Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều merrf ở người việt nam 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Chủ tịch hội đồng chấm luận văn Giáo viên hướng dẫn thạc sĩ khoa học GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Bùi Phương Thuận Hà Nội - 2015 ỜI Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, thầy đ tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS Nguyễn Văn Minh CN Phùng Bảo Khánh anh chị em làm việc phịng Protein tái tổ hợp thuộc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên đ giúp đỡ q trình thực nghiệm Tơi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Y tế Thái Bình, Trƣởng khoa Y học sở anh em môn Y học sở đ tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học nâng cao trình độ Tơi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể thầy, giáo Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đ truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin g i lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học Phòng chức Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đ tạo điều kiện cho tơi học tập, hồn thành chƣơng trình học Cao học Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình bạn bè đ ln động viên, khích lệ tơi hồn thành khóa học Hà Nội, tháng 12 năm 2015 HVCH: Bùi Thị Khánh i MỤ Ụ LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii D NH MỤC C C K HI U V CHỮ VIẾT TẮT vi D NH MỤC C C BẢNG viii D NH MỤC C C HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QU N T I LI U 1.1 CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦ TY THỂ NGƢỜI 1.1.1 Cấu trúc ty thể .3 1.1.2 Chức ty thể 1.1.2.1 Ty thể hoạt động nhà máy lượng tế bào 1.1.2.2 Ty thể q trình lão hóa 1.1.2.3 Ty thể trình tự chết tế bào 1.1.3 Hệ gen ty thể đặc điểm di truyền hệ gen ty thể .10 1.1.3.1 Hệ gen ty thể 10 1.1.3.2 Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể 12 1.1.3.3 Tính chất dị tế bào chất tốc độ đột biến ty thể 12 1.2 ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ V C C B NH LIÊN QU N 13 1.2.1 Các loại đột biến gen ty thể 13 1.2.1.1 Đột biến điểm 14 1.2.1.2 Đột biến cấu trúc mtDNA 15 1.2.2 Các bệnh đột biến gen ty thể 15 1.2.2.1 Hội chứng gây đột biến điểm phổ biến gen mã hóa tRNA 17 1.2.2.2 Các hội chứng liên quan đến đột biến điểm phổ biến gen mã hóa protein 19 1.2.2.3 Các bệnh liên quan đến đột biến gen mã hóa rRNA 21 1.2.2.4 Bệnh gây nên đột biến khác mtDNA 22 ii 1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) 24 1.3.1 Các đột biến hội chứng MERRF 24 1.3.1.1 Đột biến A8344G 24 1.3.1.2 Đột biến T8356C 25 1.3.1.3 Đột biến G8363A 26 1.3.2 Những tác động hội chứng MERRF ngƣời bệnh 27 1.3.3 Các phƣơng pháp phát đột biến MERRF 29 1.3.3.1 Phát đột biến thuộc hội chứng MERRF PCR kết hợp với RFLP 29 1.3.3.2 Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF xác định trình tự gen 30 1.3.3.3 Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) 30 1.3.3.4 Định lượng đột biến gen ty thể phương pháp real-time PCR 31 1.3.3.5 Phát đột biến DNA ty thể hệ thống cảm biến sinh học 31 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LI U V PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU .33 2.1 NGUYÊN LI U 33 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 33 2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác 33 2.2 M Y MÓC V TR NG THIẾT BỊ 33 2.3 PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 34 2.3.1 Tách chiết DN tổng số 34 2.3.2 Kiểm tra định lƣợng DN tách chiết 34 2.3.3 Nhân đoạn gen ty thể kỹ thuật PCR 35 2.3.4 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) 36 2.3.5 Điện di gel agarose 36 iii 2.3.6 Điện di gel polyacrylamide 37 2.3.7 Kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dị huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) 38 2.3.8 Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến 41 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 42 3.1 THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN V T CH CHIẾT DN TỔNG SỐ 42 3.1.1 Một số đặc điểm mẫu phân tích 42 3.1.2 Tách chiết DN tổng số mẫu 42 3.2 S NG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƢỜI VI T N M BẰNG PHƢƠNG PH P PCR-RFLP 43 3.2.1 Sàng lọc đột biến 8344G 43 3.2.1.1 Nhân đoạn gen từ 8155 - 8366 PCR 43 3.2.1.2 Phân tích có mặt đột biến A8344G PCR-RFLP 44 3.2.2 Sàng lọc đột biến T8356C 46 3.2.2.1 Nhân đoạn gen từ 8166 - 8358 PCR 46 3.2.2.2 Phân tích có mặt đột biến T8356C PCR-RFLP .47 3.2.3 Sàng lọc đột biến G8363 48 3.2.3.1 Nhân đoạn gen từ 8342 - 8582 48 3.2.3.2 Phân tích có mặt đột biến G8363A PCR-RFLP 50 3.3 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN 8344G BẰNG KỸ THUẬT RE L-TIME PCR 52 3.3.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 52 3.3.1.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 52 3.3.1.2 Đánh giá tính đặc hiệu mẫu dò đột biến A8344G 54 3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp real-time PCR để định lƣợng đột biến 8344G 56 3.3.2.1 Định lượng số plasmid mang đoạn gen đột biến không đột biến A8344G 56 3.3.2.2 Kết xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G .56 3.3.3 Th nghiệm khả phát định lƣợng đột biến 8344G 60 iv 3.4 S NG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƢƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP 61 Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292 hệ gen ty thể 61 KẾT LUẬN 63 T I LI U TH M KHẢO 64 PHỤ LỤC 73 v APS ANT ADP ATP bp BFQ CoQ CPEO Cyt c Cyt b D-loop dNTP ddH2O EtBr FAD + FADH2 IPTG kb KSS LB LHON LNA MELAS vi MERRF MIDD Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres (Hội chứng động kinh, giật với sợi không đều) MRI Maternally inherited diabetes and deafness mtDNA (Bệnh tiểu đƣờng câm điếc di truyền theo mẹ) nDNA Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ) NAD+ Mitochondrial DN (DN ty thể) NADH Nuclear DNA (DNA nhân) NARP Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng kh ) OD Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos PCR (Hội chứng gây liệt, điều hòa viêm võng mạc PEO Optical density (Mật độ quang học) Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP Progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt tiến triển) ROS Restriction fragment length polymorphism SDS (Sự đa hình đoạn phân cắt giới hạn) TAE Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng) TBE Sodium dodecylsulphate TEMED Tris -Acetate-EDTA Tm Tris -Borate-EDTA N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi) vii H Ụ B G Bảng 1.1: Các biểu triệu chứng lâm sàng 62 bệnh nhân MERRF .28 Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn gen mang đột biến MERRF 35 Bảng 2.2: Thành phần gel polyacrylamide 12% 37 Bảng 2.3: Trình tự mồi mẫu dị dùng cho real-time PCR 40 Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 43 Bảng 3.2: Trình tự sản phẩm cắt enzyme BanII 45 Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 46 Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 49 Bảng 3.5: Trình tự mẫu dò dùng cho real-time PCR 53 Bảng 3.6: Tƣơng quan nồng độ DN plasmid mang đột biến không đột biến 8344G ban đầu số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định real-time PCR 57 Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn 58 Bảng 3.8: Kết thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến mẫu chuẩn 59 viii 191 Trần Phƣơng M 192 Nguyễn Hải N 82 193 Diền Thị S 194 Trịnh Thị Lan P 195 Lê Thị P 196 Lê Văn Q 197 Hà Anh V 198 Phạm Thị Kiều T 199 Hoàng Khánh V 200 Hồ Diên T 201 Đỗ Hải P 202 Trần Văn T 203 Hoàng Khánh G 204 Nguyễn Thị H 205 Phạm Khánh L 206 Lê Thanh T 207 Nguyễn Thanh T 208 Mầu nh T 83 209 Phạm Thành T 210 Nguyễn Văn Thái B 211 Phạm Thu H 212 Phạm Thị Huyền T 213 Nguyễn Văn Đ 214 Nguyễn Minh K 215 Nguyễn Thanh B 216 Đỗ Văn Q 217 Nguyễn Văn Đ 218 Hoàng Lê Vũ L 219 Phạm Cao S 220 Nguyễn nh D 221 Trần Gia B 222 Lê Phúc T 223 Trần Duy B 224 Trần Thị Thu H 225 Lê Thúy T 84 226 Vũ Xuân P 227 Nguyễn Đức V 228 Phan Văn M 229 Hoàng Huy H 230 Hoàng Ngọc H 231 Hoàng Tuấn M 232 Lê Lan A 233 Đỗ Thị H 234 Nguyễn Văn K 235 Cao Thị Lê N 236 Nguyễn Minh N 237 Nguyễn Ngọc Tƣờng V 238 Lý Thị Ngọc V 239 Đồng Thị Ngọc 240 Hoàng Đỗ Kim 241 Giàng Anh D 242 LýHàV 243 Trần Quốc K 244 Nguyễn Vũ Hoàng 85 245 Phan Thị L 246 Giáp Văn T 247 Nguyễn Tuệ L 248 Lê Kim Bảo N 249 Cao Thị Kim O 250 Ngô Ngọc K 251 Nguyễn Đức V 252 Hồ Thị X 253 Trần Minh T 254 Nguyễn Mạnh H 255 Lê Tất 256 Ngô Trƣờng T 257 Đặng Ngọc 258 Bùi Thị Thùy D 259 Trần Mộc S 260 Ngô gia H 261 Cao Nhật M 262 Tạ Thị T nh K 263 Nguyễn nh T 264 Trần Thị Thùy D 86 265 Viên Đức T 266 Nguyễn Thị Hà G 267 Phạm Mai L 268 Đoàn Trung H 269 Nguyễn Trọng Q 270 Vũ Diệu L 271 Mùa A S 272 Đặng Tuệ K 273 Trần Văn Quốc D 274 Nguyền Thùy C 275 Thân Văn H 276 Hà Phạm n N 277 Vũ Diệp C 278 Hoàng Yến N 279 Nguyễn Ngọc B 280 Hoàng Hữu H 281 Đinh Nho Việt H 282 Nguyễn Thị Thúy C 87 283 Nguyễn Quang K 284 Đinh Ngọc M 285 Nguyễn Thị T 286 Triệu Thu N 287 Lăng Thị L 288 Lê Minh An P 289 Hoàng nh Đ 290 Đỗ Quỳnh T 291 Nguyễn Đức M 292 Nguyễn 293 Đinh Quốc V 294 Lê Ứng Trang 295 Đinh Xuân N 296 Chỉn Minh Q 297 Ngô Bảo N 298 Ngô Quang L 299 Phùng Thị H nh D 300 Đặng Nhật 301 Phạm Thế 88 302 Lê Anh V 303 Lê Đức T 304 Đỗ Thái Huyền 305 Hà Minh P 306 Tản văn T 307 Đặng Gia B 308 Hà Văn H 309 Nguyễn Đại D 310 Lê Kim L 311 Trịnh Hồng T 312 Lê Tài Đ 89 ... Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420 114 LUẬN... nhân mang hội chứng MERRF tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu phát định lượng số đột biến hội chứng động kinh, giật với sợi không - MERRF người Việt Nam? ?? HƯ 1.1 1.1.1 Ty thể bào quan phổ biến đƣợc... đến đột biến gen mã hóa rRNA 21 1.2.2.4 Bệnh gây nên đột biến khác mtDNA 22 ii 1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) 24 1.3.1 Các đột biến hội chứng MERRF