Từ các cặn chiết của vỏ cây sổ (thu hái ở tỉnh Tuyên Quang), chúng tôi đã phân lập được 3 hợp chất: B-sitosterol 1, andehit betulinic 2 và axit betulinic 3. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định dựa vào các phương pháp phổ như IR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS,...Hợp chất 2 và 3 được đem thử hoạt tính sinh học ở điều kiện in vitro.
JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE Natural Sci., 2013, Vol 58, No 3, pp 50-54 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ CÂY SỔ (Dillenia indica Linn.) TRỒNG Ở TUYÊN QUANG Lâm Thị Hải Yến Phạm Hữu Điển Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt Từ cặn chiết vỏ sổ (thu hái tỉnh Tuyên Quang), phân lập hợp chất: β-sitosterol 1, andehit betulinic axit betulinic Cấu trúc hợp chất xác định dựa vào phương pháp phổ IR, H-NMR, 13 C-NMR, MS, Hợp chất đem thử hoạt tính sinh học điều kiện in vitro Từ khóa: Vỏ sổ (Dillenia indica Linn.), andehit betulinic, axit betulinic Mở đầu Cây sổ, tên khoa học Dillenia indica Linn., thuộc họ Sổ Dilleniaceae, mọc rải rác vùng rừng núi tỉnh phía Bắc nước ta Theo kinh nghiệm dân gian, phận sổ quả, lá, phần vỏ thân nhân dân ta sử dụng để chữa bệnh sỏi thận, sỏi bàng quang, sốt, phù thũng, đầy bụng, ho, sốt rét, cảm cúm [1-3] Một số công trình nghiên cứu giới cho thấy sổ có chứa tritecpen, flavonoit, steroit hợp chất khác Lupeol; 3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid; 3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-al; 3,5,7-trihydroxy-3’,4’-dimethoxy flavone; β-sitosterol; stigmasterol [2, 4, 6] Là loài thuốc quý, sổ chưa nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu nhiều Bài báo trình bày kết nghiên cứu gần chúng tơi thành phần hóa học vỏ sổ trồng Tuyên Quang 2.1 Nội dung nghiên cứu Thực nghiệm * Nguyên liệu: Nguyên liệu nghiên cứu vỏ sổ (Dillenia indica Linn.) thuộc họ Sổ (Dilleniaceae) thu hái xã Thái Sơn, huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang vào tháng 10/2010 Tên TS Đỗ Hữu Thư công tác Viện Sinh thái, Tài nguyên Sinh vật Ngày nhận bài: 10/5/2013 Ngày nhận đăng: 7/6/2013 Tác giả liên lạc: Lâm Thị Hải Yến, địa e-mail: haiyen.hnue@gmail.com 50 Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ sổ (Dillenia indica Linn.) trồng Tuyên Quang (thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội) xác định giúp Vỏ sổ sau thu hái rửa sạch, phơi khơ nơi thống mát sấy 50 o C, sau xay thành bột mịn * Thiết bị: Điểm nóng chảy đo thiết bị Gallen Kamp (CHLB Đức) Phổ H-NMR (500MHz), 13 C-NMR (9125 MHz) đo máy Brucker AM500-FT-NMR (chất nội chuẩn: TMS), phổ hồng ngoại - máy Shimadzu FTIR- 8101M (ép viên với KBr), phổ khối lượng – thiết bị Engine 5989-HP Sắc kí lớp mỏng: sử dụng mỏng tráng sẵn silica gel đế nhôm (hãng Merck); phát chất đèn tử ngoại ba bước sóng 254, 302 365 nm dùng thuốc thử dung dịch axit H2 SO4 10% Sắc kí cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel (hãng Merck), cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh) Sử dụng thiết bị sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Jasco/PU2080 (Nhật) tách chất từ phân đoạn thu sau sắc kí cột Máy đông cô chân không Labconco (Mĩ) dùng để loại dung môi, làm khô chất phân lập * Chiết tách: Bột vỏ sổ (3,0 kg) đem chiết metanol nhiều lần đến nhạt màu, cất cô quay áp suất thấp, thu 289,05 gam cao tổng Chiết cao tổng hệ dung môi hữu cơ: n-hexan : nước etyl axetat : nước (tỉ lệ : 1), sau cất cô quay (dưới áp suất thấp) để thu hồi dung môi, 11,88 gam cao chiết từ n-hexan; 242,314 gam cao chiết từ etyl axetat; 44,86 gam cao metanol-nước Lấy 11,88 gam cao chiết n-hexan đem chạy sắc kí cột, hệ dung môi rửa giải n-hexan : etyl axetat (n-H:E) = từ 100 : đến 100 : 400, sau lấy chất kết tinh đem chạy sắc kí lỏng (sử dụng máy HPLC điều chế), pha thuận, hệ dung môi rửa giải E : n-H = : 5, thu chất kết tinh Lấy 10 gam cao chiết etyl axetat chạy cột sắc kí, hệ dung mơi rửa giải CHCl3 : CH3 OH = từ 100 : đến : 100, chất kết tinh (phân đoạn 10 : 1) * Nhận dạng chất: β-Sitosterol (1): Tinh thể hình kim, không màu, Rf = 0.45 (hệ dung môi n-H : E = : 1), tonc = 139 - 140 o C, tan tốt CHCl3 , axeton, metanol IR (KBr, cm−1 ): 3434 (tù, υOH ), 2939, 2869 (υCH no ), 1644, 1462 (υC=C ), 1376, 1060, 958, 803, 586 H-NMR (δ, ppm): 5,35 (1H, m, H-6), 3,53 (1H, m, H-3), 2,28 2,23 (2H, m, H-4), 0,68 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 0,92 (3H, d, J = 5.5Hz, H-21), 0,83 (3H, d, J = 7,1Hz, H-26), 0,84 (3H, d, H-27), 0.86 (3H, t, H-29); công thức phân tử C29 H50 O Andehit betulinic(2): Tinh thể hình kim, khơng màu, Rf = 0,55 (hệ dung môi n-H : E = 4:1), tonc = 216,5 o C, dễ tan dung mơi phân cực, khó tan nước FT-MS (m/z): 441,3[M+H]+ , công thức phân tử C30 H49 O2 Số liệu phổ H-NMR (CDCl3 ) 13 C-NMR (CDCl3 ) (Bảng 1) Axit betulinic (3): Tinh thể hình kim, màu trắng, tonc = 295 - 298 o C (phân hủy), dễ tan dung mơi phân cực, khó tan nước ESI-MS (m/z): 455,9 [M-H]− , công thức phân tử C30 H48 O2 IR (KBr, cm−1 ): 3467 (tù, υOH ), 1686 (υC=O ), 2943, 2869 (υCH no ), 1642, 1451 (υC=C ), 1375, 1043, 883 Dữ liệu phổ H-NMR (DMSO) 13 C-NMR (DMSO) (Bảng 1) * Thử hoạt tính sinh học: 51 Lâm Thị Hải Yến Phạm Hữu Điển Các hợp chất 2, thử hoạt tính sinh học Viện Hóa Học, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam phương pháp thử độ độc tế bào in vitro nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển diệt tế bào ung thư điều kiện in vitro 2.2 Kết thảo luận * Hợp chất 2: Phổ H-NMR có tất 48 proton bao gồm: 2H olefinic, -CH= H hiđroxyl (4,75, 4,62 4,27 ppm) vùng trường trung bình; 1H andehit (9,67 ppm) vùng trường yếu; 44 vân vùng trường mạnh (xem Bảng 1) Phổ 13 C-NMR DEPT hợp chất có 30 cacbon bao gồm nhóm CH, 11 nhóm CH2 , nhóm CH3 nguyên tử cacbon bậc bốn Vùng trường yếu có pic 206,6 149,7 ppm ứng với C andehit C-29 anken Vùng trường trung bình có pic 110,1 78,9 ppm ứng với C-20 anken C-3 gắn với nhóm hidroxyl (xem Bảng 2) Kết hợp với giá trị phổ HSQC, HMBC, COSY, NOESY so sánh với tài liệu tham khảo [7] cho phép kết luận hợp chất andehit 3β-hydroxi-lup-20(29)-en-28-al, hay gọi andehit betulinic * Hợp chất 3: Phổ H-NMR có tất 48 proton, có 1H axit cacboxylic (12,07 ppm), 1H hidroxyl (4,27 ppm), 2H olefin (4,68 4,56 ppm), 44 proton nhóm metyl, metylen, metin (Bảng 1) Phổ 13 C-NMR hợp chất có 30 pic: pic 177,7 150,8 ppm (vùng trường yếu) gán cho C-axit C-29 anken; pic 110,1 77,2 ppm (trường trung bình) gán cho C-20 anken C-3 gắn với nhóm hidroxyl; 26 pic cịn lại quy kết Bảng Kết hợp với giá trị phổ HSQC so sánh với tài liệu tham khảo [5, 8] cho phép kết luận hợp chất axit 3β-hydroxi-lup-20(29)-en-28-oic, hay gọi axit betulinic 52 Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ sổ (Dillenia indica Linn.) trồng Tuyên Quang Bảng Các giá trị phổ H-NMR, 13 C-NMR hợp chất 2, H-NMR 13 C-NMR 38,75 27,40 3,18 dd 2,96 1H m 78,9 38,85 55,34 18,27 34,35 40,85 2,96 1H m 50,49 37,19 20,76 25,56 38,71 42,57 29,27 28,81 59,31 48,09 2,86 m 2,98 1H m 47,53 149,70 29,88 33,23 0,96 s 0,86 3H s 27,98 0,75 s 0,86 3H s 15,34 0,81 s 0,76 3H s 15,91 0,97 s 0,64 3H s 16,13 0,91 s 0,93 3H s 14,27 9,68 s 206,63 4,76 4,63 br s 4,68 4,56 br s 110,14 1,69 s 1,64 3H s 19,00 Stt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 38,76 27,65 77,28 38,99 55,39 18,45 34,42 40,76 50,43 36,82 20,95 25,59 38,10 42,50 29,69 32,20 55,91 49,05 47,11 150,81 30,61 37,23 28,59 16,23 16,28 16,43 14,88 177,70 110,10 19,44 * Hoạt tính sinh học: Hợp chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu mô (tế bào KB) mức độ yếu trung bình, hợp chất khơng độc tế bào ung thư biểu mô Stt Bảng Kết thử hoạt tính độc tế bào hợp chất Kết quả: Giá trị IC50 (µg/mL) Tên mẫu mẫu thử dịng tế bào KB Hợp chất >128 Hợp chất 69,15 Ellipticin (chất tham khảo) 0,51 53 Lâm Thị Hải Yến Phạm Hữu Điển Kết luận Từ cao chiết metanol vỏ sổ Dillenia indica Linn (thu hái Tuyên Quang, tháng 10/2010) phân lập xác định cấu trúc hợp chất Đó chất: β-sitosterol 1, andehit betulinic axit betulinic Trong hợp chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu mô mức độ yếu trung bình TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi, 1999 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nxb Y học Hà Nội, tr 395 [2] Viện Dược Liệu Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam Nxb Khoa học Kỹ thuật, tập II, tr 747-749 [3] Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Trường Đại học Quốc gia, 2003 Danh lục lồi thực vật Việt Nam, Nxb Nơng nghiệp, tập 2, tr 322-325 [4] Alberto A.Gurni, Wilfried A.Konig and Klaus Kubitzki, 1981 Flavonoid glycosides and sulphates from the Dilleniaceae Phytochemistry, Vol 20, No 5, pp 1057-1059 [5] Barbosa - Filho J.M et al., 2004 Φyton, pp 221-224 [6] E.C Bate – Smith Animal Physiology Institute, A.R.C, Babraham, Cambridge and J.B Harborne, 1971 Differences in flavonoid content between fresh and herbarium leaf tissue in Dillenia Phytochemistry, Vol 10, pp 1055-1058 [7] Monaco P., Previreta L., 1984 J Nat.Prod., Vol 47, No 2, pp 673-680 [8] Most.Nazma Parvin et al, 2009 Bangladesh J.harmcol, No., pp 122-125 ABSTRACT The chemical instituents of stem bark (Dillenia indica Linn.) collected in Tuyen Quang From the methanol extracted from powdered stem bark of Dillenia indica Linn (collected in Tuyen Quang province) were isolated three compounds: β-sitosterol 1, betulin aldehyde and betulinic acid Their structures were elucidated using the IR, H-NMR, 13 C-NMR and MS spectral methods The biological activity of two compounds (2 and 3) was identified in in vitro condition 54 .. .Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ sổ (Dillenia indica Linn.) trồng Tuyên Quang (thuộc Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, số 18 Hồng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội) xác định giúp Vỏ sổ sau... 3β-hydroxi-lup-20(29)-en-28-oic, hay gọi axit betulinic 52 Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ sổ (Dillenia indica Linn.) trồng Tuyên Quang Bảng Các giá trị phổ H-NMR, 13 C-NMR hợp chất 2, H-NMR... instituents of stem bark (Dillenia indica Linn.) collected in Tuyen Quang From the methanol extracted from powdered stem bark of Dillenia indica Linn (collected in Tuyen Quang province) were isolated