Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (semliki forest virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN C ỨU PHÁT TRI ỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BI ỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN C ỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRI ỂN THUỐC Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà N ội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN C ỨU PHÁT TRI ỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BI ỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN C ỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRI ỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã s ố: 604270 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà N ội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 1.1 CÔNG NGH Ệ SINH HỌC PHÂN T Ử TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein vai trò nghiên cứu dược 1.1.2 Các hệ thống vector 1.1.3 Các hệ thống biểu thụ thể kết cặp G-protein 1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) 1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) 1.2.3 Tiềm ứng dụng khác ủca hệ vector SFV 1.2.4 Các yếu tố cần cải tiến hệ vector SFV Chương VẬT LIỆU VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN C ỨU 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.2.1 Chuẩn bị tế bào kh ả 2.2.2 Phương pháp tách c 2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trình phân lập nhân dịng 2.2.4 Thiết kế mồi 2.2.5 Khuếch đại gen nhờ 2.2.6 Cắt ADN sử dụng en 2.2.7 Tạo cácđoạn ADN s 2.2.8 Phản ứng nối cácđoạn ADN 2.2.9 Chương KẾT QUẢ VÀ TH ẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào kh ả biến bi ến nạp 3.2 Cải tiến vector pSFV Sàng l ọc khuẩn lạc 3.3 Tạo ADN tái ổt hợp chứa gen NK1 hệ vector SFV 43 3.4 Tạo ADN tái ổt hợp chứa gen NK1 hệ vector SFV cải tiến 46 3.5 Sàng l ọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1 50 KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ Kết luận 52 Kiến nghị 52 TÀI LI ỆU THAM KHẢO Tài li ệu tiếng Việt 53 Tài li ệu tiếng Anh 53 Tài li ệu tiếng web 57 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Bốn họ thụ thể Hình Quy trình th ời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái ổt hợp hệ thống biểu khác Hình Hệ gen SFV tự nhiên 13 Hình Cấu trúc vector pSFV 15 Hình Cấu trúc vector pHelper 15 Hình Mơ hình ho ạt động hệ vector SFV 16 Hình Cấu trúc vector pJET1.2 23 Hình Vị trí mồi cADN mã cho thụ thể NK1 25 Hình Trình tự vị trí nhân dịng đa điểm đoạn O-M7 25 Hình 10 Sơ đồ nghiên ứcu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 27 Hình 11 Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn vector pSFV cải tiến 27 Hình 12 Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn vector pSFV 28 Hình 13 Đường cong sinh trưởng E.coli DH5α 35 Hình 14 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã v ỏ capsit SFV 38 Hình 15 Một phần kết giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã v ỏ capsit SFV 39 Hình 16 Vị trí đoạn chèn thứ pHelper 39 Hình 17 Ảnh điện di đoạn chèn gel agarrose 1% 40 Hình 18 Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng cải biến 41 Hình 19 Kết giải trình đoạn cải tiến vector pSFV-M7 42 Hình 20 Kết giải trình đoạn cải tiến vector pSFV-M8 43 Hình 21 Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase 43 Hình 22 Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV m vòng b ằng SmaI 45 Hình 23 Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 t pJET1.2 46 Hình 24 Ảnh điện di cADN mã cho NK1 ( XhoI/Klenow/ XbaI) sau tinh 47 Hình 25 Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 pSFV-M8 48 Hình 26 Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 50 Hình 27 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 51 DANH MỤC CÁC B ẢNG Bảng Một số promoter bổ sung vào vectơ biểu Bảng Trình tự, kích thước số lực Bảng Các vị trí cắt số protease phổ biến Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên ứcu 24 Bảng Trình tự oligonucleotit ửs dụng nghiên ứcu 24 Bảng Phản ứng cắt với enzym giới hạn 31 Bảng Điều kiện phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN 32 Bảng Thành ph ần phản ứng nối ADN vector đầu .33 Bảng Thành ph ần phản ứng nối ADN vector đầu dính 33 Bảng 10 Điều kiện phản ứng nối linker 34 Bảng 11 Tần số biến nạp số lô t ế bào kh ả biến 36 Bảng 12 Thành ph ần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã v ỏ capsit SFV 38 Bảng 13 Thành ph ần điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 40 Bảng 14 Thành ph ần điều kiện phản ứng PCR sàng l ọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 41 Bảng 15 Quy trình cho phản ứng nhân dịng đoạn cADN mã hóa cho th ụ thể NK1 44 Bảng 16 Thành ph ần điều kiện phản ứng cắt pSFV SmaI 44 Bảng 17 Thành ph ần điều kiện phản ứng cắt pSFV m vòng b ằng XhoI 45 Bảng 18 Thành ph ần điều kiện phản ứng chống tự đóng vịng c pSFV 46 Bảng 19 Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có đầu bằng/ đầu dính .47 Bảng 20 Quy trình mở vịng pSFV c ải biến ki ểm tra hiệu suất mở vịng .48 Bảng 21 Quy trình tạo đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến .49 Bảng 22 Thành ph ần điều kiện phản ứng colony PCR để xácđịnh khuẩn lạc tái ổt hợp pSFV-NK1 50 BẢNG CÁC KÝ HI ỆU VÀ T Ừ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) GPCR Thụ thể kết cặp G- protein kb kilobase (= 1000 bp) LB Lubertani Broth NK1 Neurokinin-1 Nu Nucleotit OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ARN Axit ribonucleic SFV Semliki Forest Virut SOC Super Optimal broth with Catabolite repression TAE Đệm Tris/Axit acetic/EDTA BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN Ala (A): alanin Leu (L): leucin Arg (R): arginin Lys (K): lysin Asn (N): asparagin Met (M): methionin Asp (D): axit aspartic Phe (F): phenylalanin Cys (C): cystein Pro (P): prolin Gln (Q): glutamin Ser (S): serin Glu (E): axit glutamic Thr (T): threonin Gly (G): glycin Try (W): trytophan His (H): histidin Tyr (Y): tyrosin Ile (I): isoleucin Val (V): valin Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học MỞ ĐẦU Mặc dù m ột ngành m ới đời thành t ựu mà công ngh ệ sinh học phân t (molecular biotechnology) mang l ại r ất lớn Những bước phát triển nhanh chóng c cơng ngh ệ sinh học phân t ĩlnh vực điều chế dược liệu, tạo kháng thể đơn dòng, s ản xuất vacxin, thành cơng giải trình tự hệ gen người góp ph ần đắc lực giúp người công cu ộc đấu tranh chống bệnh tật không ng ừng cải thiện, nâng cao ch ất lượng sống Ngày nay, bi ểu protein tái ổt hợp m ột phần quan trọng công nghệ sinh học phân t với nhiều ứng dụng rộng rãi l ĩnh vực y dược Biểu protein quan tâm tế bào động vật ng ười có th ể giúp thiết lập mơ hình điều trị bệnh liệu pháp gen, bao gồm điều trị ung thư Biểu protein tái ổt hợp đặc biệt protein thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor, viết tắt GPCR) ph ục vụ hữu ích cho nghiênứcu phát triển thuốc, tìm hiểu cấu trúc chức sinh học thụ thể, qua làm sáng tỏ conđường truyền tin nội bào Các protein thụ thể kết cặp G-protein liên quan trực tiếp đến phát sinh nhiều bệnh lý người, “ đích” có vai trị quan tr ọng bậc chương trình sàng l ọc dược chất Các nhà khoa học mong mu ốn xây d ựng hệ thống biểu GPCR chủ động mức độ cao để dùng cho nghiênứcu dược lý h ọc phân t ử, thí nghiệm sàng l ọc để phát dược chất phát triển dược phẩm Trên giới, số hệ thống biểu GPCR tiềm thiết lập th nghiệm, chẳng hạn hệ thống dịch mã phi t ế bào, hệ thống biểu tế bào nhân s (E.coli Halobacterium salinarum) nhân chu ẩn (nấm men, trùng động vật có vú) Một số GPCR biểu thành công ệh thống mức độ cao từ đến 10 mg/l môi tr ường nuôi c [19] Trong hệ thống biểu trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki Forest Virut (SFV) ghi nhận m ột hệ thống có nhi ều đặc điểm ưu việt giàu ti ềm ứng dụng [34] Tuy vậy, SFV không Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học TÀI LI ỆU THAM KHẢO Tài li ệu tiếng Việt Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở Di truyền học phân t t ế bào, NXB Đại học Quốc Gia, Hà N ội Nguyễn Hoàng L ộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Giáo trình Công ngh ệ DNA tái ổt hợp, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Xuân Th ắng (2003), Hóa sinh d ược lý phân t ử, NXB Khoa học K ỹ thuật, Hà N ội Tài li ệu tiếng Anh 10 11 12 13 14 Andersen B and Stevens R.C (1998), “The human D1A dopamine receptor: heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and purification of the functional receptor”, Protein Expr Purif, 13, pp 111–119 Asselin-Paturel C., Lassau N., Guinebretiere J M., Zhang J., Gay F., Bex F., Hallez S., Leclere J., Peronneau P., Mami-Chouaib F., and Chouaib S (1999), “Transfer of the murine interleukin-12 gene in vivo by a Semliki Forest virus vector induces B16 tumor regression through inhibition of tumor blood vessel formation monitored by Doppler ultrasonography”, Gene Ther., 6, pp 606615 Boorsma M, Saudan P, Pfruender H, Bailey Je, Schlesinger S, Renner Wa, and Bachmann Mf (2003), “Alphavirus cDNA-base d expression vectors: effects of RNA transcription and nuclear export”, Biotechnol Bioeng, 81, pp 553-562 Cereghino Jl and Cregg Jm (2000), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev,(24), pp 45-66 Chang J.Y (1985), “Thrombin specificity:Requirem ent for apolar amino acids adja-cent to the thrombin cleavage site of polypeptide substrate”, Eur J Biochem, 151, pp 217-224 Cordingley.M.G., Callahan.P.L., Sardana.V.V., Garsky.V.M., and Colonno.R.J (1990), “Substrate requirements of huma n rhinovirus 3C protease for peptidecleavage in vitro”, J Biol Chem., 265, pp 9062-9065 E Mathilda Sjoberg and Henrik Garoff (1996), “ The translation-enhancing region of the Semliki Forest virus subgenome is only functional in the virusinfected cell”, Journal of General Virology, 77, pp 1323 1327 Federal Register 58 No 19, Addition of Appendix DL-X to the NIH guidelines regarding Semliki Forest virus Human Gene Therapy 1993 p Frolov I and Schlesinger S (1994), “Translati on of Sindbis virus mRNA: effects of sequences downstream of the initiation codon”, Journal of Virology, 68, pp 8111-8117 Frolova E., Frolov I., and Schlesinger S (1997), J Virol, 71, pp 248-258 Frolow I and Schlesinger S (1994), J Virol, 68, pp 8111-8117 53 Luận văn tốt nghiệp-2012 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học Gerstein A.S (2001), Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide, Wiley-Liss, Inc Giraud A., Ataman-Onal Y., Battail N., Piga N., Brand D., Mandrand B, and Verrier B (1999), “Generation of monoclonal antibo dies to native human immunodeficiency virus type envelope glycoprotein by immunization of mice with naked RNA”, J Virol Meth., 79, pp 75-84 Glasgow G M., Mcgee M M., Tarbatt C J., Mooney D A., Sheahan B J., and Atkins G J (1998), “The Semliki Forest virus vector induces p53independent apoptosis”, Journal of General Virology, 79, pp 2405-2410 Gunnar Schulte, Basic Receptor Pharmacology 2008 Hassaine G., Wagner R., Kempf J., Cherouati N., Hassaine N., Prual C., Andre N., Reinhart C., Pattus F., and Lundstrom K (2006), “Semliki Forest virus vector for overexpression of 101 G protein-coupled receptors in mammalian host cell”, Protein Expr Purif, 45(2), pp 343-351 Hengen P (1995), “Purification of His-Tag fusi on proteins from Escherichia coli”, Trends in Biochemical Sciences, 20(7), pp 285-286 Jarvis Dl and Finn Ee (1995), “Biochemical anal ysis of the N-glycosylation pathway in baculovirus-infected lepidopteran insect cells”, Virology,(212), pp 500–511 K Terpe ((2003) ), “Overview of tag protein fu sions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnol 60, pp 523-533 Kenneth H Lundstrom and M.L Chiu (2006), G Protein - Coupled receptors in Drug Discovery, Taylor & Francis Group Kiefer H., Vogel R., and Maier K (2000), “Bact erial expression of G-proteincoupled receptors: prediction of expression levels from sequence”, Receptors Channels, 7, pp 109-119 Klabunde T and Hessler G (2002), “Drug design strategies for targeting Gproteincoupled receptors”, Chembiochem, 3(10), pp 929-944 Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., and Bernhard F (2004), “High level ce ll-free expression and specific labeling of integral membrane proteins”, Eur J Biochem, 271, pp 568–580 Krasemann S., Jurgens T., and Bodemer W (1999), “Generation of monoclonal antibodies against prion proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy”, J Biotechnol, 73, pp 119-129 Kunji Er, Slotboom Dj, and Poolman B (2003), “L actococcus lactis as host for overproduction of functional membrane proteins” , Biochim Biophys Acta, (1610), pp 97-108 Kunz D, Gerad Np, and Gerad C (1992), “The h uman leukocyte plateletactivating factor receptor”, J Biol Chem, 267, pp 9101-9106 Lee S B and Esteban M (1994), “The interfero n-induced doublestranded RNA-activated protein kinase induces apoptosis”, Virology, 199, pp 491-496 54 Luận văn tốt nghiệp-2012 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học Loll P J (2003), “Membrane protein structural biology: the high throughput challenge”, J Struct Biol, 142(1), pp 144-153 Lundstrom K (2003), “Semliki Forest virus vect ors for rapid and high-level expression of integral membrane proteins”, Biochim Biophys Acta., 1610, pp 90-96 Lundstrom K (2009), “An overview on GPCRs and drug discovery: structurebased drug design and structural biology on GPCRs ”, Methods Mol Biol., 552, pp 66-51 Lundstrom K., Wagner R., Reinhart C., Desmyter A., Cherouati N., et al (2006), “Structural genomics on membrane proteins: comparison of more than 100 GPCRs in expression sytems”, Struct Funct Genomics, 7(2), pp 77 - 91 Luque T and O’reilly D.R (1999), “Generation of baculovirus expression vectors”, Mol Biotechnol, 13, pp 153-163 Maa M.C., Chinsky J M., Ramamurthy V., Martin B D., and Kellems R E (199), “Identification of transcription stop sites at the 59 and 39 ends of the murine adenosine deaminase gene”, J Biol Chem., 265, pp 12513-12519 Madin K., Sawasaki T., Ogasawara T., and Endo Y (2000), “A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes”, Proc Natl Acad Sci USA, 97, pp 559–564 Massotte D (2003), “G protein-coupled receptor overexpression with the baculovirus–insect cell system: a tool for structur al and functional studies”, Biochim Biophys Acta, 1610, pp 77-89 Mathiot C C., Grimaud G., Garry P., Bouquety J C., A Mada, Daguisy A M., and Georges A J (1990), “An outbreak of human Semliki Forest virus infection in Central African Republic”, American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 42, pp 386-393 Matsushima.M., Ichinose.M., Yahagi.N., Kakei.N., Tsukada.S., et al (1994), “Structural characterization of porcineenteropeptid ase”, J Biol Chem., 269, pp 19976-19982 Mossman S.P., Bex F., Berglund P., Arthos J., O’neil S.P., et al (1996), “Protection against lethal simian immunodefieciency virus SIVsmmPBj14 disease by a recombinant Semliki Forest virus gp160 vaccine and by gp120 subunit vaccine”, J Virol., 70, pp 1953-1960 Nagai K and Thogersen H.C (1984), “Generatio n of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein pr oduced in Escherichia coli”, Nature, 309, pp 810-812 Nambi P., A.N (2003), “G Protein-Coupled Recep tors in Drug Discovery”, Assay and Drug Develop Tech., 1(2), pp 305-310 Patzelt H., Goto N., Iwai H., Lundstrom K., and Fernholz E (2003), “Modern methods for the expression of proteins in i sotopically enriched form”, Drug Research, pp 1-38 Sambrook J and Russel D.W (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 55 Luận văn tốt nghiệp-2012 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học Savvas C.M (1999), “Components of Vectors for G ene Transfer and Expression in Mammalian Cells”, Protein Expression and Purification, 17, pp 183-202 Schmidt M, Tuominen N, Johansson T, Weiss Sa, Keinamen K, and OkerBlom C (1998), “Baculovirus-mediated large-sc ale expression and purification of a polyhistidine-tagged Rubrella virus capsid protein”, Protein Expr Purif 12, pp 323-330 Sjoberg M., Suomalainen M, and Garoff H (1994)), “A significantly improved Semliki Forest virus expression system based on translation enhancer segments from the viral capsid gene”, Biotechnology, 12, pp 11271131 Smithburn K C and Haddow A J (1944), “Semli ki Forest virus I Isolation and pathogenic properties”, Journal of Immunology, 49, pp 141-157 Strauss J H and Strauss E G (1994), “The al phaviruses : gene expression, replication and evolution”, Microbiological Reviews, 58, pp 491-562 Thomas P Hopp, Kathryn S Prickett, Virginia L Price, Randell T Libby, Carl J March, Douglas Pat Cerretti, David L Urdal, and Paul J Conlon (1988), “A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification”, Nature Biotechnology, 6, pp 1204 - 1210 Vassilatis D K., Hohmann J G., Zeng H., Li F S., Ranchalis J E., Mortrud M T., Brown A., Rodriguez S S., Weller J R., Wright A C., Bergmann J E., and Gaitanaris G A (2003), “The G protein-cou pled receptor repertoires of human and mouse”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(8), pp 4903-4908 Winter-Vann Am, Martinez L, Bartus C, Levay A, and Turner Gj (2001), “G protein-coupled expression in Halobacterium salinarum.”, In: Kuehne SR, de Groot H, Eds Perspectives on Solid State NMR in Biology, Dordrecht: Kluwer, pp 141-159 Yamanaka R and Xanthopoulos Kg (2004), “Devel opment of improved Sindbis virus-based DNA expression vector”, DNA Cell Biol., 23(2), pp 7580 Ying H., Zaks T.Z., Wang R.-F., Irvine K.R., Kammula U.S., Marincola F.M., Lettner W.W, and Restifo N.P (1999), “Cancer therapy using self-replicating RNA vaccine”, Nat Medicine, 5, pp 823-827 Zhou X., Berglund P., Rhodes G., Parker S.E., Jondal M., and Liljeström P (1994), “Self-replicating Semliki Forest virus RNA as a recombinant vaccine”, Vaccine, 12, pp 1510-1513 Zhou X., Berglund P., Zhao H., Liljeström P., a nd Jonda M (1995), “Generation of cytotoxic and humoral immune respons es by nonreplicative recombinant Semliki Forest virus”, Proc Natl Acad Sci USA, 92, pp 30093013 56 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học Tài li ệu web http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.sciencedirect.com http://vectordb.atcg.com http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/mapper 57 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học PHỤ LỤC Các vector virutđược dùng chuyển bi ểu gen động vật có vú Vector virut có h ệ gen ADN Virut Cytomegalo Virut Herpes simplex Virut Epstein-Barr Virut Simian Virut Papilloma Adenovirut Virut liên hợp với Adenovirut Virut Vaccinia Baculovirut Vector virut có h ệ gen ARN Virut Semliki Forest Virut Sindbis Poliovirut Virut dại Virut cúm SV5 Virut hô h ấp hợp bào Virut viêm não ngựa Venezuela Virut Kunjin Virut Sendai Virut gây m ụn nước viêm miệng Retrovirut Vector virut dạng lai Virut Adenovirut-Sindbis Adenovirut-virut liên hợp với Adenovirut Trình tự vector pSFV 61 121 181 241 301 ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG CTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGA CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA GGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGAT CGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAG AATGATGTCTACGCACAAATACCACTGCGTATGCCCTATGCGCAGCGCAGAAGACCCCGA Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA Vị trí bắt cặp mồi F-N SFV replicase- dependent subgenomic promoter 7381 ATACACAGAATTCTGATTGGATCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGT Vị trí nhân dịng đa điểm mã k ết thúc liên ếtip 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 8821 8881 8941 9001 9061 9121 9181 9241 9301 9361 9421 9481 TTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTC CGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCG TAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGA AGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGC AGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAG AAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAAC GTAGTGTTTCCAGACATGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGT Vị trí bắt cặp mồi 809 CTGGGGGCCTTCGCAATCGGCGCTATCCTGGTGCTGGTTGTGGTCACTTGCATTGGGCTC CGCAGATAAGTTAGGGTAGGCAATGGCATTGATATAGCAAGAAAATTGAAAACAGAAAAA GTTAGGGTAAGCAATGGCATATAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGA CCTGCGCAATTGGCCCCGTGGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACA TTAATTGGCAATAATTGGAAGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTAT TTTATTTTGCAATTGGTTTTTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGATCATAATCAGCCA TACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCT GAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA CAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG TTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTAGTCTGCATTAAT GAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGC TCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGG CGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAG GCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCC GCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAG GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGA CCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTC AATGCTCGCGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT CCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA CTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGG GGCATTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTAT CAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAA GTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT 9541 CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTA 9601 CGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCT 9661 CACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTG 9721 GTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAA 9781 GTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGT 9841 CACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA 9901 CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA 9961 GAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTA 10021 CTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCT 10081 GAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCG 10141 CGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAAC 10201 TCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACT 10261 GATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAA Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học 10321 ATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTT 10381 TTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAAT 10441 GTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG 10501 ACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGC 10561 CCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG 10621 AGACGGTCACAGCTTCTGTCTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGT 10681 CAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC 10741 TGAGAGTGCACCATATCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAG 10801 TACTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCGTAATCAATTA 10861 CGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATG 10921 GCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTC 10981 CCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAA 11041 CTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCA 11101 ATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTA 11161 CTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT 11221 ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTG 11281 ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACA 11341 ACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA 11401 GAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT 11461 CACTATAGGGAGACCGGAAGCTTGAATTC Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein phi c ấu trúc (nsP14) Vùng gen cấu trúc b ị cắt phần lớn Đầu 3’ khơng m ã hóa c SFV Đi polyA 69 Tín hiệu kết thúc SV40 Đoạn trình tự pBR322-origin Đoạn trình tự mã gen kháng ampicillin Promoter CMV Trình tự vector pHelper 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG CTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGA CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA GGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGAT CGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAG AATGATGTCTACATGAAACGAGATGTCAAAGTCACTCCAGGGACGAAACACACAGAGGAA AGACCCAAAGTCCAGGTAATTCAAGCAGCGGAGCCATTGGCGACCGCTTACCTGTGCGGC ATCCACAGGGAATTAGTAAGGAGACTAAATGCTGTGTTACGCCCTAACGTGCACACATTG TTTGATATGTCGGCCGAAGACTTTGACGCGATCATCGCCTCTCACTTCCACCCAGGAGAC CCGGTTCTAGAGACGGACATTGCATCATTCGACAAAAGCCAGGACGACTCCTTGGCTCTT ACAGGTTTAATGATCCTCGAAGATCTAGGGGTGGATCAGTACCTGCTGGACTTGATCGAG GCAGCCTTTGGGGAAATATCCAGCTGTCACCTACCAACTGGCACGCGCTTCAAGTTCGGA GCTATGATGAAATCGGGCATGTTTCTGACTTTGTTTATTAACACTGTTTTGAACATCACC ATAGCAAGCAGGGTACTGGAGCAGAGACTCACTGACTCCGCCTGTGCGGCCTTCATCGGC GACGACAACATCGTTCACGGAGTGATCTCCGACAAGCTGATGGCGGAGAGGTGCGCGTCG TGGGTCAACATGGAGGTGAAGATCATTGACGCTGTCATGGGCGAAAAACCCCCATATTTT TGTGGGGGATTCATAGTTTTTGACAGCGTCACACAGACCGCCTGCCGTGTTTCAGACCCA CTTAAGCGCCTGTTCAAGTTGGGTAAGCCGCTAACAGCTGAAGACAAGCAGGACGAAGAC 1081 1141 AGGCGACGAGCACTGAGTGACGAGGTTAGCAAGTGGTTCCGGACAGGCTTGGGGGCCGAA CTGGAGGTGGCACTAACATCTAGGTATGAGGTAGAGGGCTGCAAAAGTATCCTCATAGCC Luận văn tốt nghiệp-2012 1201 1261 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học ATGGCCACCTTGGCGAGGGACATTAAGGCGTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACAC Vị trí bắt cặp mồi F-N CTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATT SFV replicase- dependent subgenomic promoter 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 EcoRI ATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCC CGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCC AGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACG CAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGA AAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAG CCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATG ACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGAAAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCG ACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAAGGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGC TAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGA GGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAGAAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACG GGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTCACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAG ACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAGGGGAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGG CCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCGGTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTA GAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGTCCGCCCCGCTGATTACTGCCATGTGTGTCC Vị trí bắt cặp mồi R-N TTGCCAATGCTACCTTCCCGTGCTTCCAGCCCCCGTGTGTACCTTGCTGCTATGAAAACA ACGCAGAGGCCACACTACGGATGCTCGAGGATAACGTGGATAGGCCAGGGTACTACGACC TCCTTCAGGCAGCCTTGACGTGCCGAAACGGAACATCCCACCAATTGAGCGTGTCGCAAC ACTTCAACGTGTATAAGGCTACACGCCCTTACATCGCGTACTGCGCCGACTGCGGAGCAG GGCACTCGTGTCATAGCCCCGTAGCAATTGAAGCGGTCAGGTCCGAAGCTACCGACGGGA TGCTGAAGATTCAGTTCTCGGCACAAATTGGCATAGATAAGAGTGACAATCATGACTACA CGAAGATAAGGTACGCAGACGGGCACGCCATTGAGAATGCCGTCCGGTCATCTTTGAAGG TAGCCACCTCCGGAGACTGTTTCGTCCATGGCACAATGGGACATTTCATACTGGCAAAGT GCCCACCGGGTGAATTCCTGCAGGTCTCGATCCAGGACACCAGAAACGCGGTCCGTGCCT GCAGAATACAATATCATCATGACCCTCAACCGGTGGGTAGAGAAAAATTTACAATTAGAC CACACTATGGAAAAGAGATCCCTTGCACCACTTATCAACAGACCACAGCGAAGACCGTGG AGGAAATCGACATGCATATGCCGCCAGATACGCCGGACAGGACGTTGCTATCACAGCAAT CTGGCAATGTAAAGATCACAGTCGGAGGAAAGAAGGTGAAATACAACTGCACCTGTGGAA CCGGAAACGTTGGCACTACTAATTCGGACATGACGATCAACACGTGTCTAATAGAGCAGT GCCACGTCTCAGTGACGGACCATAAGAAATGGCAGTTCAACTCACCTTTCGTCCCGAGAG CCGACGAACCGGCTAGAAAAGGCAAAGTCCATATCCCATTCCCGTTGGACAACATCACAT GCAGAGTTCCAATGGCGCGCGAACCAACCGTCATCCACGGCAAAAGAGAAGTGACACTGC ACCTTCACCCAGATCATCCCACGCTCTTTTCCTACCGCACACTGGGTGAGGACCCGCAGT ATCACGAGGAATGGGTGACAGCGGCGGTGGAACGGACCATACCCGTACCAGTGGACGGGA TGGAGTACCACTGGGGAAACAACGACCCAGTGAGGCTTTGGTCTCAACTCACCACTGAAG GGAAACCGCACGGCTGGCCGCATCAGATCGTACAGTACTACTATGGGCTTTACCCGGCCG CTACAGTATCCGCGGTCGTCGGGATGAGCTTACTGGCGTTGATATCGATCTTCGCGTCGT GCTACATGCTGGTTGCGGCCCGCAGTAAGTGCTTGACCCCTTATGCTTTAACACCAGGAG CTGCAGTTCCGTGGACGCTGGGGATACTCTGCTGCGCCCCGCGGGCGCACGCAGCTAGTG TGGCAGAGACTATGGCCTACTTGTGGGACCAAAACCAAGCGTTGTTCTGGTTGGAGTTTG CGGCCCCTGTTGCCTGCATCCTCATCATCACGTATTGCCTCAGAAACGTGCTGTGTTGCT GTAAGAGCCTTTCTTTTTTAGTGCTACTGAGCCTCGGGGCAACCGCCAGAGCTTACGAAC ATTCGACAGTAATGCCGAACGTGGTGGGGTTCCCGTATAAGGCTCACATTGAAAGGCCAG GATATAGCCCCCTCACTTTGCAGATGCAGGTTGTTGAAACCAGCCTCGAACCAACCCTTA ATTTGGAATACATAACCTGTGAGTACAAGACGGTCGTCCCGTCGCCGTACGTGAAGTGCT GCGGCGCCTCAGAGTGCTCCACTAAAGAGAAGCCTGACTACCAATGCAAGGTTTACACAG GCGTGTACCCGTTCATGTGGGGAGGGGCATATTGCTTCTGCGACTCAGAAAACACGCAAC TCAGCGAGGCGTACGTCGATCGATCGGACGTATGCAGGCATGATCACGCATCTGCTTACA AAGCCCATACAGCATCGCTGAAGGCCAAAGTGAGGGTTATGTACGGCAACGTAAACCAGA CTGTGGATGTTTACGTGAACGGAGACCATGCCGTCACGATAGGGGGTACTCAGTTCATAT TCGGGCCGCTGTCATCGGCCTGGACCCCGTTCGACAACAAGATAGTCGTGTACAAAGACG Luận văn tốt nghiệp-2012 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721 6781 6841 6901 6961 7021 7081 7141 7201 7261 7321 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học AAGTGTTCAATCAGGACTTCCCGCCGTACGGATCTGGGCAACCAGGGCGCTTCGGCGACA TCCAAAGCAGAACAGTGGAGAGTAACGACCTGTACGCGAACACGGCACTGAAGCTGGCAC GCCCTTCACCCGGCATGGTCCATGTACCGTACACACAGACACCTTCAGGGTTCAAATATT GGCTAAAGGAAAAAGGGACAGCCCTAAATACGAAGGCTCCTTTTGGCTGCCAAATCAAAA CGAACCCTGTCAGGGCCATGAACTGCGCCGTGGGAAACATCCCTGTCTCCATGAATTTGC CTGACAGCGCCTTTACCCGCATTGTCGAGGCGCCGACCATCATTGACCTGACTTGCACAG TGGCTACCTGTACGCACTCCTCGGATTTCGGCGGCGTCTTGACACTGACGTACAAGACCA ACAAGAACGGGGACTGCTCTGTACACTCGCACTCTAACGTAGCTACTCTACAGGAGGCCA CAGCAAAAGTGAAGACAGCAGGTAAGGTGACCTTACACTTCTCCACGGCAAGCGCATCAC CTTCTTTTGTGGTGTCGCTATGCAGTGCTAGGGCCACCTGTTCAGCGTCGTGTGAGCCCC CGAAAGACCACATAGTCCCATATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCCAGACATGT CGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTTCGCAATCG GCGCTATCCTGGTGCTGGTTGTGGTCACTTGCATTGGGCTCCGCAGATAAGTTAGGGTAG GCAATGGCATTGATATAGCAAGAAAATTGAAAACAGAAAAAGTTAGGGTAAGCAATGGCA TATAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGACCTGCGCAATTGGCCCCGT GGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACATTAATTGGCAATAATTGGA AGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTATTTTATTTTGCAATTGGTTT TTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTT TTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCA ATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATC ACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTC ATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTAGTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGG GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC GGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCAC AGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAA CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGC GTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATA CCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCGCGCTGTAGGTA TCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCA GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGA CTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGG TATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGG CAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGCATTCTGACGCTCAGTG GAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCG TTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACC ATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATC AGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGC CTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAG TTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTAT GGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTG CAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGT GTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAG ATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCG ACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTT AAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTAC TTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAAT AAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCAT TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTAT TATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTT CGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTCTGT Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học 7801 7861 7921 7981 8041 8101 CTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTG TCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATCGA CGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTACTAGGTTGAGGCCGTTG AGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAG CCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC CAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG 8161 8221 8281 8341 8401 8461 GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATA GCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTT TTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCA 8521 8581 8641 AATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAG AGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAA GCTTGAATTC Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein v ỏ capsit Đoạn trình tự mã cho protein E3 Đoạn trình tự mã cho protein E2 Đoạn trình tự mã cho protein 6K Đoạn trình tự mã cho protein E1 Đi polyA Tín hiệu kết thúc SV40 Đoạn trình tự pBR322-origin A/T/G/C Đoạn trình tự mã gen kháng ampicillin Promoter CMV Vùng trình t ự cải biến pSFV-M7 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTA 7381 ATACACAGAATTCTGATTATAGCGCA 7441 ACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCC 7501 ACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGA 7561 GCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACA 7621 AAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAA 7681 ACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAA 7741 AGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGA 7801 AAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGT 7861 GGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGC 7921 CTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCA 7981 AAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCA 8041 ACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACC 8101 GGTAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGG 8161 GTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGT 8221 GATCTTGACTACAAGGACGACGATGA 8281 AGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTGGGTC Luận văn tốt nghiệp-2012 8341 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học Vị trí Thrombin Vị trí nhân dịng đa điểm CTAGGGCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTG ba kết thúc liền kề GCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGT CCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAAT GAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACAACCAA ACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAGAAGAA AGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCATGAA GATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCCAGACA 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 TGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTTCGCAA Vị trí bắt cặp mồi 809 Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein v ỏ capsit Vùng trình t ự cải biến pSFV-M8 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 ATACACAGAATTCTGATT ACGTTTTACGGCCGCCGG ACTCCGGTGGCTCCCGTC GCCGTAAATGCGCTGACA AAGAAGAAGAAGACAACC ACGCAGCAGCAAAAGAAG AGAGAAAGAATGTGCATG AAGGTCACTGGGTACGCC GGAGTCATCGACAACGCG CTTGAGTGTGCCCAGATA AAGCCCGAGGGACACTAT ACTATACCGACAGGAGCG 8101 GGTAGGGTAGTCGCTATC 8161 GTGGTCACCTGGAACAAA 8221 8281 8341 GCATCCTAGGGCCCGGG 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 Ghi cho vùng màu: CGGTGGCGCCCGCGCCCG GTCGTCCCCGACTTCCAG ACAATGAGACAGAACGCA ACCAAACCAAAGCCGAAA AAGAAAGACAAGCAAGCC ATGAAGATTGAAAATGAC AGACATGTCGGGCACCGC Đoạn trình tự mã cho protein v ỏ capsit Đoạn Nu thêmđẩy khung đọc mở lệch Nu ... Hồng Nhung NGHIÊN C ỨU PHÁT TRI ỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BI ỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN C ỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRI ỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên... ĐTPTNTĐ.2 011 -G/04, đề xuất th ực đề tài: “ Nghiên ứcu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng bi ểu gen mã hóa th ụ thể Neurokinin- 1 phục vụ nghiên? ??cu dược lý phát triển thuốc Việt. .. 1. 2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 1. 2 .1 Virut Semliki Forest (SFV) 1. 2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) 1. 2.3 Tiềm ứng dụng khác ủca hệ vector SFV 1. 2.4 Các