Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV 1 tại việt nam luận án TS sinh học62 42 30 15

ĐẠI HỌC QUÔC GIA HÀ NÔI TRƯỜNG ĐAI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN •••• Nguyễn Thị Hồng Loan NHÂN DỊNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human immunodeíiciency virus HIV) nguyên nhân gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người (AIDS) số virus gây bệnh nghiêm trọng HIV biến đổi liên tục cấu trúc hệ gen để kháng lại thuốc điều trị gây tỷ lệ tử vong cao Kể từ xuất (từ năm 1981) đến có khoảng 60 triệu người hành tinh bị nhiễm HIV, có khoảng 25 triệu người chết bệnh có liên quan đến AIDS AIDS trở thành bệnh gây chết nhiều người lịch sử loài người (UNAIDS, 2010) Theo tài liệu công bố, có hai type HIV gây nên AIDS HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), HIV-1 nguyên nhân gây AIDS người tồn giới Trong chu trình sống HIV-1, enzyme reverse transriptase, integrase protease có vai trị quan trọng khơng thể thiếu chép, đóng gói hình thành virus hồn chỉnh Vì vậy, chất ức chế enzyme nghiên cứu, sản xuất để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS điều trị gọi liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (antiretroviral drug therapy, gọi tắt ART) Trong số enzyme nói trên, protease mã hóa gen pol virus có chức cắt chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) vị trí định để tạo thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus hoàn chỉnh Nếu protease bị hoạt tính, HIV-1 khơng đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh (Darke tập thể, 1989) Tuy nhiên, tốc độ sinh sản nhanh HIV - 1, có khoảng 10 triệu hạt virus tạo ngày tỷ lệ sai sót cao enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến bệnh nhân nhiễm bệnh chí chưa điều trị Khi có ART, chủng mang đột biến kháng thuốc chọn lọc trở thành chủng ưu (Hoffmann tập thể, 2007) Mặc dầu, ngày có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV phát triển thương mại hóa chưa tìm chất ức chế thực có hiệu Vì vậy, việc sản xuất tinh để thu lượng lớnprotease HIV-1 cho nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế hiệu cần thiết Hiện nay, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 (đuợc gọi tắt protease HIV-1) nhung thực tế cho thấy protease HIV-1 không dễ dàng đuợc biểu tế bào vật chủ đặc tính gây độc tế bào, khó tan; luợng protease thu đuợc sau biểu thuờng thấp, số truờng hợp phát đuợc phuơng pháp miễn dịch với quy trình biểu hiện, tinh gồm nhiều buớc phức tạp Mặt khác, nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 phân lập từ phân nhóm B phân nhóm HIV phổ biến gây bệnh Mỹ, Australia nuớc Tây Âu Trong khi, phần lớn truờng hợp nhiễm HIV-1 giới Việt Nam không thuộc phân nhóm B Những nghiên cứu gần cho thấy khác cấu trúc protease phân nhóm B so với phân nhóm khác dẫn đến hiệu điều trị thuốc ức chế protease (PI) mức độ kháng thuốc khác Chính vậy, thiết lập hệ thống biểu tinh protease HIV-1 tái tổ hợp hiệu đại diện cho phân nhóm HIV-1 gây bệnh chủ yếu Việt Nam có vai trị quan trọng việc nâng cao hiệu điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Bên cạnh đó, đột biến kháng PI tuơng đối đặc hiệu cho loại thuốc riêng biệt, thay loại thuốc khác truớc có tích lũy đột biến phác đồ sau thành cơng (Hoffmann tập thể, 2007) Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thuờng theo huớng phát đột biến gen mã hóa protease HIV-1 có vai trị quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS Ở Việt Nam, protease HIV-1 từ bệnh nhân Việt Nam vấn đề cịn đuợc nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu nguời Việt Nam tìm số đột biến liên quan kháng thuốc Đặc biệt, chua có nghiên cứu biểu protease HIV-1 phân lập từ bệnh nhân nguời Việt Nam Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Nhân dòng, biểu nghiên cứu số tính chất protease từ HIV-1 Việt Nam” để tạo chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp sử dụng cho mục đích sàng lọc pháttriển chất ức chế nhân lên HIV, bước làm sở phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Phát số đột biến gen mã hóa protease HIV-1 người Việt Nam - Thiết lập quy trình hiệu cho việc biểu gen mã hóa protease HIV-1 vi khuẩn E coli tinh protease HIV-1 tái tổ hợp dạng có hoạt tính - Nghiên cứu số tính chất protease HIV-1 tìm hiểu tác dụng số chất ức chế làm sở để tìm kiếm phát triển PI ứng dụng điều trị HIV/AIDS Đối tượng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 từ huyết bệnh nhân nhiễm HIV-1 Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Nội dung nghiên cứu đề tài: - Tinh RNA HIV-1 tổng hợp cDNA số mẫu HIV-1 từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 Việt Nam - Nhân bản, nhân dịng đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 mẫu virus phân lập được, đánh giá sai khác trình tự gen mã hóa protease HIV1 đối tượng bệnh nhân nhiễm HIV-1 so với trình tự gen tương ứng giới - Thiết kế hệ thống vector xác định điều kiện biểu gen mã hóa cho protease HIV-1 E coli - Xây dựng quy trình tinh protease HIV-1 tái tổ hợp - Nghiên cứu số đặc trưng xúc tác protease HIV-1 tái tổ hợp thu - Tìm hiểu tác dụng ức chế số hợp chất tổng hợp tự nhiên lên protease HIV-1 tái tổ hợp Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu luận án thực chủ yếu Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Đóng góp đề tài - Cơng trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân dịng biểu E coli gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp thuộc chủng CRF01_AE Việt Nam; thiết lập đuợc phuơng pháp đơn giản để tinh protease HIV1 với hiệu suất thu nhận enzyme cao so với nghiên cứu giới - Là cơng trình phát thấy tác dụng ức chế protease HIV-1 axit asiatic, 8-hydroxyquinoline menadione Ứng dụng thực tiễn đề tài - Cách thức biểu gen mã hóa protease HIV-1 tinh protease tái tổ hợp tạo cơng trình nghiên cứu dễ dàng đuợc áp dụng để sản xuất số protease tái tổ hợp khó tan đặc hiệu với số chất định - Chế phẩm protease HIV-1 tạo sở cho việc tìm kiếm phát triển PI để ứng dụng điều trị bệnh nhân HIV/AIDS CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1 1.1.1 HIV-1 nguyên nhân AIDS Virus gây suy giảm miễn dịch nguời (HIV) lần đuợc Montagnier tập thể Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 với tên gọi ban đầu virus liên quan tới viêm hạch (LAV) Năm 1986, virus đuợc Ủy ban Quốc tế thống gọi tên HIV (Greene, 2007) Cùng thời điểm nguời ta phân lập đuợc virus Tây Phi đặt tên HIV-type 2, virus gốc HIV-type Hai loại virus làm suy giảm hệ thống miễn dịch nguời đặt tên chung HIV Mặc dù HIV-type có số điểm giống với HIV-type nhu cách thứctruyền bệnh, hình thức nhiễm bệnh hội phương pháp điều trị người nhiễm HlV-type phát sinh bệnh so với nhiễm HlV-type HlV-type thấy chủ yếu vùng Châu Phi (Hoffmann tập thể, 2007) Vì vậy, HIVtype (HIV-1) xem nguyên nhân gây nên bệnh AIDS HIV thuộc họ retrovirus, họ gây ung thư cho người động vật HIV-1 có nhóm M (main), N (new), O (outlier) Có tới 90% lây nhiễm HIV tồn giới thuộc nhóm M; nhóm có phân type ký hiệu chữ A-D, F-H, J, K nhiều dạng tái tổ hợp khác gọi tắt phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) Sự khác phân nhóm với phân nhóm khác trình tự axit amin protein vỏ vượt 30% Phân nhóm B phổ biến Mỹ, Tây Âu Australia; phân nhóm khơng phải nhóm B lại phân bố nước phát triển châu Á châu Phi, nơi mà phần lớn người bị nhiễm sinh sống Sự đa dạng virus thấy vùng Sahara (châu Phi) Ở Việt Nam nước Đơng Nam Á phân nhóm HIV-1 phân lập từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh số phân nhóm B, C dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen tập thể, 2003; Ishizaki tập thể, 2009; Phan tập thể, 2010) Phần lớn việc nghiên cứu để tìm thuốc điều trị bệnh HIV gây nên dựa phân nhóm B Tuy nhiên gần đây, đa dạng trình tự axit amin phân nhóm xem hướng nghiên cứu quan trọng đường kháng thuốc PI (Bandaranayake tập thể, 2008) 1.1.2 Tình hình nhiễm HIV-1 Đại dịch HIV/AIDS thách thức to lớn tiến trình phát triển xã hội Sau thập kỷ phát mà nước phát triển, HIV/AIDS lan rộng toàn giới, đặc biệt khu vực châu Phi nước châu Á Đến chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị đặc hiệu Theo chương trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2010), đến cuối năm 2008 số người nhiễm HIV/AIDS sống giới tăng 20% so với năm 2000 tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS ước tính cao gấp lần năm 1990 Số liệu tính đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu người mang cănbệnh HIV/AIDS, số đối tượng nhiễm 2,6 triệu người có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân chết AIDS năm 2009 Ở Việt Nam, trường hợp nhiễm HIV-1 phát đầu năm 1990; năm 2000 đến 2007, số người nhiễm tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 người năm có khoảng 40.000 người nhiễm Tính đến ngày 30/9/2010 nước có 180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS Thành phố Hồ Chí Minh địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao với 23% tổng số bệnh nhân nước (Liao tập thể, 2009; UNAIDS, Vietnam) Theo đánh giá chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm đại dịch HIV/AIDS giai đoạn tập trung - xảy chủ yếu nhóm có hành vi nguy cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy mại dâm Theo phân tích chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV sống tiếp tục gia tăng hệ hai tác động chủ yếu: Số người nhiễm HIV hàng năm toàn cầu cao kết tích cực liệu pháp điều trị kháng virus làm giảm số người tử vong, kéo dài sống cho người bệnh 1.1.3 Sinh bệnh học nhiễm HIV-1 ì.1.3.1 Cấu trúc hình thể HIV-1 Trên kính hiển vi điện tử, HIV-1 HIV-2 có cấu trúc gần giống hồn toàn Chúng khác khối lượng protein gen phụ trợ Cả HIV-1 HIV-2 nhân tế bào lympho CD4 gây bệnh người, mức độ suy giảm miễn dịch HIV-2 gây (Hoffmann tập thể, 2007) HIV-1 có kích thước khoảng 120 nm, dạng cầu (hình 1.1) Vỏ ngồi virus lớp lipid kép với nhiều protein gắn vào nhơ lên ký Env Protein Env có phần chỏm tạo thành từ phân tử glycoprotein có khối lượng phân tử 120 kDa 10 MỤC LỤC Trang PHỤ LỤC DANH M v C BẢNG Trang Bảng 1.1 Trình tự vị trí cắt protease HIV-1 protein gag gag-pol 22 Bảng 1.2 Các đột biến gen mã hóa protease HIV-1 liên quan đến kháng thuốc PI 35 Bảng 2.1 Thành phần gel cô gel tách acrylamide SDS-PAGE 54 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang DANH MỤC CÁC KY HIỆU VÁ CHỮ VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome) APS Ammonium Persulphate ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (Antiretroviral drug therapy) □ -ME □ -mercaptoethanol bp Cặp bazơ (base pair) BSA Protein huyết bò (Bovine Serum Albumin) CRF Dạng tái tổ hợp lưu hành (circulating recombinant form) CBB Coomassie Brilliant Blue CDC Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa dịch bệnh (Mỹ) (The Center for Disease Control and Prevention) DABCYL 4- (4-Dimethylaminophenylazo) Benzoic Acid Đệm A Tris HCl 20 mM pH 7,9, NaCl 100 mM, PMSF mM, imidazol 5mM Đệm B Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 100 mM, Triton X-100 1% Đệm C Tris-HCl 20 mM pH 7,9 NaCl 100 mM, urea 8M, imidazol mM Đệm D Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 50 mM, DTT mM, p-ME mM, glycerol 5% dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate ddH2Ơ Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O) DTT Dithiothreitol EDANS 5- [(2-Aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FDA Cục Quản lý thực phẩm thuốc (Mỹ) (Food and Drug Administration) HAART Liệu pháp kháng retrovirus hiệu lực cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus) IPTG Isopropỵl-0-D-Thĩogalactopỵranoside kb Kilobase kDa Kilodalton KLPT Khối lượng phân tử LB MCS MES MOPS NNRTI Luria Bertani Trình tự nhân dịng đa điểm cắt (Multiple Cloning Sequence) 2-(V-morpliolino) ethanesulfonic acid 3-(N-orpholino) propanesulfonic acid Các chất ức chế reverse transcriptase nucleoside NRTI (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) Các chất ức chế reverse transcriptase dạng nucleoside (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) OD PAGE Mật độ quang học (Optical Densitỵ) Điện di gel polỵacrỵlamide (Polỵacrỵlamide Gel Electrophoresis) PBS Đệm phosphate có muối (Phosphate buffered saline) PCR Phản ứng chuỗi polỵmerase (Polỵmerase Chain Reaction) PI Chất ức chế protease (Protease inhibitor) PMSF Phenỵl Methỵlsulphonỵl Fluoride PVDF Polỵvinỵlidere Fluoride SDS Sodium Dodecỵlsulphate TEMED N, N, N’,N’- Tetramethỵl-Ethỵlenediamine X-gal UNAIDS 5-Bromo-4 chloro-3-indolỵl-P-D galactopỵranoside Chương trình HIV/AIDScủa Liên hợp quốc (United Nations Program on HIV/AIDS) 7 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trinh nghiên u cua riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chứà đứợc công bố cơng trình khác NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Thị Hồng Loan LỜI CẢM ƠN Lỏfị đau tiên , cho phép bay tỏ long biết ơn sâu sắc nhai tơi PGS TS Phan Tuân Nghĩa ; thây tân tĩnh hương dẫn , giúp đỡ , tạo điêu kiên thuân lợi nhât cho suôt quái trĩnh làm thực nghiêm va viết luân ám Ngươi thây dìu dắt vát bơi dương cho đực tĩnh cần thi^t môt lam công tác nghiên cưu khoa học tư ngáy đâ u làm quen với khoa học Tôi xin bay to long cam ơn tơi TS Nguyễn Thi Vân Anh đa chĩ dân giúp đỡ quái trĩnh thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn sư giup tân tĩnh vát tao điêu kiên vê thơi gian Ba n Chu nhiêm Khoa Sinh hoc vát PGS TS Bùi Phương Thuận thây, cô giáo, anh chị, bạn bè đồng nghiệp Bộ mơn Sinh lỷ thực vật Hóa sinh Khoa Sinh học thành viên nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái to hơp, Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein , Trương Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên Tôi xin gửi lơi cam ơn tơi: Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học Phòng chức nắng Trương Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên đa tao đ iêu kiên hoan thủ tục cần thiết c nghiên cứu sinh, Đề tài KLEPT.09.01 hỗ trợ tồn kinh phí để thực luân ám; Bênh viên Bênh Nhiêt đơi Trung ương đá cung câp mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HIV ; Trung tâm Khoa hoc Vât liêu, Trương Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên đá cho phép va giup sư dụng thống máy quang phổ huynh quang Tôi xin bay to long biên ơn tơi ậc bô, mẹ; chông con, gia đĩnh va ban bè’ đa giúp đỡ, đơng viên, dành tình cảm điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án NCS Nguyễn Thị Hồng Loan PHỤ LỤC ii Danh sách bệnh nhân nhiễm HIV STT Tên bệnh nhân Đỗ Ngọc C lấy mẫu cho nghiên cứu luận án Năm sinh 1982 Ký hiệu mẫu BN1 ART Phạm Thị T 1978 BN2 Nguyễn Thị H 1980 BN3 Vũ Hồng C 1985 BN4 Nguyễn Văn T 1976 BN5 Hoàng Thị G 1984 BN6 Trần Quốc T 1975 BN7 Lê Bạch D 1985 BN8 Nguyễn Tiến D 1978 BN9 10 Trần Thu H 1977 BN10 11 Bùi Bích V 1980 BN11 12 Luu Thu H 1981 BN12 13 Đồng Thanh H 1983 BN13 14 Nguyễn Hồng H 1982 BN14 15 Bùi Quang T 1974 BN15 16 Lại Thị T 1985 BN16 17 Trần Lê H 1979 BN17 STT 18 Tên bệnh nhân Nguyễn Tùng N Năm sinh 1967 Ký hiệu mẫu BN18 ART 19 Trần Hải S 1970 BN19 20 Hoàng Bình P 1974 BN20 21 Nguyễn Ngọc A 1944 BN1* PI 22 Nguyễn Hà T 1967 BN2* PI 23 Quách Thành L 1978 BN3* PI 24 Nguyễn Xuân T 1976 BN4* PI 25 Nguyễn Thị Minh N 1976 BN5* PI 26 Phạm Thị B 1973 BN6* PI 27 Nguyễn Văn T 1982 BN7* PI 28 Nguyễn Xuân D 1982 BN8* PI 29 Nguyễn Thị T 1979 BN9* PI 30 Tạ Thành L 1978 BN10* PI 31 Nguyễn Quyết T 1979 BN11* PI 32 Lê Đình T 1971 BN12* PI 33 Trần Thị H 1974 BN13* PI 34 Nguyễn Thị L 1975 BN14* PI 35 Nguyễn Thị D 1974 BN15* PI 36 Phan Hà S 1973 BN16* PI 37 Nguyễn Thị T 1977 BN17* PI STT 38 Tên bệnh nhân Nguyễn Anh T Năm sinh 1971 Ký hiệu mẫu BN18* ART PI 39 Nguyễn Thị G 1982 BN19* PI 40 Trần Minh S 1972 BN20* PI 41 Phạm Minh D 1961 BN21* PI 42 Nguyễn Văn B 1977 BN22* PI 43 Trần Văn T 1969 BN23* PI 44 Hoàng Thị H 1969 BN24* PI 45 Phùng Văn H 1978 BN25* PI 46 Lê Bá T 1967 BN26* PI 47 Trần Anh T 1977 BN27* PI 48 Hoàng Thị N 1978 BN28* PI 49 Trung Việt T 1977 BN29* PI 50 Nguyễn Hữu Đ 1974 BN30* PI Ghi chú: Bệnh nhân điều trị PI PHỤ LỤC Kết đo A260 nm A280 nm, đánh giá số A260/280 định lượng RNA sau tinh từ huyết bệnh nhân nhiễm HIV-1 A26 A280 A260A280 Hàm lọng ligpl 0,09 0,078 1,21 0,13 36 0,11 0,104 105 0,15 0,16 37 0,20 0,151 1,3 0,28 1,075 0,18 38 0,21 0,13 1,6 0,29 0,06 1,29 0,12 39 0,19 0,15 1,35 0,28 0,1 98 0,15 1,29 0,28 40 0,21 0,169 1,24 0,29 0,0 87 0,07 1,23 0,12 41 0,10 0,083 1,23 0,14 0,28 0,1 83 0,09 1,43 0,25 42 0,17 0,13 1,31 0,24 1,5 0,22 0,1 09 0,09 1,17 0,15 43 0,16 0,143 1,14 0,23 0,10 1,45 0,21 0,1 72 0,13 1,25 0,24 44 0,08 0,076 1,14 0,12 0,15 0,116 1,3 0,21 0,1 54 0,12 1,2 0,21 45 0,07 0,077 1,02 0,11 12 0,13 0,1 1,39 0,19 0,1 85 0,16 1,15 0,25 46 0,12 0,092 1,4 0,18 13 0,15 0,09 1,62 0,22 0,1 25 0,09 1,26 0,18 47 0,22 0,143 1,54 0,31 14 0,17 0,13 1,29 0,24 0,0 98 0,08 1,1 0,13 48 0,15 0,134 1,14 0,21 15 0,27 0,21 1,3 0,38 0,0 88 0,07 1,19 0,12 49 0,10 0,092 1,11 0,14 16 0,10 0,09 1,04 0,14 3 0,11 0,08 1,25 0,154 50 0,20 0,185 1,12 0,29 17 0,51 0,33 1,54 0,7 0,1 21 0,1 1,21 0,17 s 1,56 Hàinlnợn g |i?pl 0,28 0,13 1,45 0,29 0,18 0,21 s A26 A28 A260.A280 0,24 0,15 0,19 Hàinlitợiig s A26 A28 A260A280 Ĩ T 0,2 07 0,17 1,16 0,28 I T 35 0,22 0,11 0,10 1,09 0,16 1,61 0,5 0,11 0,09 1,22 0,14 1.5 0,25 0,1 29 0,12 0,12 0,10 1,09 0,16 2 0,0 88 0,11 0,09 1,22 0,17 0,12 0,12 1,08 0,18 0,19 0,15 1,29 0,16 0.10 10 0,15 11 T T ligpl Ghi chú: số thứ tự (STT) báng phụ lục tương ứng với sổ thứ tự tên bệnh nhân bảng phụ lục PHỤ LỤC Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 phân tích PHỤ LỤC Sơ đồ vector pET28a, pET32a pET43a PHỤ LỤC Kêt phân tích protease HIV -1 tinh hệ thống khối phổ MALDITOF-TOF Viện Khoa học Công nghệ tiên tiến Hàn Quốc (KAIST) ... HIV- 1 phân lập từ bệnh nhân nguời Việt Nam Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài ? ?Nhân dịng, biểu nghiên cứu số tính chất protease từ HIV- 1 Việt Nam? ?? để tạo chế phẩm protease HIV- 1 tái tổ hợp... trình hiệu cho việc biểu gen mã hóa protease HIV- 1 vi khuẩn E coli tinh protease HIV- 1 tái tổ hợp dạng có hoạt tính - Nghiên cứu số tính chất protease HIV- 1 tìm hiểu tác dụng số chất ức chế làm sở... gen protein HIV, chưa có cơng trình cơng bố biểu hiện, tinh nghiễn cứu tính chất protease từ HIV- 1 gây nhiễm trễn bệnh nhân Việt Nam 1. 2.6 Các đột biến kháng thuốc ức chế protease HIV- 1 Sự đời thuốc