Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Tươi NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG QUA THỤ THỂ TLR4 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Tươi NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG QUA THỤ THỂ TLR4 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trịnh Tất Cường Hà Nội - 2012 Luận văn tốt nghiệp MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN Khái niệm viêm Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 2.1.1 Các chất kháng viêm 2.1.1.1 Các chất kháng viêm khôn 2.1.1.2.Các chất khang viêm co ba 2.1.1.3 Các chất khác 2.1.2 Thụ thể glucocorticoid (GR) chế kháng viêm 2.1.3.Thụ thể họ toll-like va chếkhang viêm 2.1.4.Tếbao marcrophage ̀̀ 2.1.5 Các mơ hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro 2.1.5.1 Mô hinh ̀̀ NF-κB (NF-κB dependent lucifera 2.1.5.2 Mô hinh sang locc̣ sư dung ̀̀ 2.1.5.3 Mô hinh sang locc̣ sư dung ̀̀ 2.1.5.4.Mô hinh nghiên cưu viêm t ̀̀ LPS 2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc Cây nhọ nồi ngải cứu 3.1 Cây nhọ nồi Luận văn tốt nghiệp 3.2 Cây ngải cứu Vai trò Wedelolactone nhọ nồi số hợp chất ngải cứu trình chống viêm 4.1 Wedelolactone 4.2 Một số hợp chất ngải cứu Chƣơng 2- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1.Động vật thí nghiệm 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xƣơng chuột 2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố Wedelolactone tới kh sống BMDM kít CCK-8 2.2.3 Đánh giá khả sản xuất cytokine ELISA 2.2.3.1 Giới thiệu phương phá 2.2.3.2 Ngun tắc 2.2.3.3 Quy trình thí nghiệm 2.2 Phƣơng pháp Western blot 2.2.4.1 Giới thiệu phương phá 2.2.4.2 Nguyên tắc 2.2.5 Phân tích ức chế Wedelolactone q trình ứng oxy hóa 2.2.6.Phân tích thống kế Luận văn tốt nghiệp Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả sống tế bào không bị ảnh hƣởng Wedelolactone 3.2 LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine 3.3 Wedelolactone ức chế trình sinh cytokine thơng qua thụ thể TLR4 kích thích LPS 3.4 LPS kích thích hoạt động yếu tố tự phân bào (MAPK) thông qua thụ thể TLR4 3.5 Wedelolactone ức chế trình phospho yếu tố tự phân bào LPS kích thích thơng qua thụ TLR4 3.6.Wedelolactone ức chế q trình sinh ROS thơng qua thụ thể TLR4 kích thích LPS 3.7 LPS kích thích hoạt động p47 phox q trình tạo ROS 3.8 Wedelolactone ức chế q trình sinh ROS thơng qua thụ thể TLR4 LPS 3.9 Dầu ngải cứu không gây độc BMDM 3.10 Dầu ngải cứu khơng có khả ức chế q trình sản xuất cytokine thông qua thụ thể TLR4 LPS KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Luận văn tốt nghiệp TT Từ viết tắt BMDM ELISA IL LPS NF-КB ROS TLR TNF/ TNFα OD Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Danh mục hình luận văn Thứ tự hình TT Trang Hình Cơ chếhoaṭđơngg̣ thu tg̣ hểGlucocorticoid tếbào Hình Mơ hình chếkháng viêm Glucocorticoid Hình Cơ chếhoạt động số TLR 10 Hình Biểu hiêṇ TLR ởcác tếbào bacḥ cầu 12 Hình Mơ hình sàng lọc sử dụng gen thơng báo luciferase có gắn NF κB 15 Hình Mơ hinh̀ sàng locg̣ sƣƣ̉ dungg̣ thu tg̣ hểglucocorticoid (GR) 16 Hình Mơ hinh̀ sàng locg̣ sƣƣ̉ dungg̣ thu tg̣ hểtoll like (TLRs) 18 Hình Mơ hinh̀ nghiên cƣƣ́u viêm thƣcg̣ nghiêṃ in vivo sƣƣ̉ dungg̣ LPS 20 Hình Cây nhọ nồi 23 Hình 10 Cây ngải cứu 24 Hình 11 Cấu trúc hóa học Wedelolactone 25 Hình 12 Biểu đồ Wedelolactone không gây độc tế bào BMDM 38 Hình 13 Biểu đồ LPS kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm kháng viêm 39 Hình 14 Biểu đồ Wedelolactone ức chế trình sinh cytokine tiền viêm 40 BMDM đƣợc kích thích zymosan Hình 15 LPS kích thích q trình phospho ERK1/2 p38 41 BMDM Hình 16 Wedelolactone ức chế trình phospho ERK1/2 p38 42 BMDM Hình 17 Wedelolactone Dex ức chế trình sản sinh ROS đƣợc kích thích LPS thơng qua TLR4 43 Luận văn tốt nghiệp Hình 18 LPS kích thích q trìn BMDM Hình 19 Wedelolactone ức chế q Hình 20 Dầu ngải cứu khơng gây đ Hình 21 Tinh dầu ngải cứu khơng cytokine tiền viêm B Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi MỞ ĐẦU Viêm đáp ứng tự nhiên thể để chống lại tác nhân gây bệnh từ môi trường bên ngồi như: tia tử ngoại, chất phóng xạ, chất hóa học đặc biệt tác nhân gây bệnh Kết viêm loại bỏ triệt tiêu hoàn toàn điều kiện sinh Như vậy, viêm đáp ứng có lợi cho thể Tuy nhiên, thời gian tồn lâu viêm chuyển từ giai đoạn cấp tính sang mãn tính gây nên hậu nghiêm trọng cho thể Những tác động viêm mãn tính mang lại phải kể đến như: gây rối loạn q trình chuyển hóa, trao đổi chất, ảnh hưởng đến hoạt động quan, chí để nặng dẫn đến suy giảm chức thận, gan… Do vậy, điều trị làm giảm bớt tác động bất lợi viêm thể vấn đề quan trọng nay, đặc biệt trình điều trị bệnh Các thuốc kháng viêm thị trường mà phổ biến Dexamethasone, chất có nguồn gốc cortiocoid, chủ yếu thuốc tổng hợp hóa học Các loại thuốc có tác động nhanh song tiềm tàng khả gây độc cho thể gây nên tác dụng phụ khơng mong muốn Sử dụng thuốc kháng viêm có nguồn gốc thực vật giải lo ngại với ưu điểm an toàn, hiệu lâu dài giá thành thấp Cho đến nay, việc tìm kiếm chất chống viêm có nguồn gốc từ thực vật quan tâm hiệu Gần đây, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội xây dựng mơ hình để sàng lọc đánh giá khả chất chống viêm mơ hình in vitro in vivo Với mơ hình này, Wedelolactone từ nhọ nồi tách chiết bước đầu khẳng định khả chống viêm Với hoạt tính phịng chống viêm đầy tiềm Wedelolactone, mơ hình sàng lọc chất chống viêm này, muốn nghiên cứu sâu đặc tính, chế chống viêm mức in vitro Ngồi ra, chúng tơi Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Agardh (Phaeophyta) and Ulva reticulata Forsskal (Chlorophyta) in experiment animal models”, African Journal of Biotechnology, 10(12), pp 2308-2314 19 Elewaut D (2009), “Selective glucocorticoid receptor agonists in rheumatoid arthritis reality or fiction”, European Musculoskeletal Review, 4(1), pp 24-25 20 Ferwerda B, McCall MB, Verheijen K, Kullberg BJ, Van der Ven AJ, Van der Meer JW, and Netea MG (2008), “ Functional consequences of toll-like receptor polymorphisms” Molecular Medicine, 14, pp 346–352 21 Goldstein SA, Shemano I, Daweo R, Betler JM (1967), “Cotton pellet granuloma pouch method for evaluation anti-inflammatory activity”, Arc International Pharmcodynamic Therapy, 165, pp 294-301 22 Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, Takeda K, and Akira S (1999), “Cutting edge: Toll-like receptor (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the LPS gen product”, Journal Immunology, 162, pp 3749–3752 23 Huang N, Hauck C, Yum MY, Rizshsky L, Widrlechner MP, Mccoy JA, Dixon PM, Nikolau BJ, Birt DF (2009), “Rosmarinic acid in ethanol extract inhibits lipopolysaccharide-induced prostaglandin E2 and nitric oxide in RAW 264.7 mouse macrophages”, Agricultural Food Chemistry, 57, pp 10579–10589 24 Janeway CA, Medzhitov R (2002), “Innate immune recognition”, Annual Review in Immunology, 20, pp 197-216 25 Jo EK (2010), “Innate immunity to mycobacteria: vitamin D and autophagy”, Cell Microbiology, 12(8), pp 1026-1035 26 Kino T, De Martino MU, Charmandari E, Mirani M, and Chrousos GP (2003a), “Tissue glucocorticoid resistance/hypersensitivity syndromes”, Journal Steroid Biochemistry, 85, pp 457–467 27 Kumar AP, Kumud U (2010), “Preliminary phytochemical screening and physicochemical parameters of aerial parts of Artemisia vulgaris”, International Journal of Research in Ayurveda & Pharmacy, 1, pp 206-211 48 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi 28 Kurt-Jones EA, Popova L, Kwinn L, Haynes LM, Jones LP, Tripp RA, Walsh EE, Freeman MW, Golenbock DT, Anderson LJ (2000), “Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus”, Nature Immunology, 1, pp 398–401 29 Lee S, Shin S, Kim H, Han S, Kim K, Kwon J, Kwak J H, Lee C K, Ha N J, Yim D, Kim K (2011), “Anti-inflammatory function of arctiin by inhibiting COX-2 expression via NF-КB pathways”, Journal of Inflammation, 8, pp 1624 30 Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA (1996), „The dorsoventral regulatory gen cassette spatzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults”, Cell, 86, pp 973-83 31 Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, and Janeway CA Jr (1997), “A human homologue of the Drosophila toll protein signals activation of adaptive immunity”, Nature, 388, pp 394–397 32 O‟neill LA, Bryant CE, Doyle S (2009), “Therapeutic targeting of toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer”, Pharmacology Review, 61, pp 177–197 33 Paur I, Balstad TR, Kolberg M, Pedersen MK, Austenaa LM, Jacobs DR, Blomhoff R (2010), “Extract of oregano, coffee, thyme, clove, and walnuts inhibits NF-kappaB in monocytes and in transgenic reporter mice”, Cancer Prevention Research, (5), pp 653–663 34 Peter J, Barnes DM, Michael K (1997), “Nuclear factor-kB- A pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases”, The New England Journal of Medicine, (336), pp 1066-1071 35 Ramasubramaniaraja R (2011), “Inflammation and medicinal herbs”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 9, pp 1-7 36 Rassa JC, Meyers JL, Zhang Y, Kudaravalli R, and Ross SR (2002), “Murine retrovi-ruses activate B cells via interaction with toll-like receptor 4”, The 49 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, pp 2281–2286 Riedemann NC, Guo RF, Ward PA (2003), “Novel strategies for the 37 treatment of sepsis”, Nature Medicine, 9, pp 17–24 38 Schäcke H, Zollner TM, Döcke WD, Rehwinkel H, Jaroch S, Skuballa W, Neuhaus R, May E, Zügel U, Asadullah K (2009), “Characterization of ZK 245186, a novel, selective glucocorticoid receptor agonist for the topical treatment of inflammatory skin diseases”, British Journal of Pharmacology, 158, pp 1088–1103 39 Schnare M, Rollinghoff M, and Qureshi S (2006) Toll-like receptors: sentinels of host defence against bacterial infection International Archives of Allergy and Immunology.139: 75–85 40 Schoepe S, Schäcke H, Asadullah K(2011), “Test systems for the determination of glucocorticoid receptor ligand induced skin atrophy”, Dermato-Endocrinology, 3, pp 1-5 41 Shin DM, Jeon BY, Lee HM, Jin HS, Yuk JM, Song CH, Lee SH, Lee ZW, Cho SN, Kim JM, Friedman RL, Jo EK (2010), “Mycobacterium tuberculosis Eis regulates autophagy, inflammation, and cell death through redox-dependent signaling”, PLoS Pathogens, 6(12), pp 1001- 1230 42 Vane J and Botting R (1987), “Inflammation and the mechanism of action of anti-inflammatory drugs”, The FASEB Journal, 1(2), pp 89-96 43 V M Jadhav et al (2009) Eclipta alba Linn – „„Kesharaja‟‟ : A Review Journal of Pharmacy Research 2(8): 1236-1241 44 Weiss DS, Raupach B, Takeda K, Akira S, and Zychlinsky A (2004), “Tolllike receptors are temporally involved in host defense”, Journal Immunology, 172, pp 4463–4469 45 Winter CA, Risely EA, Nuss GW (1962), “Carregeenan induced edema in hind paw of the rat as assay for anti-inflammatory drugs”, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 111, pp 544–547 50 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi 46 Yang CS, Ko SR, Cho BG, Shin D M, Yuk JM, Li S, Kim JM, Evans RM, Jung JS, Song DK and Jo EK (2008), “The ginsenoside metabolite compound K, a novel agonist of glucocorticoid receptor, induces tolerance to endotoxin-induced lethal shock”, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12, pp 1739–1753 47.http://www.rndsystems.com/mini_review_detail_objectname_MR04_TollLikeR eceptorFamily.aspx) 48.http://www.appliedhealth.com/index.php?option=com_content&view=article&id =108401&Itemid=212 49 http://www.panomics.com 51 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi PHỤ LỤC Pha dung dịch chuẩn Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 1000pg/ml dung dịch Assay Sau tiến hành pha dung dịch có nồng độ thấp gồm: 500pg/ml; 250pg/ml; 125pg/ml; 62.5pg/ml; 31.3pg/ml; 15.6pg/ml Dung dịch Assay đƣợc coi có nồng độ 0pg/ml Sau thu đƣợc dung dịch có nồng độ chuẩn nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn Đƣờng chuẩn đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ lƣợng OD đo đƣợc nồng độ thực tế cytokine Máy đọc ELISA cho kết lƣợng OD dung dịch mẫu sau trình bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể Kết có đƣợc chất hóa học đặc biệt đƣợc bổ sung kit, cho bƣớc sóng nhận biết đặc hiệu 450nm Sau thu đƣợc kết OD mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính cho kết nồng độ thực tế cytokine Các sai số phép đo đƣợc biểu thị thông qua hai lần xử lý số liệu: - Sai số trình dựng đƣờng chuẩn biểu thị sai lệch so với đƣờng tuyến tính - Sai số phép đo Hình: Đường chuẩn của cytokine IL-6 Đối với phân tích khả sản xuất cytokine tiền viêm kháng viêm zymosan BMDM kít ELISA, TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10 BMDMs đƣợc tách từ chuột đƣợc ủ với LPS zymosan sau số thời gian định Thu dịch sau ly tâm mẫu tế bào Sau dịch đƣợc đo nồng độ TNF-α, IL6, IL12p40, IL-10 kít ELISA (BD bioscience) Các thủ tục tiến hành đo cytokine đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn nhà chế tạo kít ELISA Nồng độ cytokine tiết từ tế bào nuôi cấy đƣợc đánh giá thơng qua khả hấp thụ bƣớc sóng 450 nm máy ELISA Quy trình thí nghiệm Westernblot A Các hoá chất, thiết bị sử dụng : - Gel SDS – page (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 15% - Metanol 100% Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi - PBS có 3% BSA (15ml PBS + 0,45g BSA) - Kháng thể sơ cấp - Kháng thể thứ cấp - EDTA pH 8, 20mM; BS 1X pH 7,4 - Đệm AP - Máy điện di: loại màng, giấy thấm, marker, kính, khung nhựa - Máy lắc RT B.Quy trình thí nghiệm a Đổ Gel SDS – page 15% b Cách lắp đặt *Xử lý màng : Ngâm metanol 100% 25 giây, sau ngâm phút đệm chuyển * Thứ tự lắp đặt: - Chạy từ cực (-) sang (+) ( màng đen: (-); màng trắng: (+) ) - Lắp đệm chạy protein Thứ tự theo chiều từ dƣới lên: màng trắng, màng cellulose, lớp giấy thấm, màng bllot, gel SDS – page, lớp giấy thấm, màng cellulose, màng đen ( màng bllot hƣớng cực (+), màng gel hƣớng cực (-) ) - Maker: sẵn màu (Retain maker) - Maker chạy protein SDS: không cần màu sẵn (unretain) c Điện di: Chạy điện di 2,5 – giờ, I = 100mA -Rửa kính, tráng nƣớc cất, lau cồn -Lắp kính vào khung nhựa -Cho H20 vào kiểm tra độ khít phút -Đổ gel tách xấp xỉ vạch xanh -Hút 200l etanol (EtOH) tuyệt đối cho gel phẳng, để 15-20 phút cho đông -Đổ cồn, lấy giấy thấm lau cồn -Đổ gel cô cắm lƣợc Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi -Sau gel đông, rút lƣợc, lấy giấy thấm cho bọt -Phủ mẫu lên sau hút đệm phủ lên tránh không để tràn -Đổ đệm vào kính, đệm cũ ngồi -Chạy 100- 110V, đến vạch xanh chạy cách gel 0,5cm dừng lại -Sau chạy xong tách gel phun H20 cho gel trôi xuống -Đổ dung dịch nhuộm protein, lắc 30 phút -Tẩy dung dịch tẩy (lắc số 9), dùng tẩy cũ sau dùng tẩy - lần đến gel trắng đƣợc d e Chuyển màng (Blotting): Blot 100mA, 1,5 25mA, C, qua đêm, Block PBS có 3% BSA ( 15ml PBS + 0,45g BSA), qua đêm, C RT giờ, nhiệt độ phòng f Rửa lần lắc 50 vòng RT, 37 C ( 5-10 phút/ lần) g Ủ với kháng thể sơ cấp, tỷ lệ 1:5000, RT 1giờ nhiệt độ phòng h Rửa lần lắc 50 vòng, nhiệt độ phòng 37 C, 5-10 phút, 3-5 phút/ lần i Ủ với kháng thể thứ cấp (Antimouse), tỷ lệ 1:10000, 1giờ 37 C 2giờ 0 4C j Rửa kỹ sau ngâm màng đệm AP (15ml), 10 phút k Hiện màu 15 phút + đệm AP, băng rõ (15-30 phút), sau tráng đệm + Tween l Dừng phản ứng 15 phút: EDTA pH 8, 20mM; BS 1X pH 7,4 Pha dung dịch a Gel tách Gel cô Acryamide H2 O Tris HCl 8,8 APS 10% TEMED Luận văn tốt nghiệp b Gel tách 12% 15% Acryamide (750x2) H2 O Tris HCl pH 8,8/ SDS 4X APS 10% TEMED c Đổ Gel cô 4% 5% Acryamide H2 O Tris HCl pH 6,8/ SDS 4X APS TEMED d.Cách pha đệm PBS 10X -K2HPO4 1M, 200ml = 17,418g x2 = 34,836g -KH2PO4 1M, 50ml = 13,609g/2 = 6,8045g -Lấy 160,4ml K2HPO4 + 39,6ml KH2PO4 đƣợc PBS pH 7,4 -Thêm khối lƣợng NaCl = 17,55g (Nồng độ cuối 150mM) e Cách pha đệm PBS 1X có 0,1% BSA dùng để pha kháng thể -PBS 1X có 0,1% Tween dùng cho bƣớc rửa g Cách pha đệm AP 25ml - Trisbase pH 9,5; 0,1M Luận văn tốt nghiệp - MgCl2: 5mM - NaCl: 0,1M h Cách pha đệm dừng: -EDTA pH 8, 20mM; PBS 1X pH 7,4 Nguyễn Thị Tươi ... hinh nghiên cưu viêm t ̀̀ LPS 2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc Cây nhọ nồi ngải cứu 3.1 Cây nhọ nồi Luận văn tốt nghiệp 3.2 Cây ngải cứu Vai trò Wedelolactone nhọ nồi số hợp chất ngải cứu trình chống. .. bào macrophage thông qua thụ thể TLR4 Đánh giá khả chống viêm ngải cứu tế bào macrophage thông qua thụ thể TLR4 Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả điều hòa Wedelolactone tinh dầu ngải cứu q trình... tài: ? ?Nghiên cứu khả chống viêm nhọ nồi ngải cứu thông qua thụ thể TLR4? ?? Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài Mục tiêu Xác định chức điều hòa trình đáp ứng viêm Wedelolactone tinh dầu ngải cứu tế