Ứng Dụng Nấm Sợi Và Enzyme Protease Để Cải Tiến Qui Trình Sản Xuất Tương Miso

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG NẤM SỢI VÀ ENZYME PROTEASE ĐỂ CẢI TIẾN QUI TRÌNH SẢN XUẤT TƯƠNG MISO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts.NGUYỄN VĂN THÀNH VIỆN NC & PT CNSH SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN CHÍ THIỆN MÃ SỐ SINH VIÊN: 3064417 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 04/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Văn Thành Nguyễn Chí Thiện XÉT DUYỆT CỦA BỘ MƠN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Luận văn hoàn thành nhờ giúp đỡ, động viên gia đình, thầy cô tất bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32, Cơng Nghệ Sinh Hoc Tiên Tiến khóa 32 Xin chân thành biết ơn: - Thầy Nguyễn Văn Thành, cán giảng dạy nghiên cứu – Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học cung cấp ý tưởng đề tài, tận tình hướng dẫn chuyên môn kinh nghiệm cho suốt thời gian thực đề tài - Thầy Võ Văn Song Toàn hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phân tích để tơi hồn thành thí nghiệm liên quan đến enzyme - Tất Thầy, Cô tham gia giảng dạy truyền đạt kiến thức cho tơi suốt khóa học - Các cán phịng thí nghiệm Huỳnh Xn Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Ngơ Thị Xuân Dung tạo điều kiện dụng cụ, hướng dẫn sử dụng trang thiết bị, góp ý thao tác thực hành để đạt kết luận văn Các cán Viên Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học thăm hỏi, động viên suốt thời gian thực luận văn Cám ơn anh Trần Hoàng Dũng, Học Viên Cao Học lớp Cơng Nghệ Sinh Học Khóa 14 tận tình dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành kết đề tài Cuối quên công ơn gia đình bạn thân ln chia sẻ động viên suốt thời gian học tập Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Nguyễn Chí Thiện Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT TÓM TẮT Nhằm nghiên cứu đưa quy trình sản xuất tương miso sở ứng dụng công nghệ sinh học để tạo sản phẩm dinh dưỡng cao đạt tiêu chuẩn chất lượng an toàn thực phẩm Đồng thời, nghiên cứu phương thức rút ngắn thời gian sản xuất, tạo sản phẩm phù hợp với sản xuất nước nên đề tài “ứng dụng nấm sợi enzyme protease để cải tiến qui trình sản xuất tương MiSo” tiến hành Qua kết nghiên cứu, số kết rút sau: - Sử dụng tỷ lệ nguyện liệu tấm:cám 9:1, bổ sung nấm mốc Aspergillus oryzae với tỷ lệ105 bào tử/g chất thời gian ủ 72 cho koji gạo có hoạt tính protease cao - Bổ sung enzyme Flavourzyme với hàm lượng 0,6 U/g chất cho hiệu thủy phân protein cao so với không bổ sung enzyme protease Việc bổ sung enzyme làm cho trình lên men diễn nhanh - Sử dụng nấm men Zygosacchromyces rouxii với tỉ lệ chủng 102 tb/gck phương thức bổ sung ngày đầu thủy phân cho sản phẩm có mùi dịu nhẹ đặt trưng i Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 giới thiệu miso 2.2 nguyên liệu sản xuất miso 2.2.1 Đậu nành 2.2.2 Gạo 2.2.3 Muối ăn 2.3 Quy trình sản xuất miso 2.3.1 Quy trình sản xuất 2.3.2 Các giai đoạn quy trình sản xuất 11 2.3.2.1 Xử lý đậu nành 11 2.3.2.2 Tane-koji 11 2.3.2.3 Chuẩn bị Koji gạo 12 2.3.2.4 Men vi khuẩn lên men 12 2.3.2.5 Lão hố đóng gói 12 2.4 Ứng dụng nấm sợi enzyme protease quy trình sản xuất miso: 12 2.4.1 Bổ sung enzyme protease 12 2.4.1.1 Papain 14 2.4.1.2 Flavourzyme® 500 MG 15 2.4.2 Bổ sung nấm mốc Aspergillus oryzae 16 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Phương tiện nghiên cứu 19 3.1.1 Địa điểm 19 3.1.2 Thời gian dự kiến thực 19 3.1.3 Nguyên liệu 19 3.1.4 Thiết bị dụng cụ 19 3.1.5 Môi trường hóa chất 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Quy trình thí nghiệm 20 3.2.2 Xác định thành phần nguyên liệu 22 3.2.2.1 Đậu nành gạo 22 3.2.2.2 Enzyme protease thương phẩm 22 3.2.2.3 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 22 3.2.2.4 Chủng nấm men Zygosaccharomyces rouxii 22 3.2.3 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa qui trình làm koji 22 ii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT 3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng enzyme protease đến khả thủy phân protein: 24 3.2.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nấm men Zygosacchromyces rouxii bổ sung đến mùi vị chất lượng cảm quan sản phẩm miso 25 3.2.6 Đánh giá hiệu qui trình 27 3.2.7 Xử lý số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 28 4.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa quy trình làm koji 28 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng enzyme protease đến khả thủy phân protein 32 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nấm men Zygosacchromyces rouxii bổ sung đến mùi vị chất lượng sản phẩm miso 36 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 iii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Phân loại Miso Bảng 2: Thành phần hoá học hạt đậu nành Bảng 3: Thành phần acid amin protein đậu nành Bảng 4: Thành phần hydratcacbon đậu nành Bảng 5: Thành phần khoáng hạt đậu nành Bảng 6: Thành phần vitamin hạt đậu nành Bảng 7: Giá trị dinh dưỡng 100g gạo Bảng 8: Nhân tố thí nghiệm 23 Bảng 9: Bố trí thí nghiệm thăm 23 Bảng 10: Nhân tố thí nghiệm 24 Bảng 11: Bố trí thí nghiệm 25 Bảng 12: Nhân tố thí nghiệm 25 Bảng 13: Bố trí thí nghiệm 27 Bảng 14: Kết khảo sát ảnh hưởng loại chất, tỉ lệ nấm mốc A oryzae chủng vào thời gian ủ đến hoạt tính enzyme protease koji gạo 28 Bảng 15: Hoạt tính enzyme trung bình (U/g) theo thời gian ủ (giờ) 31 Bảng 16: Kết đo hoạt tính enzyme Flavourzyme Papain: 32 Bảng 17: Kết xác định hàm lượng đạm amin bổ sung hai loại enzyme Flavourzyme Papain 33 Bảng 18: Kết phân tích hàm lượng đạm amoniac nghiệm thức theo thời gian lên men 36 Bảng 19: Kết phân tích hàm lượng đạm tổng số nghiệm thức theo thời gian lên men 36 iv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT Bảng 20: Kết phân tích hàm lượng đạm amin theo thời gian lên men 37 Bảng 21: Kết phân tích hàm lượng acid tổng nghiệm thức theo thời gian lên men 38 Bảng 22 Kết đếm mật số nấm men nghiệm thức theo thời gian lên men 39 Bảng 21:so sánh tiêu đạm Miso sản xuất với qui trình cải tiến nước với Miso Nhật 41 v Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Đậu nành hạt Hình 2: Đậu nành hạt sau ngâm Hình 3: Gạo trắng Hình 4: Quy trình sản xuất miso mặn Nhật Hình 5: Quy trình sản xuất miso Việt Nam 10 Hình 6: Nguồn nguyên liệu thu nhựa để sản xuất papain 14 Hình 7: Aspergillus oryzae 16 Hình 8: Aspergillus oryzae kính hiển vi 16 Hình 9: Quy trình thí nghiệm chung 21 Hình 10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng loại chất đến hoạt tính enzyme theo thời gian 31 Hình 11: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đạm amin bổ sung Papain 34 Hình 12: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đạm amin bổ sung Flavourzyme 34 Hình 13: Đồ thị biểu diễn khác biệt hàm lượng đạm amin bổ sung enzyme Papain Flavourzyme 35 Hình 14: đồ thị biểu diễn hàm lượng đạm amin theo thời gian 37 Hình 15: đồ thị biểu diễn hàm lượng acid tổng theo thời gian 38 vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32-2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Miso, loại thực phẩm lên men từ đậu nành quan trọng phổ biến Nhật Bản, làm tiêu thụ số nước phương Đông Miso giống với “tương” người Việt, “jang” người Trung Quốc, “doenjang” người Triều Tiên, “taucho” người Indonesia “tao-tsi” người Phillipine (Steinkraus, 1989) Nhìn chung, sản phẩm Miso biết đến loại tương đặc Giống nước tương, Miso làm từ ngũ cốc, đậu nành, muối lên men nhờ hoạt động nấm mốc, nấm men vi khuẩn (Hesseltine and Wang, 1979) Miso sản phẩm gia vị thực phẩm cung cấp đầy đủ acid amin, vitamin, protein khoáng vi lượng, đặc biệt chất béo dễ tiêu, không giống chất béo từ thức ăn có nguồn gốc từ động vật Tuy nhiên, Việt Nam, Miso cịn lạ, người dân biết đến sức tiêu thụ khơng đáng kể, tập trung vùng thành phố lớn có ẩm thực đa dạng Bên cạnh đó, sản phẩm miso sản xuất nước chưa có quy trình ổn định, nguy có độc tố aflatoxin cao sử dụng nấm mốc tự nhiên Còn sản phẩm chất lượng chủ yếu hàng nhập khẩu, giá cao, không phù hợp với đại đa số người dân 1.2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu đưa quy trình sản xuất tương miso sở ứng dụng công nghệ sinh học bổ sung vi sinh vật (nấm mốc Aspergillus oryzae) enzyme protease để tạo sản phẩm dinh dưỡng cao có hàm lượng acid amin cân bằng, hương vị tự nhiên, đạt tiêu chuẩn chất lượng an toàn thực phẩm Đồng thời, nghiên cứu phương thức rút ngắn thời gian sản xuất, tạo sản phẩm phù hợp với sản xuất nước nên đề tài “ứng dụng nấm sợi enzyme protease để cải tiến qui trình sản xuất tương MiSo” thực Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học + 200 µl nước + 1,5 ml OPA + 200 µl dung dịch thủy phân pha loãng + 1,5 ml OPA, để yên phút, đo bước sóng 340 nm 1.5.3 Tính kết M N  CS  VS 14,2   k ( mgN / g ) 1000 m MN: hàm lượng đạm acid amin CS  ODS  OD0  0,9516 (mMol / L) ODSD  OD0 0,9516: mMol/L serin (tương đương 0.9516 mMol/L nitơ) VS: thể tích dịch thủy phân (ml) m: khối lượng mẫu (g) k: hệ số pha loãng ODSD, ODS, OD0: độ hấp thụ 340 nm mẫu chuẩn serin, mẫu thật, mẫu không 1.6 Xác định hàm lượng đạm tổng số phương pháp Kjeldahl 1.6.1 Nguyên lý Khi đun mẫu vật có chứa nitơ (đạm) H2SO4 đậm đặc với diện chất xúc tác thích hợp tất hợp chất hữu bị oxy hóa, cacbon hydro tạo thành CO2 H2O Nitơ phóng thích dạng NH3, NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan dung dịch (H2 SO4 đđ, xúc tác, nhiệt độ) Hợp chất chứa nitơ (N) (NH4)2SO4 Chưng cất, đuổi nitơ khỏi dung dịch (NH4)2SO4 dạng NH3 NaOH, hấp thu NH3 dung dịch axit boric (H3BO3) với chất thị màu (hỗn hợp bromoresol green methyl red) tạo thành muối amonium tetraborat Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + 4H3BO3 H2O (NH4)2B4O7 + 5H2O Sau định phân lượng nitơ dung dịch (NH4)2B4O7 dung dịch acid mạnh H2SO4 0,05N (chuẩn) đến dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu đỏ nâu (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3 1.6.2 Các bước tiến hành * Chuẩn bị hóa chất + Chất xúc tác vơ hóa: Nghiền mịn trộn theo tỉ lệ sau: 100 g K2SO4 : 10 g CuSO4 : g Se + Hỗn hợp chất thị màu: Cân 0,099 g bromoresol green 0,066 g methyl red hòa tan 100 ml ethanol + Dung dịch acid boric _ thị màu: Cân 20 g acid boric (H3BO3) hòa tan 950 ml nước cất, sau cho 20 ml dung dịch chất thị màu khuấy đều, cho thêm nước cất vào cho vừa đủ 1lít (dung dịch có màu đỏ) Dùng NaOH 0,1N chỉnh màu dung dịch màu đỏ nâu chuyển sang màu xanh (pH 5) (Bremner, 1970) + Dung dịch NaOH 10N: Cân 400 g NaOH hịa tan nước cất cho vừa đủ lít (chứa bình kín hạn chế tiếp xúc khí CO2) + Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05N -93 * Vô hóa mẫu + Cho vào bình Kjeldahl 0,5 g mẫu, sau cho ml H2SO4 đậm đặc, 0,5 g chất xúc tác vơ hóa Tráng bình Kjeldahl vịng nước cất, sau đó, đem đun tủ hút độc đến dung dịch suốt hay có màu xanh lơ Để nguội, cho vào nước cất, dung dịch suốt hay có màu xanh lơ CuSO4 mẫu bị vơ hóa hồn tồn, dung dịch có hạt màu đen ta tiếp tục đun + Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu lượng nước cất) để loại trừ sai số * Chưng cất Chuyển dung dịch vơ hóa vào hệ thống chưng cất đạm KjetecTM2300 lập trình sẵn Máy phân tích tự động với chương trình bổ sung 50 ml nước cất, 30 ml dung dịch NaOH 40% Bình chuẩn độ bổ sung 50 ml H3BO3 1% - chất thị màu chuẩn độ tự động dung dịch H2SO4 0,1N Kết hiển thị hình 1.7 Xác định hàm lượng đạm amoniac băng phương pháp cất kéo nước (Lê Thanh Mai, 2005) 1.7.1 Nguyên lý Đẩy muối amoni thể tự (thường dạng muối NH4Cl) chất kềm mạnh amoniac Mg(OH)2 Dùng nước kéo amoniac giải phóng sang bình hấp thụ chứa dung dịch axit boric (H3BO3) với chất thị màu (hổn hợp bromoresol green methyl red) tạo thành muối amonium tetraborat MgCl2 + 2NH3 + 2H2O 2NH4Cl + Mg(OH)2 2NH3 + 4H3BO3 H2O (NH4)2B4O7 + 5H2O Sau định phân lượng nitơ dung dịch (NH4)3BO4 dung dịch axit mạnh H2SO4 0.05N (chuẩn) đến dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu đỏ nâu (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3 1.7.2 Các bước tiến hành * Chuẩn bị hóa chất + Hỗn hợp chất thị màu: Cân 0,099 g bromoresol green 0,066 g methyl red hòa tan 100 ml ethanol + Dung dịch axit boric _ thị màu: Cân 20 g acid boric (H3BO3) hòa tan 950 ml nước cất, sau cho 20 ml dung dịch chất thị màu khuấy đều, cho thêm nước cất vào cho vừa đủ lít (dung dịch có màu đỏ) Dùng NaOH 0,1N chỉnh màu dung dịch màu đỏ nâu chuyển sang màu xanh (pH 5) (Bremner, 1970) + MgO bột + Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05N * Chưng cất + Cho vào bình hệ thống chưng cất 50 ml nước cất, hút xác ml mẫu nước cần phân tích (1 g chất khơ), cho thêm g Mg(OH)2 Làm kín hệ thống chưng cất cho nước NH3 tạo thành NH4OH vào cốc chứa 10 ml dung dịch axit boric_chất thị màu Sau hứng khoảng 50 ml dung dịch có màu xanh nước biển (thử cách dùng giấy quỳ: nước tụ từ ống sinh hàn làm giấy quỳ chuyển sang màu xanh nước cịn lượng NH3 q trình chưng cất chứa kết thúc, giấy quỳ không đổi màu chứng tỏ nước khơng có NH3 q trình chưng cất kết thúc) + Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu lượng nước cất) để loại trừ sai số * Định phân Dung dịch sau chưng cất đạm có màu xanh nước biển đem chuẩn độ dung dịch H2SO4 0,05N đến dung dịch màu xanh chuyển sang màu đỏ nâu (pH 5) kết thúc, đọc số ml dung dịch H2SO4 0,05N sử dụng 1.7.3 Tính kết Nito amoniac  0,0007  (V  V0 )  1000 0,7  (V  V0 ) ( g / l )(hay g / kgDw)  ( g / l )( hay g / kgDw) m m Trong đó: Số ml H2SO4 0,05N dùng chuẩn độ mẫu V: V0: Số ml H2SO4 0,05N dùng chuẩn độ mẫu thử không 0.0007: Số gram nitơ tương ứng với 1ml H2SO4 0.05N m: Số ml mẫu (đối với mẫu nước) hay số gram mẫu (đối với mẫu khơ) đem phân tích 1000: Hệ số quy đổi từ ml sang lít hay từ gam sang kg 1.8 Xác định hàm lượng đạm amin phương phương pháp chuẩn độ formol (Nguyễn Văn Thành, 2006) 1.8.1 Nguyên lý Các acid amin dung dịch nước trung tính, khơng nhóm chức acid (-COOH) amin (-NH2) trung hòa lẫn nhau, mà cà nhóm chức yếu, q trình điện li Khi gặp formol, nhóm –NH2 kết hợp với formol thành nhóm metylenic N=CH2 tính chất kềm, đó, tính chất acid nhóm -COOH bật lên định phân chất kềm R—CH—COOH R—CH—COOH + H2O NH2 + HCHO N=CH2 * Chú ý: - Các muối amoni, thí dụ NH4Cl dung dịch trung tính, gặp formol làm dung dịch trở nên acid, định lượng chất kềm, hình thành hexametylen tetramin HCl, theo phản ứng: 4NH4Cl + 6HCHO (CH2)6N4 + 6H2O + HCl + Nếu mẫu có acid amin nitơ formol nitơ amin + Nếu mẫu có acid amin lẫn muối amoni, nitơ formol tổng nitơ acid amin nitơ amoniac - Đây trường hợp acid yếu định lượng chất kềm mạnh, nên điểm tương đương phải pH kềm (pH 9-9,5) phản ứng kết thúc phenolphtalein chuyển sang màu đỏ tươi (chứ màu hồng (pH 8,3) thông thường) (Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nhu Thuận Kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm Đại học Bách khoa Hà Nội, 1991) 1.8.2 Các bước tiến hành * Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch chuẩn NaOH 0,05N - Dung dịch formol trung tính: Dung dịch formol 37%, dùng NaOH 0,1N chỉnh pH = * Định phân - Hút xác 2ml mẫu cho vào cốc chứa 18ml nước cất, dùng NaOH 0,05N (lần 1) điều chỉnh pH = Cho vào 5ml dung dịch formol trung tính (pH = 7) khuấy khoảng phút Dùng NaOH 0,05N (lần 2) chuẩn độ pH 9,3 ngưng đọc kết số ml NaOH 0,05N sử dụng (lần 2) - Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu lượng nước cất) để loại trừ sai số 1.8.3 Tính kết Nito formol  0,0007  (V  V0 )  1000 0,7  (V  V0 ) ( g / l )( hay g / kgDw)  ( g / l )( hay g / kgDw) m m Trong đó: Số ml NaOH 0,05N dùng chuẩn độ mẫu V: V0: Số ml NaOH 0,05N dùng chuẩn độ mẫu thử không 0.0007: Số gram nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,05N m: Số ml mẫu phân tích 1000: Hệ số quy đổi từ ml sang lít 1.9 Xác định hàm lượng muối NaCl máy YSI 1.9.1 Nguyên lý máy đo độ muối YSI phát độ muối khoảng 0-0,4% 1.9.2 Các bước tiến hành - Lấy 10 ml dung dịch mẫu pha với 90 ml nước cho vào cốc, nhúng điện cực vào dung dịch ghi nhận kết tren máy - Trước đo mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu lượng nước cất) để kiểm tra máy 1.9.3 Tính kết Nồng độ muối dung dịch mẫu (%) = kết đọc máy x 10 1.10 Đến trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc A oryzae buồng đếm hồng cầu Có thể sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định số lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn nấm men, bào tử nấm mốc Phương pháp trực tiếp giúp quan sát dược hình thái tế bào 1.10.1 Nguyên tắc Dùng pipet cho giọt mẫu cần xác định mật số tế bào vào buồng đếm, đặt kinh lên Đếm số tế bào vi sinh vật kính hiển vi với vật kính X40 1.10.2 Thiết bị + Lá kính hình vng 22 x 22 mm + Kính hiển vi + Buồng đếm hồng cầu Burk – Turk phiến kính dày hình chữ nhật, có phần lõm phẳng, có kẻ lưới gồm 16 vng lớn, vng lớn có 16 vng nhỏ Kích thước sau: Chiều sâu ô: 1/10 mm Cạnh ô vuông nhỏ: 1/20 mm Diện tích vng nhỏ: 1/20 x 1/20 = 1/400 mm2 Thể tích vng nhỏ: 1/400 x 1/10 = 1/4000 mm3 Thể tích vng lớn: 16 x 1/4000 = 1/250 mm3 Thể tích buồng đếm: 16 x 1/250 = 0,064 mm 1.10.3 Tiến hành Pha lỗng mẫu đến mức nhỏ buồng đếm có từ đến 10 tế bào vi sinh vật Dùng micropipet lấy giọt mẫu cần xác định, đậy kính lên cho vào buồng đếm để yên tránh không để tràn ngoại, không bị bọt khí Chỉnh kính hiển vi đến vật kính X40 để thấy rõ ô nhỏ buồng đếm Đếm tất tế bào có đếm kể tế bào có 2/3 tế bào nằm ô đếm Đến ô lớn góc 1.10.4 Tính kết 1.10.5 Số tế bào 1ml (hoặc gam) mẫu phân tích tính sau: N n (tế bào/ml g) Vf Trong đó: n: số tế bào trung bình có lớn V: thể tích lớn (1/250 mm3) f: hệ số pha loãng mẫu PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Bảng 20: Kết phân tích phương sai ảnh hưởng nhân tố nguyên liệu, thời gian, tỷ lệ giống chủng đến hoạt tính enzyme Koji Analysis of Variance for HT_ENZYME - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:NGUYEN_LIEU 0.0687053 0.0687053 597.65 0.0000 B:THOI_GIAN_U 0.224718 0.0749061 651.59 0.0000 C:TY_LE_CHUNG 0.325542 0.162771 1415.91 0.0000 INTERACTIONS AB AC BC ABC 0.0463332 0.022878 0.209915 0.00954846 6 0.0154444 0.011439 0.0349859 0.00159141 134.35 99.51 304.34 13.84 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 RESIDUAL 0.002759 24 0.000114958 -TOTAL (CORRECTED) 0.9104 47 -All F-ratios are based on the residual mean square erro Bảng 21: Kiểm định LSD 95% hoạt tính enzyme Koji theo nguyên liệu Multiple Range Tests for HT_ENZYME by NGUYEN_LIEU -Method: 95.0 percent LSD NGUYEN_LIEU Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -1 24 0.118583 0.00218859 X 24 0.19425 0.00218859 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - *-0.0756667 0.00638806 -* denotes a statistically significant difference Bảng 22: Kiểm định LSD 95% hoạt tính enzyme Koji theo tỷ lệ chủng Multiple Range Tests for HT_ENZYME by TY_LE_CHUNG -Method: 95.0 percent LSD TY_LE_CHUNG Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -4 16 0.0443125 0.00268047 X 16 0.185125 0.00268047 X 16 0.239813 0.00268047 X -Contrast Difference +/- Limits -4 - *-0.140812 0.00782374 - *-0.1955 0.00782374 - *-0.0546875 0.00782374 -* denotes a statistically significant difference Bảng 23: Kiểm định LSD 95% hoạt tính enzyme Koji theo thời gian Multiple Range Tests for HT_ENZYME by THOI_GIAN_U Method: 95.0 percent LSD THOI_GIAN_U Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -36 12 0.0396667 0.00309514 X 48 12 0.184917 0.00309514 X 72 12 0.186583 0.00309514 X 60 12 0.2145 0.00309514 X -Contrast Difference +/- Limits -36 - 48 *-0.14525 0.00903408 36 - 60 *-0.174833 0.00903408 36 - 72 *-0.146917 0.00903408 48 - 60 *-0.0295833 0.00903408 48 - 72 -0.00166667 0.00903408 60 - 72 *0.0279167 0.00903408 -* denotes a statistically significant difference Bảng 24: Kết phân tích phương sai ảnh hưởng nhân tố loại enzyme, hàm lượng enzyme bổ sung thời gian thủy phân đến hàm lượng đạm amin Analysis of Variance for DAM AMIN - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:HAM LUONG ENZYME 0.543625 0.271812 111.18 0.0000 B:LOAI ENZYME 9.84369 9.84369 4026.50 0.0000 C:THOI GIAN 18.8036 6.26788 2563.83 0.0000 INTERACTIONS AB AC BC ABC 0.127414 0.0682356 0.233097 0.05751 6 0.0637068 0.0113726 0.0776991 0.00958499 26.06 4.65 31.78 3.92 0.0000 0.0029 0.0000 0.0072 RESIDUAL 0.0586735 24 0.00244473 -TOTAL (CORRECTED) 29.7359 47 -All F-ratios are based on the residual mean square error Bảng 25: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin theo loại enzyme Multiple Range Tests for DAM AMIN by LOAI ENZYME -Method: 95.0 percent LSD LOAI ENZYME Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -Papain 24 2.26292 0.0100928 X Flavourzyme 24 3.16863 0.0100928 X -Contrast Difference +/- Limits -Flavourzyme - Papain *0.905708 0.0294587 -* denotes a statistically significant difference Bảng 26: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin theo hàm lượng enzyme bổ sung Multiple Range Tests for DAM AMIN by HAM LUONG ENZYME -Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 0.2 16 2.58106 0.0123611 X 16 2.725 0.0123611 X 0.6 16 2.84125 0.0123611 X -Contrast Difference +/- Limits -0.2 - 0.6 *-0.260187 0.0360794 0.2 - *-0.143937 0.0360794 0.6 - *0.11625 0.0360794 -* denotes a statistically significant difference Bảng 27: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin theo thời gian thủy phân Multiple Range Tests for DAM AMIN by THOI GIAN -Method: 95.0 percent LSD THOI GIAN Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -12 12 1.65708 0.0142733 X 24 12 2.86708 0.0142733 X 48 12 3.09333 0.0142733 X 36 12 3.24558 0.0142733 X -Contrast Difference +/- Limits -12 - 24 *-1.21 0.0416609 12 - 36 *-1.5885 0.0416609 12 - 48 *-1.43625 0.0416609 24 - 36 *-0.3785 0.0416609 24 - 48 *-0.22625 0.0416609 36 - 48 *0.15225 0.0416609 - denotes a statistically significant difference Bảng 28: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin theo thời điểm bổ sung nấm men Multiple Range Tests for Dam_amin by Thoi_diem_bs_nm -Method: 95.0 percent LSD Thoi_diem_bs_nmCount Mean Homogeneous Groups -0 14.5275 X 36 15.0947 X 36 15.8869 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *-1.35944 0.485182 - *-0.567222 0.485182 - *0.792222 0.292576 -* denotes a statistically significant difference Bảng 29: Kết phân tích phương sai ảnh hưởng nhân tố mật số tế bào nấm men, thời điểm bổ sung nấm men thời gian thủy phân đến hàm lượng đạm amin Analysis of Variance for Dam_amin - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Mat_so 0.144858 0.0724292 0.80 0.4540 B:Thoi_diem_bs_nm 11.2971 11.2971 125.21 0.0000 C:Thoi_gian 22.4143 7.47142 82.81 0.0000 INTERACTIONS AB AC BC ABC 0.125086 0.221386 2.30574 0.303247 6 0.0625431 0.0368977 0.768581 0.0505412 0.69 0.41 8.52 0.56 0.5049 0.8695 0.0001 0.7597 RESIDUAL 4.33067 48 0.0902222 -TOTAL (CORRECTED) 41.1423 71 -All F-ratios are based on the residual mean square error bảng 30: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin theo thời gian lên men Multiple Range Tests for Dam_amin by Thoi_gian -Method: 95.0 percent LSD Thoi_gian Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -7 18 14.6594 0.0707979 X 14 18 15.3056 0.0707979 X 28 18 15.9611 0.0707979 X 21 18 16.0372 0.0707979 X -Contrast Difference +/- Limits -7 - 14 *-0.646111 0.201312 - 21 *-1.37778 0.201312 - 28 *-1.30167 0.201312 14 - 21 *-0.731667 0.201312 14 - 28 *-0.655556 0.201312 21 - 28 0.0761111 0.201312 -* denotes a statistically significant difference Bảng 31: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin tỉ lệ chủng nấm men Multiple Range Tests for Dam_amin by Mat_so -Method: 95.0 percent LSD Mat_so Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -4 24 15.4338 0.0613128 X 24 15.4954 0.0613128 X 24 15.5433 0.0613128 X -Contrast Difference +/- Limits -2 - 0.0616667 0.174341 - -0.0479167 0.174341 - -0.109583 0.174341 -* denotes a statistically significant difference Bảng 32: Kết phân tích phương sai ảnh hưởng nhân tố mật số tế bào nấm men, thời điểm bổ sung nấm men thời gian thủy phân đến cảm quan mùi Analysis of Variance for Cam_quan_mui - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Mat_so 0.0277778 0.0138889 0.06 0.9395 B:Thoi_diem_bs_nm 2.72222 2.72222 12.25 0.0010 C:Thoi_gian 36.9444 12.3148 55.42 0.0000 INTERACTIONS AB AC BC ABC 0.0277778 1.30556 0.944444 0.638889 6 0.0138889 0.217593 0.314815 0.106481 0.06 0.98 1.42 0.48 0.9395 0.4497 0.2494 0.8205 RESIDUAL 10.6667 48 0.222222 -TOTAL (CORRECTED) 53.2778 71 -All F-ratios are based on the residual mean square error Bảng 33: Kiểm định LSD 95% cảm quan mùi thời điểm bổ sung nấm men Multiple Range Tests for Cam_quan_mui by Thoi_diem_bs_nm -Method: 95.0 percent LSD Thoi_diem_bs_nmCount LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -7 36 3.11111 0.0785674 X 36 3.5 0.0785674 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - *0.388889 0.223404 -* denotes a statistically significant difference Bảng 34: Kiểm định LSD 95% cảm quan mùi thời gian thủy phân Multiple Range Tests for Cam_quan_mui by Thoi_gian -Method: 95.0 percent LSD Thoi_gian Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -7 18 2.11111 0.111111 X 14 18 3.38889 0.111111 X 28 18 3.83333 0.111111 X 21 18 3.88889 0.111111 X -Contrast Difference +/- Limits -7 - 14 *-1.27778 0.315941 - 21 *-1.77778 0.315941 - 28 *-1.72222 0.315941 14 - 21 *-0.5 0.315941 14 - 28 *-0.444444 0.315941 21 - 28 0.0555556 0.315941 -* denotes a statistically significant difference Bảng 35: Kiểm định LSD 95% cảm quan mùi tỉ lệ chủng nấm men Multiple Range Tests for Cam_quan_mui by Mat_so -Method: 95.0 percent LSD Mat_so Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -4 24 3.29167 0.102062 X 24 3.33333 0.102062 X 24 3.5 0.102062 X -Contrast Difference +/- Limits -2 - 0.208333 0.290211 - 0.166667 0.290211 - -0.0416667 0.290211 -* denotes a statistically significant difference Bảng 36: Kết phân tích phương sai ảnh hưởng nhân tố mật số tế bào nấm men, thời điểm bổ sung nấm men thời gian đếm mật số Analysis of Variance for Mat_so_tbnm - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Mat_so 17.1615 8.58074 1.30 0.2850 B:Thoi_diem_bs_nm 5.47852 5.47852 0.83 0.3683 C:Thoi_gian 24.1937 12.0969 1.83 0.1745 INTERACTIONS AB AC BC ABC 23.1526 37.5685 16.6626 7.91296 4 11.5763 9.39213 8.3313 1.97824 1.75 1.42 1.26 0.30 0.1875 0.2461 0.2952 0.8762 RESIDUAL 237.58 36 6.59944 -TOTAL (CORRECTED) 369.71 53 -All F-ratios are based on the residual mean square error Bảng 37: Kiểm định LSD 95% mật số nâm men thơi gian thủy phân Multiple Range Tests for Mat_so_tbnm by Thoi_gian -Method: 95.0 percent LSD Thoi_gian Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -21 18 2.83889 0.605505 X 28 18 4.02778 0.605505 X 14 18 4.41111 0.605505 X -Contrast Difference +/- Limits -14 - 21 1.57222 1.73669 14 - 28 0.383333 1.73669 21 - 28 -1.18889 1.73669 Bảng 38: Kiểm định LSD 95% mật số nấm men thời điểm bổ sung nấm men Multiple Range Tests for Mat_so_tbnm by Thoi_diem_bs_nm -Method: 95.0 percent LSD Thoi_diem_bs_nmCount LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -7 27 3.44074 0.494392 X 27 4.07778 0.494392 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - 0.637037 1.418 Bảng 39: Kiểm định LSD 95% mật số nấm men tỉ lệ chủng nấm men Multiple Range Tests for Mat_so_tbnm by Mat_so -Method: 95.0 percent LSD Mat_so Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 18 2.98889 0.605505 X 18 3.96667 0.605505 X 18 4.32222 0.605505 X -Contrast Difference +/- Limits -2 - -0.355556 1.73669 - 0.977778 1.73669 - 1.33333 1.73669 ... hàm lượng đạm qui trình sản xuất cải tiến đề tài với qui trình sản xuất Nhật (bảng 23) ta thấy hàm lượng đạm sản phẩm MiSo qui trình sản xuất cải tiến cao so với MiSo Nhật; sản phẩm Miso đề tài... phương thức rút ngắn thời gian sản xuất, tạo sản phẩm phù hợp với sản xuất nước nên đề tài ? ?ứng dụng nấm sợi enzyme protease để cải tiến qui trình sản xuất tương MiSo? ?? thực Chuyên ngành Công nghệ... xuất, tạo sản phẩm phù hợp với sản xuất nước nên đề tài ? ?ứng dụng nấm sợi enzyme protease để cải tiến qui trình sản xuất tương MiSo? ?? tiến hành Qua kết nghiên cứu, số kết rút sau: - Sử dụng tỷ lệ