Nghiên cứu thay đổi lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN NGÂN HÀ NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC Ở MÔI TRƯỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN NGÂN HÀ NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC Ở MÔI TRƯỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO Chuyên ngành : Nhãn khoa Mã số : 9720157 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Huy Thịnh TS Nguyễn Xuân Tịnh HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành lòng biết ơn sâu sắc, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo sau đại học, Bộ mơn Mắt Trường Đại học Y Hà Nội, Trường Y Đại học Boston, Ban Giám đốc Bệnh viện Mắt Trung Ương quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình tơi học tập tiến hành nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Đặc biệt, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Huy Thịnh TS Nguyễn Xuân Tịnh – người thầy tận tình hướng dẫn, dìu dắt tơi q trình học tập, cơng tác chun mơn nghề nghiệp bảo giúp tơi giải nhiều khó khăn, vướng mắc trình thực nghiên cứu, giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Sayon Roy - Trường Y Đại học Boston PGS.TS Phạm Trọng Văn - Trưởng Bộ môn Mắt cho nhiều ý kiến q báu giúp tơi hồn thiện nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Hội đồng, hai nhà khoa học phản biện độc lập Các thầy nhiệt tình bảo, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể anh chị em Phòng nghiên cứu biến chứng mạch máu nhỏ đái tháo đường - Trường Y Đại học Boston Bộ môn Mắt - Trường Đại học Y Hà Nội anh chị trước, bạn bè đồng nghiệp quan tâm, giúp đỡ q trình học tập cơng tác Sau nữa, tơi xin dành tình u thương lịng biết ơn đến người thân gia đình, bạn bè chia sẻ chỗ dựa vững để thực hồn thành luận án Hà Nơi, ngày tháng 10 năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Ngân Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Ngân Hà, nghiên cứu sinh khóa 36, chuyên ngành Nhãn khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Trần Huy Thịnh TS Nguyễn Xn Tịnh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu xác, trung thực khách quan, sở nơi nghiên cứu xác nhận Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày 02 tháng 10 năm 2020 Người thực Nguyễn Ngân Hà DANH MỤC CH Ữ VIẾT TẮT APS : Ammonium Persulfate BAPN : β-Amin-opropionitrile BSA : Bovine serum albumin Coll IV : Collagen IV Cx : Connexin DAPI : 4',6-diamidino-2-phenylindole DMEM : Dulbecco Medified Eagle Medium FBS : Fetal Bovine Serum FITC : Fluorescein isothiocyanate FN : Fibronectin HIFs : Các yếu tố gây thiếu oxy HSPGs : Heparan sulfate proteoglycan LOX : Lysyl oxidase LOXsiRNA : LOX small interfering RNA NH4OH : Amonium Hydroxide PBS : Photphaste-buffered saline PDR : Bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh PVR : Bệnh dịch kính võng mạc tăng sinh RRD : Bong võng mạc nguyên phát TGF- β : Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β TTBS : Tween Tris-buffered saline VEGF : Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu WB : Western blot MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm mô học mao mạch võng mạc 1.1.1 Lớp nội mô 1.1.2 Màng đáy 1.1.3 Tế bào quanh mạch .9 1.1.4 Bất thường mao mạch võng mạc chuột đái tháo đường 1.2 Cơ chế sinh bệnh tổn thương mao mạch võng mạc tình trạng đường huyết cao 11 1.2.1 Dày màng đáy mao mạch võng mạc 11 1.2.2 Rối loạn kết nối tế bào-tế bào .14 1.2.3 Thay đổi cấu trúc ti thể .18 1.3 Lysyl oxidase .20 1.3.1 Đặc điểm lysyl oxidase .20 1.3.2 Các tình trạng bệnh lý liên quan đến thay đổi mức độ biểu LOX 23 1.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam giới 26 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 2.2 Địa điểm nghiên cứu 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm 30 2.3.2 Mẫu .30 2.3.3 Phương tiện nghiên cứu 31 2.3.4 Cách thức tiến hành 32 2.3.5 Các số nghiên cứu 50 2.4 Phương pháp thu thập số liệu xử lý số liệu 52 2.5 Đạo đức nghiên cứu 52 Chương 3: KẾT QUẢ 53 3.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 53 3.2 Sự thay đổi mức độ biểu LOX tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao 54 3.2.1 Tác động môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu LOX 54 3.2.2 Tác động chất ức chế LOX tới mức độ biểu LOX 62 3.2.3 Tác động thay đổi mức độ biểu LOX tới hoạt động tế bào 66 3.3 Sự thay đổi mức độ bám dính LOX với protein chất ngoại bào tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao 70 3.3.1 Thay đổi bám dính LOX với protein chất ngoại bào 70 3.2.2 Thay đổi mật độ liên kết LOX với protein chất ngoại bào 72 Chương 4: BÀN LUẬN .80 4.1 Sự thay đổi mức độ biểu LOX 80 4.1.1 Thay đổi mức độ biểu LOX 80 4.1.2 Thay đổi hoạt động tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu LOX 84 4.2 Sự thay đổi mức độ bám dính LOX với protein chất ngoại bào 94 KẾT LUẬN 100 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 102 DANH MỤC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Độ dày màng đáy mạch máu mô khác thể người Bảng 1.2 Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc loài khác DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Tác động môi trường nồng độ glucose cao tới LOX protein toàn phần .55 Biểu đồ 3.2 Tác động môi trường nồng độ glucose cao tới hàm lượng LOX chất ngoại bào 56 Biểu đồ 3.3 Tác động môi trường nồng độ glucose cao tới LOX tế bào 57 Biểu đồ 3.4 Tác động môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ LOX protein toàn phần 60 Biểu đồ 3.5 Tác động môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ LOX protein chất ngoại bào 61 Biểu đồ 3.6 Tác động môi trường nồng độ glucose cao tới hoạt động LOX 62 Biểu đồ 3.7 Tác động ức chế mức độ biểu LOX LOXsiRNA 63 Biểu đồ 3.8 Sự thay đổi mật độ LOX protein toàn phần 64 Biểu đồ 3.9 Tác động ức chế hoạt động LOX BAPN 65 Biểu đồ 3.10 Tác động thay đổi mức độ biểu LOX tới độ thẩm thấu tế bào nội mô mạch máu võng mạc 66 Biểu đồ 3.11 Tác động thay đổi mức độ biểu LOX tới tượng chết tế bào theo chương trình biểu thị qua số lượng tế bào chết/1000 tế bào 69 Biểu đồ 3.12 Tác động môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám dính LOX với Coll IV FN protein toàn phần 71 Biểu đồ 3.13 Tác động môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám dính LOX với Coll IV FN protein chất ngoại bào 72 Biểu đồ 3.14 Tác động môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với Coll IV protein toàn phần 73 Biểu đồ 3.15 Tác động môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với FN protein toàn phần Biểu đồ 3.16 Tác động môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với Coll IV protein chất ngoại bào Biểu đồ 3.17 75 76 Tác động môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với FN protein chất ngoại bào 79 Phụ lục MẪU THEO DÕI THỬ NGHIỆM NGÀY NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO Ngày Ngày Chuyển Chuyển sang TB mơi 30 trường nghìn tế bào nồng độ glucose cao Ngày Ngày Thay môi trường nuôi cấy Ngày Thay môi trường nuôi cấy Ngày Ngày Thay môi trường nuôi cấy Ngày Thay IP môi ngày trường NonPhenol (~2 triệu tế bào) MT bình thường MT nồng độ glucose cao đĩa tế bào đường kính 60mm IP ngày 2, WB ngày WB ngày Phụ lục MẪU CHẠY ĐIỆN DI PROTEIN Thử nghiệm số: Ngày thực hiện: Nguồn protein: Lượng protein: Điện di: Volt, Thời gian điện di: phút - Protein thị trọng lượng phân lượng: ul - Dung dịch ly giải: ul - 4X Laemmili: ul Chất thị trọng Ngăn Ngăn Ngăn Ngăn Ngăn Ngăn Ngăn Ngăn Ngăn lượng phân tử Phụ lục 10 KỸ THUẬT A: PHÂN LẬP TẾ BÀO SỬ DỤNG TRYPSIN-EDTA - Rửa đĩa tế bào dung dịch PBS lần A B C Hình Trypsin hoá A Dung dịch Trypsin-EDTA B Trước Trypsin hố (mơi trường ni cấy màu hồng) C Sau Trypsin (môi trường nuôi cấy suốt) - Trypsin hố: + Bơm 1ml Trypsin-EDTA vào đĩa đường kính 60mm + Đặt đĩa vào tủ ấm (37 độ C) 3-5 phút môi trường nuôi cấy trở nên suốt - Sau 3-5 phút quan sát đĩa sinh hiển vi đảm bảo tế bào tách khỏi đĩa di chuyển môi trường nuôi cấy - Bơm ml môi trường nuôi cấy vào đĩa để dừng trypsin hố - Lấy tồn dung dịch có chứa tế bào đĩa vào ống có dán nhãn - Quay ly tâm dung dịch có chứa tế bào tốc độ 800 rpm phút nhiệt độ độ C - Loại bỏ dung dịch phía trên, để lại cặn chứa tế bào phía - Rửa phần cặn tế bào 1ml dung dịch PBS lần, sau lấy bỏ hết dung dịch PBS, để lại cặn tế bào ống - Bơm 250 μl dung dịch lysis buffer vào ống chứa cặn tế bào - Ủ đá 15 phút A B C Hình Quay ly tâm dung dịch có chứa tế bào A Máy quay ly tâm B Dung dịch chứa cặn tế bào sau ly tâm C Dung dịch chưa cặn tế bào sau rửa với PBS - Quay ly tâm dung dịch có chứa tế bào tốc độ 800 rpm phút nhiệt độ độ C - Loại bỏ phần cặn phía dưới, lấy dung dịch phía sang ống có dán nhãn Phụ lục 11 KỸ THUẬT B: PHÂN LẬP CHẤT NỀN NGOẠI BÀO VỚI AMONIUM HYDROXIDE (NH4OH) - Trong tủ hút, chuẩn bị dung dịch NH4OH 20mM cách pha loãng dung dịch NH4OH với H2O không ion - Lấy đĩa tế bào khỏi tủ nuôi cấy Nhẹ nhàng hút bỏ môi trường nuôi cấy - Rửa đĩa tế bào dung dịch PBS không chứa ion Ca/Mg cách bơm dung dịch PBS vào thành đĩa, lắc nhẹ hút bỏ Lặp lại lần - Lấy bỏ hết PBS, cho 1.5 ml NH4OH 20mM vào đĩa tế bào 60mm 1ml Giữ nhiệt độ phòng phút, lắc nhẹ đĩa tế bào phút lần Lưu ý sử dụng dung dịch NH 4OH 8mM với thời gian ủ 10 phút - Sau phút, lấy bỏ dung dịch bao gồm NH 4OH, tế bào tách khỏi lớp chất H2O không ion Rửa 10ml nước không ion Lặp lại lần để đảm bảo loại bỏ hết NH4OH khỏi đĩa tế bào Thành phần lại đĩa tế bào lớp chất ngoại bào Lưu ý giữ đĩa tế bào ẩm trước thực bước cách lưu lại H2O lần rửa cuối Phụ lục 12 KỸ THUẬT C: PHÂN LẬP PROTEIN TOÀN PHẦN VÀ PROTEIN CHẤT NỀN NGOẠI BÀO - Nhẹ nhàng lấy bỏ môi trường nuôi cấy với pipet thuỷ tinh - Rửa đĩa nuôi cấy chứa tế bào chất ngoại bào dung dịch PBS cách bơm dung dịch PBS vào thành đĩa Lắc nhẹ hút bỏ dung dịch PBS Lặp lại lần - Hút bỏ dung dịch PBS khỏi đĩa Cho vào đĩa 250 μl dung dịch ly giải - Dùng thìa cạo mạnh vào đĩa, từ ngoại vi vào trung tâm, lặp lại nhiều lần để lấy hết protein đĩa - Lấy dung dịch ly giải có chứa protein thu tế bào cho vào ống 1.5ml - Ủ ống khay đá khô 15 phút - Sau 15 phút, quay ly tâm với tốc độ 10000 RPM phút - Bỏ lại phần cặn phía dưới, lấy dịch phía có chứa protein vào ống 1.5 ml Ghi nhãn ống bao gồm tên loại protein phân lập ngày phân lập Protein thu sử dụng bảo quản -20°C A B C Hình Phân lập protein A Thìa cạo protein B Các đĩa tế bào chứa protein sau rửa PBS C Ống nghiệm chứa protein ủ đá Phụ lục 13 KỸ THUẬT D: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ PROTEIN THU ĐƯỢC BẰNG KỸ THUẬT BCA - Lau khay 96 ô với dung dịch ethanol - Lấy dung dịch A B sử dụng xác định nồng độ protein - Cho 200 μl dung dịch A+B (bao gồm 196 μl dung dịch A μl dung dịch B, trộn thành phần) vào Vì muốn xác định nồng độ protein mẫu protein cần chuẩn bị 400 μl dung dịch A+B - Lấy ống 500 μl ghi nhãn tương ứng protein phân lập từ tế bào nuôi cấy môi trường bình thường mơi trường nồng độ glucose máu cao - Chuẩn bị dung dịch protein theo tỷ lệ sau: Bảng Lượng dung dịch protein dung dịch ly giải kỹ thuật BCA Nồng độ (μg/µL) 1.0 1.5 2.0 Dung dịch protein (μg/μL) 6.25 12.5 18.75 25 Dung dịch ly giải (μL) 25 18.75 12.5 6.25 Tổng (μL) 25 25 25 25 25 - Nếu muốn đạt nồng độ 1.0 μg/μl, cho 12.5 μl protein 12.5 μl dung dịch ly giải vào ống Trộn thành phần - Cho 25 μl dung dịch protein (bao gồm protein dung dịch ly giải) vào có chứa sẵn 200 μl dung dịch A+B - Bọc khay giấy bạc, ủ tủ ấm nhiệt độ 37°C 30 phút - Cho mẫu vào máy đọc kết (EL 340 Bio Kinetics Reader), máy hiển thị nồng độ protein mẫu Phụ lục 14 KỸ THUẬT E: LẮNG ĐỌNG MIỄN DỊCH Protein phân lập từ tế bào tiến hành kỹ thuật đồng lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX để thu protein LOX tế bào - Chuẩn bị: + Chuẩn bị ống 1.5ml có ghi nhãn + Chuẩn bị 250 μg protein vào ống 1.5 ml + Chuẩn bị dung dịch A (bao gồm 100 μL Protein A Agarose 100 μL 50 mM Tris-HCL, ph 7.4) Bảo quản dung dịch A nhiệt độ 4°C Trộn dung dịch A lần sử dụng - Ngày 1: + Làm protein: Lấy 7.5 μL dung dịch A cho vào ống chứa protein Đặt ống chứa dung dịch vào máy xoay tiếng phòng lạnh 4°C Sau tiếng, quay ly tâm tốc độ 13500 RPM phút + Lắng đọng miễn dịch: Chuyển dung dịch phía sang ống mới, bỏ lại phần cặn phía Lấy kháng thể kháng LOX tủ lạnh -20°C Lấy 2.5 μl kháng thể kháng LOX cho vào ống ✓ Đặt ống chứa dung dịch vào máy quay qua đêm phịng lạnh 4°C Hình Các ống chứa protein đặt máy quay qua đêm phòng lạnh - Ngày 2: Lấy ống chứa dung dịch protein khỏi phòng lạnh Cho 25 μl dung dịch A vào ống chứa dung dịch quay qua đêm Lưu ý trộn dung dịch A trước lần sử dụng Đặt ống vào máy xoay tiếng phòng lạnh Quay ly tâm tốc độ 14000 RPM Lấy bỏ phần dịch phía trên, để lại cặn phía Cho mL dung dịch ly giải vào ống, lắc nhẹ giữ lạnh phút Quay ly tâm tốc độ 14000 RPM nhẹ nhàng lấy bỏ phần dịch phía Lặp lại bước rửa với dung dịch ly giải lần Sau đó, quay ly tâm tốc độ 14000 RPM, loại bỏ phần dung dịch phía Cho 10 μl dung dịch 4x Lammeli vào phần cặn phía dưới, chuẩn bị tiến hành kỹ thuật WB ngày Phụ lục 15 KỸ THUẬT F:WESTERN BLOT VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG LOX - Kỹ thuật WB giúp xác định hàm lượng protein chuyên biệt có dung dịch protein nhằm đánh giá mức độ biểu LOX thông qua tín hiệu thu phim Xquang máy phát tín hiệu điện tử Tín hiệu biểu dạng vạch với đậm độ kích thước khác phản ánh hàm lượng LOX mẫu thử - Kháng thể sơ cấp: bao gồm μl kháng thể kháng LOX dòng thỏ pha 5ml BSA 5% - Kháng thể thứ cấp: bao gồm 0.625g sữa khô không béo, 12.5ml dung dịch 1X TTBS μl kháng thể kháng thỏ - Protein: + Để xác định hàm lượng LOX protein toàn phần protein chất ngoại bào, chuẩn bị ống nghiệm chứa 25μg protein nhóm thu sau kỹ thuật phân lập protein + Để xác định hàm lượng LOX tế bào, chuẩn bị ống nghiệm chứa protein thu sau kỹ thuật lắng đọng miễn dịch * Ngày thứ - Chuẩn bị gel + Chuẩn bị đĩa thuỷ tinh khay chứa gel Vệ sinh cồn 70° Kiểm tra đảm bảo khay kín, khơng bị rò nước + Chuẩn bị dung dịch APS 10% cách pha 0.1g bột APS vào ml dH2O + Chuẩn bị lớp gel phía Thành phần gồm: 1.9 ml dH2O, 1.7 ml 30% Polyacrylamide, 1.3 ml 1.5M Tris, 50 μl 10% SDS, 50 μl APS 10%, μl Temed Lưu ý thêm Temed cuối Lắc kỹ để trộn thành phần Đổ gel vào khay chứa gel Loại bỏ hết bọt khí cách thêm 50μl isobutanol lên lớp gel Để gel đơng lại vịng 30-45 phút + Chuẩn bị lớp gel phía Thành phần gồm 1.5 ml dH2O, 625 μl 0.5M Tris, 400μl 30% Polyacrylamid, 25 μl 10% SDS, 12.5 μl 10% APS, μl Temed Lưu ý thêm Temed cuối Lắc để trộn thành phần Đổ gel lên lớp gel phía đơng đặc Để gel đơng lại vịng 60 phút Có thể sử dụng gel bảo quản tủ lạnh 4°C dùng vào ngày hôm sau Hình Gel đơng khay thuỷ tinh - Chuẩn bị mẫu + Chuẩn bị 10 ml dung dịch 4x Laemmili bao gồm thành phần: 4ml Glycerol 100%, 2.4 ml 1M Tris/HCl (pH 6.8), 0.8g SDS, 4mg Bromophenol Blue, 3.1 ml dH2O, 500 μl β-Mercaptoethanol + Cho dung dịch bao gồm 4x Laemmili dung dịch protein nhóm vào ống 1.5ml có dán nhãn Cho ống vào máy luân nhiệt (thermocycler) đun nóng nhiệt độ 95° phút + Chuẩn bị chất thị trọng lượng phân tử bao gồm 1.5 μl Proseive, 19.5 μl dH2O μl 4x Laemmili Hình Chuẩn bị dung dịch protein nhóm MW: Chất thị màu N: Mơi trường bình thường HG: Mơi trường nồng độ glucose cao Hình Các ống nghiệm chứa dung dịch protein máy luân nhiệt - Điện di protein gel + Cho chất xác định trọng lượng phân tử dung dịch protein vào ngăn gel tương ứng + Điện di protein gel với cơng suất 100V 70 phút Hình Điện di protein gel - Chuyển protein từ gel sang màng + Chuẩn bị khay chứa lần lượt: Methanol, dH2O dung dịch chuyển + Chuẩn bị màng: Cho màng qua khay Methanol, dH2O dung dịch chuyển + Chuẩn bị giấy lọc: Cho miếng giấy lọc vào khay dung dịch chuyển + Lấy gel protein khỏi máy điện di protein + Chuẩn bị gel-màng gồm lớp lần lượt: miếng giấy lọc - màng - gel protein - miếng giấy lọc + Cho gel-màng vào máy chuyển 60 phút A B Hình Chuyển protein từ gel sang màng A Tấm gel-màng B Tấm gel-màng đặt máy chuyển - Nhuộm Ponseau-S + Sau chuyển protein từ gel sang màng, nhuộm màng với dung dịch Ponseau-S phút + Rửa màng với dung dịch dH20 phút, lặp lại lần + Scan màng + Sau scan màng, rửa màng với TTBS phút, lặp lại lần để tẩy hết màu Ponseau-S - Cố định với kháng thể sơ cấp + Chuẩn bị dung dịch cố định bao gồm 1.25g sữa khô không béo 25 ml dung dịch TTBS + Đặt màng vào khay có chứa 25ml dung dịch cố định, lắc nhẹ 60 phút + Chuẩn bị kháng thể sơ cấp + Sau cố định màng với sữa không béo 60 phút, rửa màng với dung dịch TTBS phút, lặp lại lần + Đặt màng vào túi giấy bóng hình chữ nhật, dán cạnh túi + Cho kháng thể vào túi màng, dán cạnh lại Đảm bảo loại bỏ hết bóng khí khỏi túi giấy bóng trước dán cạnh cịn lại + Cho túi màng vào phòng lạnh, lắc nhẹ qua đêm * Ngày thứ hai - Lấy màng từ phòng lạnh, cho vào khay, rửa với dung dịch 1X TTBS 10 phút, lặp lại lần - Chuẩn bị kháng thể thứ cấp - Cố định màng với kháng thể thứ cấp vòng 60 phút - Sau 60 phút, rửa màng với dung dịch 1X TTBS 10 phút, lặp lại lần - Ủ màng với ml dung dịch chất (substrate) A B Hình Ủ màng với dung dịch chất A Chất AP-Substrate B Màng ủ dung dịch chất - Phát phân tích hình ảnh sử dụng phim X-quang máy phát hình ảnh điện tử Tín hiệu phát dạng vạch kích thước đậm độ khác phản ánh hàm lượng protein mẫu Phần mềm ImageJ sử dụng để phân tích vạch ... mức độ biểu LOX tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao Phân tích thay đổi mức độ bám dính LOX với protein chất ngoại bào tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường. .. mẫu nghiên cứu 53 3.2 Sự thay đổi mức độ biểu LOX tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao 54 3.2.1 Tác động môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu... cứu - Nhóm nghiên cứu: Các tế bào nội mơ mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy môi trường nồng độ glucose cao - Nhóm đối chứng: Các tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy mơi trường nồng độ