yếu

tố như các nhân tố kiểm soát phiên mã và ịdch mã, quá trình biênậtp và s ự ổn

định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các

protein tái ổt hợp với tế bào c ũng như cácđặc tính di truyền của tế bào ch ủ

Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích

sử dụng Không có h ệ vector nào toàn n ăng cho chuyển gen và bi ểu hiện mà c ần

có s ự chọn lựa tùy theo mục đích và kích th ước của đoạn gen được tạo dòng

[66] Các vector liênụct được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất và thuhồi protein ngoại lại một cách hiệu quả Dưới đây tóm l ược một số xu hướng cải tiến vectorphổ biến và ý ngh ĩa của chúng

1.1.2.1 Tạo các vector ADN ừt hệ gen virut có b ản chất ARN

Nhiều virut có h ệ gen ARN có ti ềm năng phát triển thành các vector biểu hiện mạnh Các phiên ảbn vector ADN của virut ARN được thiết lập là m ột

bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn cácđoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện chuyên biệt dành cho ARN và d ịch mã ARN có m ũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6] Nhiều nghiên ứcu xây d ựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được tiến hành, ch ẳng hạn như các hệ vector ADN có ngu ồn gốc từ ARN hệ gen của virut Sindbis [54]

1.1.2.2 Thêm hoặc cải tiến các vùngđiều khiển

Những hiểu biết ngày càng sâu s ắc về các trình ựt mã cho các tín hiệuđiều khiển quá trình phiên mã, biênậ pt mARN và d ịch mã có th ể thêm vàovector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý mu ốn

Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có x ương sống hoặc trình

tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng b ất cứ khi nào xu ất hiện đều làm tăng hiệu suất dịch mã ARN [1] Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuy ến

khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã n ằm ngược dòng ATG hay vùng

cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15]

Lựa chọn các trình ựt tăng cường hay các promoter mạnh có hi ệu suất

phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng

cường mức độ biểu hiện protein Bảng 1 trình bày m ột số promoter có th ể thêm

vào vector bi ểu hiện trênđộng vật có vú

Bảng 1 Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện

(nguồn: Gerstein, 2001 [15])

* Promoter SV40 sớm được coi là có độ mạnh là 1 để so sánh với các promoter

khác.

Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã ủca sinh vật nhân s ơ đã được nghiên

cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện Ở sinh vật nhân chu

ẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xácđịnh là vùng k ết thúc

phiên mã c ủa chín gen được nghiên ứcu [36]

Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân t ử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau

mARN có vai trò quan tr ọng giúp ổn định và d ịch chuyển ARN từ nhân ra t ế

bào chất để dịch mã M ặc dù trình tự polyA cách xađiểm khởi đầu dịch mã nh

ưng nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm t

ăng cường hiệu suất dịch mã [1] Có m ột số tín hiệu polyadenin hóa hi ệu quả

đã được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có ngu ồn gốc từ

gen mã cho hoóc môn t ăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm

của SV40 và gen mã cho thymidine kinase c ủa Herpes simplex

Các mã kết thúc (TAG, TAA, TGA) cũng có th ể xem xétđể thêm vào sau

vùng nhân dòng đa điểm nhằm tăng cường sự kết thúc dịch mã trong tr ường

hợp cácđoạn cài mã gen ngo ại lai thiếu các mã này hoặc để tăng hiệu quả hoạt

động của các yếu tố kết thúc dịch mã (RF) [1]

1.1.2.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòng đa điểm

Các phiênảbn vector đầu tiên dựa trên trình ựt nguyên gốc của plasmithoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế.Các vị trí nhân dòng đa điểm là n ơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rờilàm ch ỗ lắp rápđoạn gen ngoại lai vào Các trình tự này th ường nằm xa điểmkhởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm Để thuận lợi cho quá trình nhân dònggen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm cácđoạn nối (linker)mang vị trí nhân dòng đa điểm mới Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảmbảo không có trong trình t ự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym ớgi hạn tạođược đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2]

1.1.2.4 Thêm các vùng gen giúp sàngọcl thể tái ổt hợp

Các gen kháng kháng sinh giúpọnchlọc các dòng tế bào ch ứa vector tái

tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector Các gen kháng kháng sinh hayđược sử dụng là gen mã h ọ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tácđộng

ức chế hình thành thành t ế bào vi khu ẩn hoặc kanamycin, tetracyclin vàchloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổnghợp protein vi khuẩn

Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xácđịnh plasmit có ch ứa đoạn chèn

gen ngoại lai mong muốn cũng có th ể được cài vào vector Gen lacZ là m ột

gen báo cáođi ển hình, mã hóa cho β-galactosidase có kh ả năng cắt galactose Vị

trí nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và n ếu đoạn chèn được cài thành

công vào vector s ẽ làm b ất hoạt β-galactosidase Chính vì vậy, tế bào ch ứa vetor có đoạn chèn quan tâm có th ể được xácđịnh bằng phương pháp chọn khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2]

1.1.2.5 Thêm cácđoạn epitop và các vị trí cắt của protease

Trong vài n ăm gần đây, m ột số epitop peptit và protein r ất nhỏ còn đượcgọi là các đuôi ái lực (affinity-tag) được gắn vào protein tái tổ hợp để tăng cườngsản xuất các protein này [22] Cácđuôi ái lực này có đặc điểm chung là: không gâyđápứng miễn dịch; tinh sạch một bước bằng cột lọc có ch ất gắn thích hợp; có ảnhhưởng tối thiểu lên ấcu trúc và hoạt động sinh học của protein tái ổt

hợp mà nó g ắn vào; có th ể loại bỏ dễ dàng và đặc hiệu để sản xuất các protein dạng nguyên gốc; phân tích protein tái tổ hợp đơn giản và chính xác trong quá

trình tinh sạch; áp dụng được cho một số loại protein khác nhau Mỗi loại đuôi ái lực được tinh sạch với một loại đệm đặc hiệu và trong m ột số trường hợp các đoạn peptit này có th ể không c ần loại bỏ khỏi protein đích Cácđoạn peptit nhỏ được sử dụng nhiều nhất hiện nay là poly-Arg-tag, FLAG-tag, poly-His-tag, c-

myc-tag, S-tag và Strep II-tag Trình t ự của một số đuôi ái lực phổ biến được

Các trình ựt mã hóa cho v ị trí cắt của protease cũng thường được thêm

vào sau trình t ự của cácđuôi ái lực để loại bỏ cácđuôi ái lực này và thu h ồi dạngprotein tái ổt hợp nguyên bản Các vị trí cắt của một số protease được trình bày

trong Bảng 3 Các vị trí cắt của protease được lựa chọn sao cho không có v ị trí

tương tự trong protein tái ổt hợp được quan tâm

Bảng 3 Các vị trí cắt của một số protease phổ biến

1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein

Biểu hiện protein tái ổt hợp đã tr ở thành công c ụ chủ chốt trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong vòng 20 n ăm trở lại đây M ặc dù có nhi ều hệ thống biểu hiện đã được phát triển khá ốtt cho các protein hòa tan trong tế bào nhân s ơ và nhân th ật, thì đến nay biểu hiện hiệu suất cao và ch ủ động các protein xuyên màng tế bào v ẫn là m ột thách thức lớn Khả năng biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới cấu trúc và hình dạng của các loại protein này Các GPCR với 7 vùng xuyên màng được tạo ra ở mức độ thấp do yêu ầcu cuộn gập, vận chuyển và kh ả năng gây độc tính đối với tế bào

Hình 2 Quy trình và th ời gian yêu ầcu để sản xuất GPCR tái ổt hợp trong các

hệ thống biểu hiện khác nhau (nguồn: Nambi, 2003 [43])

Trong phần này, các tính chất cũng như những thành t ựu của các hệ thốngbiểu hiện bao gồm hệ thống dịch mã phi t ế bào, các vector nhân sơ và nhân chuẩn

sử dụng cho việc biểu hiện mạnh các GPCR táiổ thợp sẽ được trình bày tóm l ược(xem thêm Hình 2).Đa phần trong số chúng đã được sử dụng cho việc

biểu hiện GPCR tuy nhiên các nghiênứuccũng chỉ ra rằng: không có m ột hệ thống nào là toàn n ăng cho việc biểu hiện mức độ cao tất cả các loại GPCR.

1.1.3.1 Hệ thống dịch mã phi t ế bào

Hệ thống dịch mã phi t ế bào được xây d ựng từ dịch thủy phân E.coli

hoặc dịch thủy phân t ế bào m ầm lúa mì Hệ thống chứa các nhân tố tham gia phản ứng phiên mã và dịch mã đồng thời được cung cấp thêm liênụct các

nucleotit, các axit amin và các ợhp chất thiết yếu khác [37]

Hệ thống biểu hiện phi tế bào áp dụng để dịch mã nhanh các sản phẩmPCR mã cho các protein hòa tan đơn giản với lượng lớn cỡ hàng ch ụcmilligram một cách nhanh chóng (khoảng 4 ngày) Tuy nhiên, hệ thống dịch mãphi t ế bào vẫn tồn tại nhiều hạn chế như chi phí cao, quy trình kỹ thuật phứctạp Sự biểu hiện của các protein xuyên màngớln, đặc biệt là các GPCR chưatừng thành công b ằng sử dụng hệ thống này [26]

1.1.3.2 Biểu hiện ở tế bào nhân s ơ

Ưu điểm của biểu hiện trên cácế tbào nhân s ơ là chi phí r ẻ, đơn giản,nhanh (khoảng 11 ngày) và d ễ mở rộng quy mô s ản xuất các protein táiổ thợp.Tuy nhiên, hệ biểu hiện này có nh ược điểm cơ bản là không có c ơ chế biến đổisau dịch mã nên các protein phức tạp và l ớn, như GPCR, thường được biểu hiện

ở dạng không có ho ạt tính đầy đủ do không được cuộn gập chính xác hoặc được biến đổi sau dịch mã nh ư dạng tự nhiên [43]

Tuy vậy, đến nay một số GPCR đơn giản đã được biểu hiện bởi hệ thống

này nh ằm nghiên ứcu cấu trúc E.coli, Halobacterium salinarum, Lactococcus lactis

là nh ững chủng vi khuẩn được dùng làm t ế bào ch ủ biểu hiện phổ biến hơn cả 11 GPCR gắn đuôi His ở đầu C đã được biểu hiện trênE.coli với hiệu suất biểu hiện

khác nhau ừt 0.1 đến 10% tổng số protein tế bào [24] Th ụ thể muscaricnic M1 và serotonin 5-HT2C đã được tiến hành bi ểu hiện trên

H.salinarum [53] L lactis là m ột vi khuẩn Gram dương thường được sử dụng

để biểu hiện các protein màng nhằm xácđịnh dạng prokaryote nguyên gốc [28]

1.1.3.3 Biểu hiện ở nấm men

Ưu điểm của biểu hiện protein tái ổt hợp ở tế bào n ấm men là d ễ nuôicấy, thu được sinh khối lớn và có h ệ thống biến đổi sau dịch mã g ần tương đồngvới tế bào động vật Thụ thể dopamine D1A ở người đã được biểu hiện thành

công ở Saccharomyces cerevisiae và được thu hồi nhờ đuôi His 6 [4] Nấm

Schizosaccharomyces pombe sở hữu hệ thống truyền tín hiệu giống động vật có

vú và có th ể glycosyl hóa, th ụ thể dopamine D2 ở người đã được biểu hiện trên

màng n ấm S pombe với lượng cao gấp ba lần so với biểu hiện trênS.cerevisiae

[44] Nấm Pichia pastoris được đánh giá là chủng nấm biểu hiện gen tốt nhất bởi khả

năng biến đổi sau dịch mã bao g ồm glycosyl hóa, t ạo các liênếkt disulfit

và phân c ắt protein [7] Khoảng 100 GPCR trong chương trình nghiên cứu hệ

gen cấu trúc của MePNet đã được biểu hiện thành công v ới hiệu suất 95% ở

các tế bào P.pastoris.

Mặc dù vậy, thành t ế bào n ấm dày th ường được coi là m ột trong nhữngtrở ngại cho hiệu suất tinh sạch và thu h ồi protein tái ổt hợp Bên ạcnh đó, quytrình sản xuất GPCR ở nấm men cũng thường tốn nhiều thời gian (khoảng 18

ngày)

1.1.3.4 Biểu hiện ở các ết bào côn trùng

Ưu điểm lớn nhất của biểu hiện ở các ết bào côn trùng là t ế bào côn trùng

sở hữu một lượng lớn các quy trình cải biến giống với động vật có vú Thêm

nữa, các ết bào côn trùng được nuôi c ấy trong môi tr ường bán ổtng hợp nên dễ

dàng m ở rộng quy mô s ản xuất protein mặc dù chi phí cao hơn so với nuôi c ấynấm men và vi khu ẩn

Hệ thống vector baculovirut lây nhi ễm trên ết bào côn trùng được đánh giá là một trong những hệ thống biểu hiện GPCR hiệu quả nhất [35] Virut thuộcnhóm này được sử dụng phổ biến hơn cả là virut Autograha californica nuclear polyhedrosis (AcMNPV) AcMNPV có th ể lây nhi ễm các dòng tế bào côn trùng như Sf9 và Sf21 và nhân lên trong chúng Nhờ promoter của baculovirut hoạt

lượng lớn trong giai đoạn muộn của pha đóng gói h ạt virut mới (thường kéo dàikhoảng 2 giờ) Thời gian của một quy trình sản xuất protein GPCR tái ổt hợp kể

tử khi bắt đầu phân l ập gen đích vào kho ảng 21 ngày [23] H ệ thống vector baculovirut đến nay đã được sử dụng thành công trong s ản xuất nhiều thụ thể GPCR, như các thụ thể adrenegic, opioid, histamine, serotonine … nh ưng chủ yếu phục vụ cho các nghiênứcu về cấu trúc và chức năng của các thụ thể Các protein xuyên màng được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện baculovirut thường

có hi ệu suất thu protein vào kho ảng 18 đến 71 pmol/mg protein, nghĩa là t ăng hàng nghìn l ần so với mức biểu hiện trong tự nhiên [38]

Tuy nhiên, ựs khác biệt chính giữa tế bào động vật có vú và côn trùng luôn t ồn tại, ví dụ như quá trình N-glycosyl hóa ở tế bào côn trùng đơn giản hơn và ch ứa nhiều manose hơn tế bào động vật có vú [21]

1.1.3.5 Biểu hiện trên ết bào động vật có vú

Vật chủ tối ưu biểu hiện các gen mã cho GPCR của động vật có vú hiểnnhiên chính là cácết bào động vật có vú với đầy đủ các ơc chế biến đổi, vậnchuyển cũng như sự có m ặt của G-protein Các vector virut nhiễm trên ết bàođộng vật có vú có th ể cải thiện mức độ biểu hiện một cách hiệu quả nhờ có

kh ả năng di chuyển từ tế bào ch ủ này sang t ế bào ch ủ khác và có cácpromoter ấrt mạnh, những promoter này được đánh giá làđỉ“nh cao” c ủa biểuhiện gen

Gần như phần lớn các protein màng được sản xuất một lượng lớn trongmôi tr ường nuôi c ấy huyền phù dựa trên hệ thống biểu hiện của Semiliki Forestvirut (SFV) Đây là m ột loại alpha virut có h ệ gen ARN mạch đơn Hiệu quả biểuhiện các protein xuyên màng ủca người bởi hệ thống SFV trong một số trường hợp

tỏ ra hiệu quả hơn so với hệ thống biểu hiện baculovirut, có l ẽ nhờ khả năng biếnđổi protein sau dịch mã ở các dòng tế bào động vật có vú, như CHO, HEK hayU20S Các vector SFVđến nay đã được ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR và

m ức độ biểu hiện trong phần lớn trường hợp là r ất cao khi đo bằng phối tử đánhdấu và Western blot [32] Tuy v ậy, so với hệ thống biểu hiện của baculovirut, hệthống biểu hiện của SFV có giá thành cao hơn và v ẫn luôn cần sự quan tâm đáng

kể về khía cạnh an toàn sinh h ọc khi thao tác

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT)

1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV)

SFV là virut có h ệ gen ARN (+) thuộc họ Togaviridae, chi Alpha virut Nóđược phân l ập lần đầu tiên ừt muỗi ở Uganda năm 1944 [49] Đây là m ột virut

có c ấu trúc tương đối đơn giản Hệ gen SFV dài 11442 nucleotit (không tính mũ5’ và đuôi poly A) v ới 2 khung đọc mở mã cho 2 chu ỗi polyprotein (xem Hình 3) SFV có 4 protein phi c ấu trúc (non-structural proteins, viết tắt là nsPs) từ nsP1 đến nsP4 cấu thành nên enzym ARN replicase, còn lại là các protein cấu trúc vỏ capsit (protein C) và v ỏ ngoài (protein E1, E2, E3) M ột protein nhỏ 6 kDđược mã hóa trong vùng gen c ấu trúc không được dùng để cấu thành virut m

ới Các protein ấcu trúc được mã hóa b ởi đoạn ARN được ký hi ệu là 26S, trong khi các protein phi cấu trúc được dịch mã t ừ ARN 42S của hệ gen Cả protein cấu trúc và phi cấu trúc được tạo thành t ừ sự phân tách 2 chuỗi

polyprotein nhờ cơ chể cắt sau dịch mã [50]

Hình 3 Hệ gen SFV tự nhiên (nguồn: Lundstrom K., 2003 [32])

Trong chi Alpha virut, SFV được coi là h ệ thống biểu hiện gen tốt bởivòng đời virut ngắn, phổ vật chủ rộng, có kh ả năng tự nhân h ệ gen của bảnthân và ch ỉ cần bộ máy dịch mã c ủa vật chủ để tái ạto [14]

Trong chu trình nhân lên (tái ảbn) thông th ường, SFV lây nhi ễm vào t ế bào

ch ủ và kh ởi đầu quá trình nhân lên ằbng cách dịch mã ở 2/3 đầu 5’ c ủa đoạnARN(+) Đoạn polyprotein được dịch mã s ẽ phân c ắt thành 4 protein phi c ấu trúchình thành nên enzym ARN replicase Phức hệ ARN replicase có đích là trình tựđầu 3’ c ủa ARN (+), chúng tổng hợp lên ợsi ARN (-) có chi ều dài đầy đủ từ sợiARN (+) Protein cấu trúc cần cho lắp ráp virut trưởng thành được mã

hóa b ởi 1/3 đoạn gen còn l ại của hệ gen virut, vùng này được sao chép bằngenzym SFV replicase và d ịch mã cho ra protein v ỏ Protein vỏ capsit nhận tínhiệu đóng gói n ằm ở vùng mã hóa cho nsP2 và cùng v ới sợi ARN có chi ều dàiđầy đủ tạo nên nucleocapsit [13] Cấu trúc này dung hợp và m ọc chồi từ màng

t ế bào để tạo thành d ạng virut trưởng thành có kh ả năng lây nhi ễm

SFV không gây b ệnh truyền nhiễm ở người, mặc dù có m ột báo cáoềv một đợt bùng phát ốst nhẹ trong binh lính Phápở Cộng hòa Trung Phi được giả thiết là do SFV [39] Nhìn chung, SFV được coi là ít nguy hi ểm cho nhân viên phòng thí nghi ệm hơn các togavirut khác Vì những lí do này, SFV được phân loại là virut an toàn sinh h ọc độ 3 ở Mỹ, nhưng có m ột số khuyến cáo ằrng mọi hoạt động vẫn nênđược tiến hành ở độ 2 (U S HHS Publication no (CDC) 93-

8395, 1993) Ở Liên Minh Châu Âu, SFV được xếp là virut an toàn sinh h ọc độ

2 (E C Council Directive 93/88/EEC, 1993) Các vector biểu hiện SFV không mang các gen ấcu trúc được xếp vào an toàn sinh h ọc độ 2 ở cả Mỹ và Châu Âu [11]

1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản

Hệ vector SFV cơ bản chúng tôi được tặng bởi GS Kenneth H.Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) gồm vector nhân dòng các gen quan tâmpSFV dài 11489 bp và vector bi ểu hiện các protein ấcu trúc pHelper dài 8650 bp.Hai vector này có b ản chất là ADN, c ấu trúc cụ thể của chúng được nêuởdưới đây

1.2.2.1 Cấu trúc của pSFV cơ bản

pSFV chứa trình tự mã hóa cho ph ức hệ replicase gồm 4 protein phi cấu trúc (kí hiệu từ nsP1đến nsP4) dài 7381 Nu (nsP1: 86-1096 (737 axit amin), nsP2:1697-4090 (798 axit amin), nsP3: 4091-5536 (482 axit amin), nsP4: 5537-7378 (614 axit amin) Theo sau là vùng nhân dòng đa điểm và đoạn gen mã hóa cho protein cấu trúc đã b ị xóa đi phần lớn (∆sP) Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế nhưng có th ể cải tiến thêm cácị vtrí nhận biết cho các enzym mới bằng cách thêm những đoạn oligonucleotit thích hợp Ngoài ra, pSFV được cải tiến với promoter mạnh CMV, 3 mã k ết thúc nằm liên tiếp nhau sau vị trí nhân dòng đa điểm, đuôi polyadenyl và tín hi ệu kết thúc phiên mã ủca virut SV40

Hình 4 Cấu trúc vector pSFV cơ

bản 1.2.2.2 Cấu trúc của pHelper

Vùng gen mã hóa cho protein phi c ấu trúc của vector pHelper bị xóa b ỏphần lớn, chỉ giữ lại nguyên vẹn vùng gen mã hóa cho các protein cấu trúc (sPs)tham gia vào vi ệc đóng gói virut pHelper có các promoter CMV/T7, prom otersubgenomic, đuôi polyadenyl đảm bảo cho quá trình phiên mã các genấuc trúcinvivo có th ể diễn ra

Hình 5 Cấu trúc vector pHelper

Sự đồng biến nạp các ARN ừt vector pSFV và vector helper theo t ỉ lệmol 1:1 vào cùng m ột dòng t ế bào t ạo ra sự đóng gói invivo c ủa ARN tái ổthợp hình thành nên các ạht virut SFV (Hình 6).

Hình 6 Mô hình ho ạt động của hệ vector SFV

Nhìn chung, hệ SFV cơ bản được thiết kế có nh ững ưu điểm sau:

- 2 plasmit riêng biệt của virut đều biến nạp nhanh và đơn giản, thu hoạch viruttrưởng thành sau 1-2 ngày, không yêu c ầu tái ổt hợp

- Dải vật chủ lây nhi ễm rộng, cho phép chọn được các dạng biến đổi sau dịch

mã phù h ợp

- Sản lượng protein cao, có th ể tạo ra 25% tổng số protein của tế bào và có thể tạo

ra lượng protein đủ cho cả một gia đình sống trong vài n ăm

- Có tính an toàn cao nh ờ các yếu tố:

+ Các vector cADNđược sử dụng đều có ngu ồn gốc từ một dòng đã được làm suy y ếu khả năng gây b ệnh

+ Các gen ấcu trúc và các gen táiảbn của SFV được tách và tái ấcu trúc thành

2 vector riêng biệt (replicon và helper) nên virut này mất khả năng tái ảsn xuất qua mỗi chu kì

tế bào Chính vì lí do này, h ệ vector SFV còn được gọi là h ệ vector virut “t ự tự tử”

+ Phức protein p62 (gồm E3và E2) không được phân tách thành 2 tiểu phần

do có 3 thay đổi về axit amin Để tránh hoạt hóa virut, p62 ph ải được cắt nhờ chymotrysin,nên virut chỉ nhiễm sau khi hoạt hóa b ằng chymotrypsin

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác ủca hệ vector SFV

Hệ vector SFV không ch ỉ là m ột trong những hệ vector biểu hiện GPCR hiệu quả nhất, phục vụ đắc lực cho các nghiênứcu sàng l ọc dược phẩm mà còn

có r ất nhiều tiềm năng ứng dụng trong các ĩlnh vực khác Dưới đây là m ột số ứng dụng nổi bật của hệ vector SFV

1.2.3.1 Ứng dụng trong liệu pháp gen

Mục đích ban đầu khi nghiên cứu về SFV là tìm hi ểu hoạt tính sinh bệnhcủa nó, tuy nhiên có một số đặc điểm của SFV cho thấy nó có th ể được cảibiến để chữa bệnh hơn là nh ững tác hại mà nó gây ra

Nghiên ứcu các dòng tế bào nhi ễm SFV cho thấy: vùng gen mã hóa choprotein phi cấu trúc của SFV cần cho sự cảm ứng chết theo chương trình(apoptosis) Sự mất phần gen nsP2 hủy bỏ đồng thời sự cảm ứng apoptosis và s ựtổng hợp ARN virut [17] Cảm ứng chết theo chương trình bởi SFV không ph ụthuộc p53, do đó không gây th ương tổn cho ADN tế bào M ột cơ chế khả thi giảithích cho sự cảm ứng chết theo chương trình do SFV là s ự hoạt hóa protein kinasephụ thuộc ARN mạch đôi [30] Vì các tế bào H358a ch ết theo chương trình không

ph ụ thuộc p53 do SFV hoặc vector SFV là các tế bào ung th ư phổi

17

của người mang đột biến mất p53, điều này g ợi ý v ề tính khả thi của việc

dùng SFV và vector SFV để cảm ứng apoptosis ở tế bào ung th ư

Vector SFV có m ức độ biểu hiện cao và có kh ả năng gây d ừng quá trìnhtổng hợp protein của tế bào ch ủ cũng như kích hoạt chết theo chương trình của

tế bào ch ủ nênđược nhắm đến sử dụng trong liệu pháp genđể điều trị ung thư Bằng cáchđếm tế bào theo dòng, s ố lượng tế bào ch ết theo chương trình tăng mạnh khi biến nạp virut SFV-LacZ vào dòng t ế bào u tuy ến tiền liệt và sinh thi

ết thu từ người bệnh [56] Tiêm ARN SFV-LacZ ũcng kéo dài sự sống của chuộtBALB/c bị ung thư [55] Chuyển gen interleukin-12 (IL12) chuột nhờ vector SFV cho thấy có th ể gây suy thoái và ức chế khối u B16 thông qua vi ệc ức chế hình thành m ạch máu quanh khối u [5] Các nghiênứcu cho thấy không có d ấu hiệu bịđầu độc ở chuột đã x ử lý SFV-IL12 và hi ệu quả chống khối u có th ể được

tăng cường bằng việc cách tiêm nhắc lại hạt SFV tái ổt hợp

1.2.3.2 Ứng dụng trong sản xuất vacxin

Các vector SFVđược coi là m ột công c ụ vector dẫn truyền gen lý t ưởng làm vacxin cho ng ười và động vật Đầu tiên, ựs sao chép ARN của SFV diễn ra

ở tế bào ch ất, không có nguy c ơ dung hợp gen của virut vào nhi ễm sắc thể tế bào chủ Các nghiênứcu khác ũcng cho thấy, nhiều người và động vật không có miễn dịch tiền nhiễm chống lại vector SFV Khả năng gây ch ết theo chương trình do nhiễm virut giúp hệ gen của virut không t ồn tại dai dẳng trong các mô và gi ải phóng các protein kháng nguyên mã hóaừt gen ngoại lai Một lợi thế nữa là SFV có ph ạm vi vật chủ rộng, xâm nhi ễm nhiều loại

miễn dịch ở khỉ (SIV) được bảo vệ khỏi căn bệnh gây ch ết người này [41] G ầnđây, h ạt SFV biểu hiện kháng nguyên kháng ốkhiu P815 đã t ạo ra phản ứng mạnhcủa tế bào T và b ảo vệ cơ thể chống lại sự phát triển của khối u P815.

Ngoài ra, k ỹ thuật tiêm trực tiếp axit nucleic đã được sử dụng cho vector SFV Tiêm vector SFV ARNđã chèn gen cúm NP vào cơ chuột đã thu được đáp ứng dịch thể cao [56] Lợi ích của việc sử dụng ARN trần gây mi ễn dịch là độ antoàn cao h ơn do ARN trần kém bền và không có s ự sát nhập vào h ệ gen của tế bào ch ủ Gần đây, vector ARN tr ần biểu hiện glycoprotein gp41 HIV-1 được tiêm vào bắp chuột để hình thành kháng thể đơn dòng [16] Vector ADN SFV mớiđược xây d ựng gây đápứng miễn dịch tế bào và mi ễn dịch thể dịch cao hơn các plasmit ADN thông thường Trong các nghiênứcu khác, vector SFV (dạng ARN hoặc ADN) và h ạt SFV tái ổt hợp được ứng dụng để tạo ra các kháng

nguyênđơn dòng ch ống lại các protein prion [27]

1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV

Mặc dù có nhi ều ứng dụng khác nhau và có khả năng biểu hiện gen hiệu quả, vector SFV vẫn cần được cải tiến thêm Sauđây là các yếu tố có th ể cải tiến trong hệ vector SFV

1.2.4.1 Vùng nhân dòng đa điểm

Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế (chỉ có v ị trí nhận biếtcủa 3 enzym), chúng ta có thể cải tiến bằng cách bổ sung thêm cácị vtrí nhậnbiết enzym giới hạn mới giúp việc nhân dòng các gen sẽ trở nên linh hoạt vàthuận lợi nhờ có th ể lựa chọn thêm nhiều tổ hợp các enzym giới hạn phục vụcho nhân dòng và bi ểu hiện các gen GPCR mong muốn

1.2.4.2 Yếu tố tăng cường dịch mã

Frolov và Schlesinger (1994) đã tìm th ấy đoạn trình tự tăng cường dịch

mã n ằm ở gen mã hóa v ỏ capsit xuất hiện ở Sindbis virut, một virut có c ấu trúckhá ươtng đồng và cùng nhóm phân lo ại với SFV[12] Nhiều nghiên ứcu sau này đã cho th ấy, khi thêm vùng ătng cường trên vào các vector biểu hiện, không

dịch mã lên 10 đến 100 lần [10] Các nghiênứcu gần đây c ũng cho thấy trên SFV

có 102 nucleotit đầu tiên mã hóa cho protein vỏ capsid cũng có kh ả năng tăng cường dịch mã cho nh ững gen xuôi chi ều và cùng n ằm trong khung đọc mở với đoạn trình tự này [48] Thêm đoạn trình tự mã hóa cho v ỏ capsit SFV vào trước vị trí nhân dòng có th ể biểu hiện GPCR hàm l ượng cao như một protein liên hợp với protein vỏ capsit

1.2.4.3 Gắn FLAG-tag

FLAG-tag hay FLAG octapeptit có b ản chất là đuôi polypeptit g ồm 8 axitamin ưa nước có th ể gắn vào protein quan tâm (B ảng 1) Cấu trúc của FLAG-tag đã được tối ưu để tương thích với protein mà nó g ắn vào Đây là đoạnpolypeptit ưa nước hơn so với hầu hết các epitop thông thường khác và do vậy

ít có kh ả năng gây bi ến tính hoặc bất hoạt các protein mà nó gắn vào FLAGpeptit liên kết với kháng thể M1 Protein tái ổt hợp có g ắn đuôi FLAG-tag có th

ể được phân l ập bằng sắc kí ái ựlc và được xácđịnh bằng kháng thể tương tácvới đoạn FLAG-tag Protein tái ổt hợp được gắn FLAG-tag đã được biểu hiệntrong nhiều loại tế bào, t ừ vi khuẩn tới nấm men và t ế bào động vật có vú [29]

FLAG-tag có th ể được gắn vào đầu N hoặc đầu C của phân t ử protein tái tổ hợp, tuy nhiên có nhiều kháng thể chỉ có th ể nhận biết các epitop khi chúngở đầu tận cùng N của protein FLAG-tag có th ể được sử dụng liên hợp với các tag có ái lực khác như His-tag hay myc-tag Ngoài ra, FLAG-tag ở đầu tận cùng N có th ể được loại bỏ dễ dàng t ừ các protein sau khi chúngđã được phân l ập bằng cách xử lý v ới protease như enterokinase [51]

1.2.4.4 Đuôi polyhistidin (His-tag) và v ị trí thrombin

Tinh sạch protein với đuôi polyhistidin (His-tag) là ph ương phápđược sử dụng phổ biến nhất và đã áp dụng thành công trong các hệ thống biểu hiện protein tái ổt hợp ở nhân s ơ, nấm, các ết bào động vật có vú và t ế bào côn trùngnhiễm virut baculo [47] Histidin là axit amin t ương tác mạnh nhất với các ion kim loại nhờ dễ dàng hình thành liên kết giữa nhóm cho điện tử trên vòng

imidazole của nó v ới kim loại Polyhistidin (His-tag) là m ột đoạn axit amin chứa

ít nhất 5 histidin, thường được gắn vào đầu tận cùng C hoặc N của protein tái

ổt hợp và có th ể được loại bỏ bởi các endopeptidase như Qiagen TAGZymeÒ

His-tag thường được sử dụng để tinh sạch protein tái ổt hợp qua sắc kí áilực của đuôi His-tag v ới các ion kim loại chuyển tiếp như Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2 + được cố định trên chất nền và các chuỗi axit amin đặc hiệu [20] His-tag cũng được sử dụng để phát hiện protein trong các phản ứng tương tác ửs dụng khángthể Anti-HisG, phản ứng ELISA, Western blot cũng như các phản ứng phân tích miễn dịch khác.Đuôi His–tag có th ể được loại bỏ nhờ có v ị trí cắt thrombin có trình tự SGLVPR (liên kết peptit sẽ cắt giữa V và P) V ị trí thrombin được gắn vào nhi ều hệ vector cho phép loại bỏ vùng ngược chiều, chủ yếu là các đuôi áilực

Hệ vector SFV là m ột hệ thống tiềm năng với nhiều ưu điểm, có th ể được nghiên ứcu cải tiến thêm nhằm phục vụ cho biểu hiện protein màng nói chung và

các GPCR nói riêngở mức độ cao Mặc dù vậy chưa có nhi ều nghiên ứcu nhằm cảitiến hệ vector này Ở Việt Nam, sử dụng hệ SFV để biểu hiện các GPCR là hướng nghiên ứcu mới song có nhi ều tiềm năng phục vụ cho các nghiênứcu

dược lý phân t ử và sàng l ọc dược chất từ các nguồn dược liệu tự nhiên ủca

Việt Nam Chính vì vậy, chúng tôi đã ti ến hành th ực hiện đề tài “ Nghiên ứcu

phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và bi ểu hiện gen mã hóa th ụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiênứcu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam”v ới mục tiêu nghiênứcu chính là: phát triển hệ vector SFV

dựa trên vector SFV ơc bản cho phép biểu hiện các GPCR táiổ thợp mà b ướcđầu là gen mã th ụ thể Neurokinin 1 với đủ hoạt tính với hiệu suất cao

Để thực hiện mục tiêu nghiênứcu trên, chúng tôiđã ti ến hành m ột số nộidung nghiên cứu sau:

1) Hoàn thi ện quy trình chuẩn bị các lô tế bào kh ả biến DH5α có hi ệu suấtbiến nạp đủ cao cho phép nhân dòng t ất cả các plasmit ủca hệ vector SFV cơ bản một cáchthuận tiện, dễ dàng

2) Chuyển hệ vector SFV cơ bản và được cải biến vào các tế bào kh ả biến DH5α để lưu giữ, nhân dòng

3) Cải biến hệ vector SFV cơ bản.

4) Tạo ADN tái ổt hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản và h ệ vector SFV cải biến

5) Sàng l ọc chủng vi khuẩn chứa vector tái ổt hợp SFV mang gen mã hóa NK1

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN C ỨU

2.1.1 Các chủng vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α đã đột biến, có nh ững thiếu hụt thuận lợi cho

biến nạp và nhân nhanh plasmit ho ặc cosmit tái ổt hợp mua của hãng Invitrogen (Mỹ)

- Chủng vi khuẩn chứa plasmit pJET1.2 mang gen tái ổt hợp mã hóa cho thụ thểNK1 (pJET1.2-NK1) được cung cấp bởi PGS.TS Võ Th ương Lan, trường Đại học Khoa học

tự nhiên Hà Nội

Hình 7 Cấu trúc của vector pJET1.2

Trình tự đoạn cADN mã hóa cho th ụ thể NK1 được đưa vào vetorpJET1.2:

2.1.2 Hệ vector SFV

Hệ vector SFV cơ bản gồm vector pSFV và vector pHelper là quà t ặng

từ TS Kenneth H Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) tặng có c ấu trúc như

trình bày ở phần tổng quan (xem mục 1.2.2, các hình 4 – 6)

2.1.3 Các ặcp mồi PCR và các đoạn oligonucleotit dùng để cải biến

vector

Các cặp mồi PCR dùng để nhân các phân đoạn ADN đặc hiệu của vector

SFV hoặc của gen NK1 được thiết kế bằng các phần mềm (Primer Premier 5 và

PerPrimer, Ver 1.1.14) có v ị trí được minh họa trên hình 8 và có trình tự được

trình bày trên bảng 4 Cácđoạn oligonucleotit được dùng để cải biến vector,

đoạn trình tự đa nhân dòng O-M7 và đoạn nối (linker) M3 – M4 l ần lượt được

trình bày trên bảng 5, hình 9

Tất cả các mồi PCR và các đoạn oligonucleotit được đặt mua từ hãng IDP

(Mỹ) qua Công ty TNHH v ật tư KHKT Đông D ương (Hà N ội, Việt Nam)

Bảng 4 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Hình 8 Vị trí các mồi trên cADNmã cho th ụ thể NK1

Bảng 5 Trình tự các oligonucleotit ửs dụng trong nghiên cứu

(gọi là đoạn O-M6)

điểm cải tiến O-M7

2.1.4 Các nhóm hóa chất chính được sử dụng

- Nhóm hóa ch ất cải biến vector SFV gồm có: các hóa chất sử dụng trong phản ứng nhân b ản gen cần phân tích (PCR) nh ư đệm, dNTP, MgCl2, các polymerase, mồi đặc hiệu, các enzym giới hạn và đệm tương ứng với các enzym

- Nhóm hóa ch ất chuẩn bị tế bào kh ả biến và bi ến nạp plasmit vào t ế bào DH5α gồm dung dịch CaCl2 0.1M, dung dịch MgCl2 2M, dung dịch MgCl2-CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2), dung dịch Glucosse 1M, dung dịch KCl 250 mM, môi tr ường LB lỏng

để tăng trưởng chủng ban đầu, kháng sinh thích hợp (ampicillin), môi tr ường SOC

- Nhóm các hóa chất tách plasmit gồm Sol I ( glucose 50 mM; đệm

Tris-HCl, 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM); Sol II (NaOH 0,2N, 1% SDS); Sol III(CH3COOK 5M: 60 ml, CH3COOH băng: 11,5 ml, H2O: 28,5 ml, Rnase 10 mg/

ml không ch ứa DNase) Phenol: chloroform: isoamylalcohol được trộn theo

tỷ lệ 25:24:1 về thể tích, trong đó phenol có pH 8.0; ethanol; đệm TE (10 mMTris-HCl 10 mM, pH 8,0 có ch ứa EDTA 1mM); isopropanol; dung dịch axetatekali 5M

- Nhóm hóa ch ất cho phản ứng cắt – n ối ADN được cung cấp bởiFermentas gồm các enzyme giới hạn FastDigest, T4 DNA ligase, FastAPThermosensitiveAlkaline Phosphatase (FTAP), đoạn Klenow

- Nhóm các hóa chất điện di gồm agarose, đệm TAE, ethidium bromide, thangchuẩn ADN

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR gồm AccuPrep PCR Purification Kit (K-3034-1 của Bioneer), Kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas)

Các hoá chất đều đảm bảo độ tinh sạch và được cung cấp bởi các hãng

uy tín trên thế giới: Bioneer (Hàn Qu ốc), Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức),IDP (Mỹ), Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ),…

2.1.5 Trang thiết bị nghiên ứcu

Nghiên ứcu được thực hiện bằng các trang thiết bị, máy móc phục vụnghiên ứcu sinh học phân t ử - tế bào t ại Phòng thí nghi ệm trọng điểm Côngngh ệ Enzym và Protein và Phòng thí nghi ệm Di truyền học, Khoa Sinh học,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,Đại học Quốc gia Hà N ội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

Chúng tôi tiến hành xây d ựng 2 vector cải biến là pSFV-M7 và pSFV-M8

từ vector cơ bản là pSFV Hai vector c ải biến sẽ có thêm đoạn tăng cường dịch

mã (gen mã hóa v ỏ capsit của SFV), FLAG-tag, HIS10-tag, vị trí Thrombin, vùng nhân dòng đa điểm được thiết kế thêm cácị vtrí enzym cắt mới theo sơ đồ thí nghiệm hình 10 cADN mã gen NK1 được cài vào các vector pSFV theo các bướctrong hình 11, 12

Hình 10 Sơ đồ nghiên ứcu tạo vector cải tiến pSFV-M7 và pSFV-M8

Hình 11 Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong

vector pSFV cải tiến

Hình 12 Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong

vector pSFV cơ bảnCác nội dung nghiên cứu được tiến hành d ựa vào các phươngphápđược nêu bênướdi

2.2.1 Chuẩn bị tế bào kh ả biến và bi ến nạp

Chúng tôi nhận được hệ vector SFV cơ bản (pSFV, pHelper) với mộtlượng rất nhỏ (~5µl), l ượng ADN này ch ỉ đủ cho 1-2 lần biến nạp nên mộttrong những nội dung nghiên ứcu chúng tôi được yêu ầcu là xây d ựng quy trìnhchuẩn bị tế bào DH5 α khả biến và bi ến nạp với hiệu suất cao nhât

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu dựa trên các quy trìnhđược trình bày

trong cuốn Molecular Cloning- A Laboratory manual[45], gồm:

- Quy trình chuẩn bị và bi ến nạp các ết bào kh ả biến E.coli sử dụng Calcium

Chloride

- Phương pháp Inoueđể chuẩn bị và bi ến nạp các ết bào kh ả biến E.coli: tế

bào “siêu-khả biến”

- Chuẩn bị tế bảo khả biến E.coli và bi ến nạp theo phương pháp ủca

Hanahan

Số liệu được tính toán và xử lý để đánh giáếkt quả thí nghiệm:

- Chỉ số OD 600 giúp xácđịnh sự tăng trưởng của dịch nuôi c ấy

- Hiệu quả biến nạp được tính là t ổng số khuẩn lạc biến nạp ứng với mỗi

µg plasmit ADN siêu xoắn Hiệu suất biến nạp mong muốn 5x106 đến 2x 107 khuẩn lạc biến nạp/ µg plasmit ADN siêu xoắn

Từ các kết quả thu được, tìm ra quy trình chuẩn bị tế bào kh ả biến và bi

ến nạp tối ưu

2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit

ADN plasmit được tách chiết theo quy trình của Sambrook và cs [45]

gồm các bước sau:

Chi

ề u /t ố i ngày th ứ nh ấ t:

Chuyển 1 khuẩn lạc đơn lẻ trênđĩa thạch vào bình tam giác chứa 10ml

LB có b ổ sung kháng sinh thích hợp Ủ bình nuôi c ấy ở 37oC và l ắc qua đêm.

Ngày th ứ hai:

1 Ly tâm 30 giây thu c ặn tế bào

2 Thêm 200 µl Sol I, hoà kết tủa và gi ữ hỗn hợp 5 phút ở nhiệt độ phòng

3 Thêm 400 µl Sol II, ủ trênđá 3 phút

4 Thêm 300 µl Sol III, ủ hỗn hợp trênđá 5 phút

5 Ly tâm h ỗn hợp ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 10 phút Chuyển 700 µl d ịch nổi sang ống mới

6 Thêm 13 µl RNase (1mg/ml) vào dịch nổi để đạt đến nồng độ cuối cùng 20 µg/ml, ủ ở 37˚C trong 20 phút

7 Thêm thể tích tương đương hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (tỷ lệ 25:24:1 về thể tích), trộn đều, sau đó ly tâm ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 5 phút để thu pha trên

8 Bổ sung 600 µl isopropanol, tr ộn nhiều lần, giữ ở nhiệt độ phòng 20 phút Ly tâm h ỗn hợp ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 10 phút để thu tủa

9 Bổ sung 1 ml ethanol 70% để lạnh, ly tâm ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 5 phút

Làm khô m ẫu và hoà tan t ủa trong 50 µl đệm TE Mẫu ADN thu được

có th ể bảo quản ở 4oC trong thời gian vài ngày ho ặc bảo quản lâu dài ở -

20oC cho đến khi được dùng cho những nghiên ứcu tiếp theo

2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và

nhân dòng

Trong quá trình phân lập và nhân dòng, các vector được đưa vào ch ủng

vi khuẩn E.coli DH5a để lưu giữ và nhân dòng Chúng tôi b ảo quản các dòng vi

khuẩn theo 2 cách: giữ trong cácđĩa LB đặc (môi tr ường thạch có agar) ở 4oC

và trong cácống LB lỏng (không có agar) được bổ sung thêm glycerolở -250C

Phương pháp bảo quản mẫu giống trong môi tr ường thạch: Vi khuẩn

được cấy theo kiểu zic zắc trên môi trường thạch LB và ủ qua đêmở 37oC, rồiđược lưu giữ ở 4oC Cứ sau 14 ngày, quy trình c ấy chuyển được lặp lại đểgiữ giống

Phương pháp bảo quản mẫu trong môi tr ường lỏng gồm các bước sau:

1 Chuyển 500µl d ịch vi khuẩn vào ống eppendorf, thêm 250 µl glycerol 60% (đã kh ử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1atm trong 20 phút)

2 Lắc vortex dung dịch để glycerol khuếch tánđều

3 Đông l ạnh nhanh dung dịch bằng nitơ lỏng Có th ể bảo quản mẫu

giống đông l ạnh trong thời giàn dài ở -70oC hoặc trong vài tháng ở -

25oC.

4 Để thu vi khuẩn, cào nh ẹ lớp bề mặt môi tr ường đông l ạnh với que cấy đầu tròn đã kh ử trùng rồi cấy sang môi tr ường LB thích hợp

2.2.4 Thiết kế mồi

Hai phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5 và PerPrimer 1.1.14 được

sử dụng để thiết kế và l ựa chọn cặp mồi PCR tối ưu trên ơc sở đánh giá cácỉ ch

số về tính đặc hiệu, độ bền, nhiệt năng và tính t ương thích (khả năng tránh ựt bắt

cặp)

Cặp mồi F-N/R-N dùng để nhân dòng gen mã protein v ỏ capsit từpHelper Riêng mồi F-N có v ị trí trên pSFV cơ bản, nằm trước trình tự Flag-tag

~50 bp được dùng làm m ồi xuôi cho vector pSFV trong sàng l ọc khuẩn lạc

Mồi 807 nằm trước trình tự Flag-tag 126bp trong cả hai vector pSFV-M7

và pSFV-M8 Chính vì v ậy, mồi 807cũng được dùng như mồi xuôi cho haivector pSFV cải tiến trên trong quá trình sàngọlc khuẩn lạc

Mồi 809 có trình t ự trên ấtt cả các phiênảbn pSFV, cách vị trí nhân dòng

đa điểm 408bp Chính vì vậy, mồi 809 được dùng làm m ồi ngược cho tất cả các phiên bản pSFV trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc

Các mồi được thiết kế sao cho có nhi ệt độ gắn mồi gần nhau để có th ể kết hợp các mồi linh hoạt tùy theo mục đích thí nghiệm