Nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây nhiễm độc thực phẩm phổ biế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Mai Thị Đàm Linh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LECTIN THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG NGƢNG KẾT ĐẶC HIỆU VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Mai Thị Đàm Linh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LECTIN THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG NGƢNG KẾT ĐẶC HIỆU VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Bùi Phƣơng Thuận PGS.TS Kiều Hữu Ảnh Hà Nội - 2014 MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chƣơng 1:Tổng quan tài liệu 1.1Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Việt Nam 1.1.1 Trên Thế giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.2 Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn 1.3 Một số vi khuẩn gây bệnh qua đƣờng thực phẩm thƣờng gặp 1.3.1Vi khuẩn Salmonella bệnh Salmonella 1.3.2 Shigella bệnh lỵ trựckhuẩn Đặc điểm sinh học Shigella Ngộ độc thực phẩm Shigella 1.3.3 Escherichia coli gây bệnh Đặc điểm sinh học vi khuẩn E coli 1.3.3.2 Các nhóm E coli gây bệnh 1.3.4 Staphylococcus aureus 1.3.4.1 Đặc điểm sinh học 1.3.4.2 Khả sinh độc tố 1.3.4.3 Nhiễm độc S aureus 1.3.5 Các nhóm vi khuẩn khác 1.3.5.1 Bệnh Listeria 1.3.5.2 Các bệnh Campylobacter (Campylobacteriosis) 1.3.5.3 Bệnh viêm đƣờng ruột – dày Clostridium perfringens 1.3.5.4 Bệnh đƣờng ruột- dày Bacillus cereus 1.3.5.5 Vibrio cholera 1.3.5.6 Clostridium botulinum bệnh Clostridium botulinum (Botulism) 1.4 Các kĩ thuật phân tích, kiểm tra vi khuẩn thực phẩm 1.4.1 Các phƣơng pháp truyền thống 1.4.2 Các phƣơng pháp đại 1.4.3 Phƣơng pháp sử dụng lectin 1.5 Lectin ứng dụng chẩn đoán vi khuẩn 1.5.1 Lectin 1.5.1.1 Định nghĩa lectin 1.5.1.2 Nguồn lectin tự nhiên 1.5.1.3 Cấu tạo phân tử lectin 1.5.1.4Tính đặc hiệu đƣờng lectin 1.5.1.5 Ứng dụng lectin 1.5.2 Các ứng dụng lectin chẩn đoán vi khuẩn 1.5.2.1 Ứng dụng lectin chẩn đoán vi khuẩn Gram dƣơng 1.4.2.1 Ứng dụng lectin chẩn đoán vi khuẩn Gram âm 1.5.2.3 Mối liên quan tính đặc hiệu đƣờng lectin khả gây ngƣng kết vi khuẩn 1.5.3 Ý nghĩa việc sử dụng lectin làm công cụ chẩn đoán vi khuẩn Chƣơng 2: Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Dụng cụ - hóa chất – mơi trƣờng 2.2.1Hố chât – sinh phẩm, thiết bị dù 2.2.2Hoá chât – sinh phẩm, thiết bị dù 2.3.3Môi trƣờng nuôi cấy 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập định danh vi sinh vật 2.3.1.1 Kỹ thuật phát Salmonella, Shigella thực phẩm 2.3.1.2 Phƣơng pháp phát E coli thực phẩm theo kĩ thuật IMViC 2.3.1.3 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu lectin 2.3.2.1 Tách chiết tinh lectin 2.3.2.2 Xác định hoạt độ lectin phản ứng ngƣng kết hồng cầu 2.3.2.3 Phản ứng ngƣng kết tế bào vi khuẩn lectin 2.3.2.4 Phƣơng pháp tiến hành phản ứng đặc hiệu đƣờng 2.3.2.5 Xác định ảnh hƣởng pH lên hoạt độ lectin 2.3.2.6 Xác định ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ lectin 2.3.2.7 Phƣơng pháp định lƣợng protein 2.3.2.8 Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion cột CM- Sephadex 2.3.2.9 Phƣơng pháp điện di biến tính gel polyacrylamide (SDS-PAGE) CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu khả gây ngƣng kết lectin lên số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp 3.2 Tính đặc hiệu đƣờng dịch chiết lectin 3.3 Nghiên cứu mối tƣơng tác lectin với số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập đƣợc 3.3.1 Phân lập vi khuẩn 3.3.1.1 Phân lập Salmonella 3.3.1.2 Shigella 3.3.1.3 Escherichia coli 3.31.4 Staphylococcus aureus 3.2.2 Kết gây ngƣng kết lectin thực vật với vi khuẩn phân lập 3.2.2.1 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với chủng thuộc chi Salmonella 3.3.2.2 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với Shigella 3.3.2.3 Tác dụng lectin lên loài vi khuẩn thuộc chi E.coli 3.3.2.4 Tác dụng lectin lên loài vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus 3.3.2.5 Nghiên cứu tính chất gây ngƣng kết đặc hiệu lectin để ứng dụng phân loại vi khuẩn nghiên cứu 3.4 TINH CHẾ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH HĨA SINH MIỄN DỊCH CỦA LECTIN CHỌN LỰA 3.4.1 Tinh chế nghiên cứu đặc tính lectin hạt Đậu ma 3.4.1.1 Lựa chọn đệm chiết thích hợp cho q trình tinh chế 3.4.1.2 Tinh chế lectin hạt Đậu ma kết tủa phân đoạn nhờ điều chỉnh pH 3.4.1.3 Tinh chế ĐM-CP2 cột sắc ký trao đổi ion CM- Sephadex 3.3.1.4 Nghiên cứu số tính chất hóa sinh lectin hạt Đậu ma 3.4.2 Tinh chế nghiên cứu đặc tính lectin từ Tú cầu đỏ 3.4.2.1 Sắc kí qua cột trao đổi ion DE-52 Cellulose 3.3.2.2 Kiểm tra độ tinh chế phẩm điện di biến tính 3.3.2.3 Nghiên cứu số đặc tính lectin Tú cầu đỏ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA Albumin huyết bò (Bovine serum albumine ) CDC Trung tâm kiểm soát ngăn ngừa bệnh dịch (Centers of Disease Control and Prevention) Con A Concanavalin A (lectin từ Đậu rựa – jack bean) Gal Galactose GalNAc N- acetylgalactosamine Glc Glucose GlcNAc N - acetylglucosamine Fuc Fucose FucNAc N – acety L- fucosamine Man Mannose ManNAc N- acety – D - Mannosamine Rha Rhamnose Rib Ribose HAA Hoạt độ ngƣng kết hồng cầu (Hemagglutinating activity ) HĐR Hoạt độ riêng HĐTS Hoạt độ tổng số KN Kháng nguyên LPS Lipopolysaccharide PAGE Điện di gel polyacrylamid (Polyacrylamide gel Electrophoresis ) PBS Phosphate buffered saline PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) WGA Wheat germ agglutinin (lectin mầm lúa mỳ) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam 1.2 Các phân tử bề mặt tế bào có khả tƣơn 1.3 Một số đặc điểm quan trọng lectin việ phẩm chẩn đoán vi sinh vật 2.1 Bảng kí hiệu chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 3.1 Sự tƣơng tác lectin thực vật với vi khu 3.2 Tác dụng ức chế đƣờng lên dịch lectin t 3.3 Kết phân lập Salmonella mẫu thức 3.4 Kết phân lập Shigella nhóm thực ph 3.5 Kết phản ứng sinh hóa chủng E col 3.6 Kết ngƣng kết với kháng huyết cá 3.7 Sự có mặt Staphylococcus aureus m 3.8 Kết thí nghiệm xác định enzym coagulase c 3.9 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với Salmone 3.10 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với Shigella 3.11 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với vi khuẩn 3.12 Sự tƣơng tác lectin với loài vi khuẩn S 3.13 Sự tƣơng tác lectin với vi khuẩn nghiên 3.14 Kết loại bỏ protein tạp DCT lectin hạt Đậu m 3.15 Kết loại bỏ protein tạp DCT lectin hạt Đậu m 3.16 Kết tính đặc hiệu đƣờng lectin Đậu m 3.17 Khả ngƣng kết vi khuẩn dịch thô ch 3.18 Kết tinh chế lectin Tú cầu đỏ qua cột DE – 3.19 Kết tính đặc hiệu đƣờng lectin Tú cầ 3.20 Tác dụng gây ngƣng kết lectin Tú cầu với c DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình 1.1 Hình thái vi khẩn Salmonella dƣới kính hiển vi điện 1.2 Thành phần kháng nguyên vi khuẩn Salmonella 1.3 Cấu trúc kháng nguyên O Salmonella O6,7 1.4 Cấu trúc kháng nguyên O Salmonella O62 ssp.a 1.5 Cấu trúc kháng ngun O Shigella flexneri serot 1.6 Mơ hình cấu tạo độc tố vi khuẩn Shigella 1.7 Sự xâm nhập Shigella tế bào biểu mô ruột 1.8 Cấu trúc oligosaccharide (1) O-polysaccharid O150 1.9 Cấu trúc lớp glycan Staphylococcus aureus 1.10 Vị trí liên kết đặc hiệu đƣờng Gal/GaNAc loạ 1.11 Lectin ConA ngƣng kết với E coli gián tiếp qua đƣ 2.1 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan mật độ quang protein chuẩn theo phƣơng pháp Lowry 3.1 Kết phản ứng sinh hoá chủng Salmonella ph 3.2 Hình dạng tế bào chủng Shigella 3.3 Kết phản ứng sinh hố chủng Shigella 3.4 Hình thái khuẩn lạc tế bào E.coli 3.5 Kết phản ứng sinh hóa E.coli 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc S aureus mơi trƣờng Chap 3.7 Hình ảnh tế bào chủng S aureus phân lập 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc S aureus mơi trƣờng B lỏng đỏ trứng gà 3.9 Kết ngƣng kết lectin thực vật với chủng Sal 3.10 Hình ảnh ngƣng kết nhóm lectin thực vật với ch 3.11 Sơ đồ khoá định loại chủng vi khuẩn E coli 3.12 Sơ đồ khoá định loại chủng thuộc chi Staphylococcu 3.13 Sơ đồ khoá định loại tổng quát loài vi khuẩn nghiên 3.14 Sắc ký đồ ĐM-CP2 cột CM-Sephadex 3.15 Ảnh điện di lectin hạt Đậu ma 3.16 Ảnh hƣởng pH lên hoạt độ lectin hạt Đậu ma 3.17 Độ bền với pH lectin hạt Đậu ma 3.18 Độ bền với nhiệt lectin hạt Đậu ma 3.19 Sắc kí đồ cột DE - 52 Cellulose dịch chiết thô Tú cầ 3.20 Ảnh điện di lectin Tú cầu đỏ 3.19 Ảnh hƣởng pH lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ 3.20 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ Bảng 2: Hoạt tính gây ngƣng kết hồng cầu thỏ số thực vật mầm (Chú thích: TH: tan huyết, O: khơng gây ngưng kết) TT Họ I II Araceae (Họ Ráy) 10 11 12 Alliaceae 13 14 (Họ Hành) 15 147 Bảng –tiếp I II 16 17 Amaryllidaceae ( Họ Thủy tiên) 18 19 20 21 Asteliaceae (Họ Cúc) 22 23 24 Bromeliaceae (Họ Dứa) 25 26 Commelinaceae 27 ( Họ Thài lài) 28 29 Crassulaceae (Họ Tai hùm) 30 31 Iridaceae (Họ Lay ơn) Musacea (Họ Chuối) 148 Bảng – tiếp I 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 II Orchidaceae (Họ Lan) Pontederiaceae (Họ Cỏ cá chó) Zinggiberaceae (Họ gừng) Marantaceae (Họ Dong) Poaceae (Họ Tre) Clusiaceae ( Họ Bứa) Convolvulaceae (Họ Bìm bìm) Hydrocaryaceae (Họ Ấu) Dioscoreaceae (Họ Củ nâu) Agavaceae (Họ Thùa) 149 Thành phần mơi trƣờng thí nghiệm xác định vi khuẩn - Thạch Chapman medium ( Manitol – Salt agar ) Thành phần Pepton Cao thịt NaCl Đƣờng Manitol Đỏ Phenol Thạch Nƣớc cất - Môi trƣờng thạch Baird – Parker Thành phần Pepton Cao thịt bò Cao nấm men Lithium chlorit Thạch Natri Sulfamethazine Nƣớc cất Sau chuẩn bị mơi trƣờng hồn thiện : Đun chảy giữ nhiệt độ (45-50 C) 90ml môi trƣờng bản, cho thêm vào môi trƣờng dung dịch : Dung dịch glycin 20% 6,3ml Dung dịch potassium tellurit 1% 1ml Dung dịch Natri pyruvate 20% 5ml Dung dịch lòng đỏ trứng thể sữa 5ml - Thạch DC (Decarboxylase) Thành phần Peptone gelysate Cao nấm men 150 Glucose Bromocresol purple Nƣớc cất Đun hoà tan chất Chỉnh pH = 6,5 - Môi trƣờng KIA (Kligler Iron Agar) Thành phần Peptone Lactose Dextrose NaCl Ferric ammonium citrate Sodium thiosulfate Agar Phenol red Nƣớc cất Đun nóng hồ tan chất Chỉnh pH = 7,4 - Môi trƣờng Manit di động (Mannitol Salt Agar) Thành phần Cao thịt Polypeptone NaCl Mannitol Phenol red Agar Nƣớc cất - Môi trƣờng Ure-Indol Thành phần L-Triptophan Photphat monoopotasic Photphat dipotasic Natri clorua (NaCl) Ure 151 Phenol red cồn 2ml Đun chất với 1000 ml nƣớc cất 50-60 C Chỉnh pH = 7,2 Môi trƣờng Lysin decacboxylaza (LDC) - Thành phần L-Lysine HCl Dextrose KH2PO4 Nƣớc cất - Môi trƣờng Simmons Citrate Thành phần Sodium citrate NaCl K2HPO4 NH4H2PO4 MgSO4 Bromothymon Blue Agar Nƣớc cất Đun nóng nhẹ lắc cho tan chất Chỉnh pH = 6,8 glucoseLênmenelactos Lênmen Kíhiệu chủng Bảng Kết phản ứng sinh hóa chủng Salmonella phân lập 3.3 5.2 + 5.3 27.1 27.3 30.2 + + + + 30.6 32.2 33.2 34.2 38.1 39.1 40.4 40.5 42.2 43.2 43.4 44.5 52.3 55.1 55.2 59.3 60.5 61.1 62.4 63.4 63.5 64.1 65.1 72.1 72.4 75.1 75.2 77.2 77.3 79.2 79.3 83.1 83.2 86.3 86.4 89.1 89.3 90.3 93 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Chú thích: + phản ứng dương tính - phản ứng âm tính 153 Bảng Kết xác định phản ứng sinh hoá chủng Shigella phân lập Chủng TT nghi ngờ 2-(2) 3 5-(2) 29-(1) 29-(2) 30-(3) 31 33-(3) 38-(3) 10 39-(5) 11 41-(2) 12 42-(1) 13 43-(2) 14 43-(3) 15 44-(5) 16 48-(4) 17 52-(4) 18 58-(3) 19 59-(3) 20 60-(1) 21 62-(1) 22 63-(1) 23 64-(3) 24 72-(4) 25 77-(1) 26 78-(3) 27 79-(3) 28 83-(3) 29 86-(1) 30 86-(4) 31 88 32 89-(2) 33 91-(3) 34 92-(1) 35 93 36 95-(2) 37 97-(1) 38 99 Chú thích: + phản ứng dương tính - phản ứng âm tính 154 Bảng Kết thí nghiệm xác định enzym coagulase chủng S aureus phân lập STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Chú thích : Trên lam kính : (+) : Sau vài giây tụ cầu tụ lại với (-) : Khơng có tượng 155 Trên ống nghiệm : Huyết tương đông cứng sau 46h, khó di động Huyết tương đơng khơng sau 6h, dễ di động Không đông sau 24h Đông thành cục nhỏ, khơng liên kết khối Khơng có tượng 156 ... NHIÊN Mai Thị Đàm Linh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LECTIN THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG NGƢNG KẾT ĐẶC HIỆU VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40 01 LUẬN... 3.1 Nghiên cứu khả gây ngƣng kết lectin lên số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp 3.2 Tính đặc hiệu đƣờng dịch chiết lectin 3.3 Nghiên cứu mối tƣơng tác lectin với số vi khuẩn gây. .. nghiên cứu dừng lại vi? ??c thăm dò khả 10 ngƣng kết lectin số lồi vi khuẩn Tại Vi? ??t Nam chƣa có cơng trình nghiên cứu thống kê đầy đủ mối tƣơng tác đặc hiệu lectin với loài vi khuẩn gây bệnh, đặc