Nghiên Cứu Thủy Phân Protein Bánh Dầu Đậu Nành Thành Đạm Hòa Tan Bằng Nấm Mốc Aspergillus Oryzae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HOC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN BÁNH DẦU ĐẬU NÀNH THÀNH ĐẠM HÒA TAN BẰNG NẤM MỐC Aspergillus oryzae, KẾT HỢP ENZYME PAPAIN VÀ VI KHUẨN Bacillus subtilis CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS LÊ THANH HÙNG NGUYỄN THANH PHƯƠNG MSSV: 3064409 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 06 năm 2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Nguyễn Thanh Phương Lê Thanh Hùng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) CẢM TẠ Con xin cảm ơn cha mẹ hết lịng ni dạy, chăm sóc tạo điều kiện cho học tập đến nơi đến chốn Em xin chân thành cảm tạ biết ơn sâu sắc: Thầy Lê Thanh Hùng tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm nghiên cứu, kiến thức khoa học tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Chân thành cảm ơn cô cố vấn học tập Trần Thị Xuân Mai động viên giúp đỡ em trình học tập thực luận văn Quý thầy cô Viện Nghiên cứu phát triển Công Nghệ Sinh Học truyền đạt kiến thức giúp đỡ em suốt bốn năm đại học Cám ơn thầy Phương, thầy Song Toàn, chị Dung, anh Quệ, anh Phong, anh Thạnh, chị Giang tận tình giúp đỡ, dẫn em q trình thực đề tài Ln nhớ cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K32 chia sẻ, động viên giúp đỡ trình học lớp Sinh viên thực Nguyễn Thanh Phuơng TÓM TẮT Dịch đạm acid amin sản phẩm trung gian trình sản xuất nước tương, có phương pháp cơng nghệ thường sử dụng: cơng nghệ vi sinh, cơng nghệ hóa học cơng nghệ enzyme Tuy nhiên phương pháp cịn tồn số nhược điểm như: phương pháp hóa học gây ô nhiễm môi trường tạo độc tố khơng an tồn cho người sử dụng , phương pháp vi sinh thời gian kéo dài phương pháp enzim chi phí lại cao Do đó, tiến hành thủy phân protein bánh dầu đậu nành thành dịch đạm amin có hàm lượng đạm acid amin cao an toàn cho người tiêu dùng đồng thời rút ngắn thời gian sản xuất Bánh dầu đậu nành lên mốc với tỷ lệ 0,2% nấm mốc Aspergillus oryzae Tiếp tục, thủy phân bánh dầu 1,2% enzyme papain pH= 6,5, nhiệt độ 600C 2% vi khuẩn Bacillus subtilis hàm lượng muối 20% , pH 6,5, nhiệt độ 50 0C thu dung dịch có hàm lượng đạm tổng số cao 15,18mg/ml vào ngày thứ 20, hàm lượng đạm amin cao 13,59mg/ml vào ngày thứ 15 hàm lượng đạm amoniac thấp 0,93mg/ml ngày thứ 20 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sau trình phân giải đại phân tử protein làm chúng biến thành acid amin hấp thu vào thể qua đường tiêu hóa tác dụng dịch tiêu hóa Người ta tìm 20 loại acid amin khác nhau, có loại acid amin mà thể tự tổng hợp Các acid amin tham dự vào nhiều q trình chuyển hóa thể tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh, đổi sợi bắp nhu cầu cho thể đáp ứng đủ, thừa thiếu gây nên bất lợi cho thể Hiện cần phải đẩy mạnh nghiên cứu nguồn thực phẩm giàu hàm lượng protein cung cấp cho người bữa ăn hàng ngày Trong đó, chủng nấm mốc Aspergillus oryzae quan tâm sử dụng rộng rải việc sản xuất nước tương từ đậu nành chúng có hoạt tính cao khơng sinh độc tố Bên cạnh đó, vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả sản sinh enzyme protease cao dùng làm giống nuôi thùng lên men cơng nghiệp sản xuất acid amin Thêm vào đó, tác động mạnh enzyme papain đẩy nhanh trình thủy phân đậu nành cách triệt để an toàn Ngoài số loài thực vật đậu nành có hàm lượng protein cao, giá trị dinh dưỡng tương đương với thịt, chứa đầy đủ acid amin với tỷ lệ cân đối hài hịa có hệ số tiêu hóa cao Bánh dầu đậu nành sản phẩm phụ thu sau ép đậu lấy dầu công nghiệp sản xuất dầu ăn, nên sử dụng bánh dầu đậu nành làm nguyên liệu sản xuất đạm amin vừa tiết kiệm vừa giúp giảm ô nhiểm môi trường 1.2 Nội dung đề tài Áp dụng qui trình thủy phân bánh dầu đậu nành nấm mốc Aspergillus oryzae Đồng thời kết hợp enzyme papain với vi khuẩn Bacillus subtilis Tìm thơng số tốt qui trình thủy phân bánh dầu đậu nành để sản xuất dịch đạm amin giàu dinh dưỡng an toàn cho người sử dụng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Sơ lược đậu nành Đậu nành có tên khoa học Glycine max Merli Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, đậu nành màu vàng loại tốt nên trồng sử dụng nhiều Hạt đậu nành có phận: Hình Hạt đậu nành - Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt - Phôi chiếm 2% - Tử diệp chiếm 90% - Hạt đậu nành có thành phần hóa học sau: Bảng Thành phần hóa học hạt đậu nành Thành phần Tỷ lệ Protein % Dầu % Tro % Hydratcacbon % 100,0 40,0 21,0 4,9 34,0 Tử diệp 90,3 43,0 23,0 5,0 29,0 Vỏ hạt 8,0 8,8 1,0 4,3 86,0 Phôi 2,4 41,1 11,0 4,4 43,0 Hạt đậu nành nguyên Trong thành phần đậu nành, thành phần protein chiếm tỷ trọng lớn Thành phần acid amin protein đậu nành hai thành phần methionin tryptophan cịn có acid amin khác, có số lượng cao tương đương lượng acid amin có thịt Bảng 2: Thành phần acid amin protein đậu nành Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Acid amin Hàm lượng % Isoleucine 1,1 Leucine 7,7 Lysine 5,9 Methionine 1,6 Cystin 1,3 Phenylalanine 5,0 Treonine 4,3 Tryptophan 1,3 Valine 5,4 Histidine 2,6 Trong đậu nành globulin chiếm 85% – 95% Ngồi cịn có lượng nhỏ albumin, lượng không đáng kể prolamin glutein Hidrocarbon đậu nành chiếm 34% gồm loại: loại tan không tan nước Loại tan nước chiếm khoảng 10% tổng lượng hidrocarbon Bảng 3: Thành phần hidrocarbon đậu nành Hidrocarbon Hàm lượng % Cellulose 4,0 Hemixenlulose 15,4 Starch 3,8 Raffinose 1,1 Saccarose 5,0 Các loại đường khác 5,1 Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% lượng chất khơ Trong đó, đáng ý Ca, P, Mn, Zn Fe Bảng 4: Thành phần khoáng chất đậu nành Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Chất khoáng Hàm lượng % Ca 0,16 – 0,47 P 0,41 -0,82 Mn 0,22 – 0,24 Zn 37 mg/kg Fe 90 – 150 mg/kg Ngồi ra, đậu nành có nhiều vitamin khác trừ vitamin C D Đậu nành loại hạt nhiều chất dinh dưỡng Chính đậu nành nguồn thực phẩm quan trọng trồng rộng rải Trung Quốc, Mỹ, Braxin Việt Nam, đậu nành trồng nhiều tỉnh phái Bắc phía Nam Trong cơng nghiệp thực phẩm, đậu nành coi nguyên liệu quan trọng để sản xuất dầu thực vật sản xuất loại sản phẩm lên men (Nguyễn Đức Lượng, 2001) 2.1.2 Bánh dầu đậu nành Bã đậu nành sản phẩm phụ thu sau ép đậu lấy dầu công nghiệp sản xuất dầu ăn Bã đậu nành ép thành bánh gọi bánh dầu đậu nành, trước sản xuất cần nghiền nhỏ đến 2-3 mm (http://www.enviroment-safety.com) Nếu bành dầu nhỏ 1% chất béo, tách dầu dung mơi hữu Cịn ngun liệu lớn 2% chất béo, tách dầu cách ép Bên cạnh đó, thiết bị Hình Bánh dầu đậu nành sản xuất phải đạt tiêu chuẩn an toàn lao động, không gây ô nhiễm môi trường vệ sinh thực phẩm.(http://www.food.gov.uk) Bánh dầu đậu nành nguồn đạm quan tâm có hàm lượng protein cao khoảng 43 – 47%, protein chứa tất acid amin không thay Bánh dầu đậu nành ly trích có thành phần acid amin cân so với loại hạt có dầu khác Chun ngành Cơng nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 5: Hàm lượng protein thô (CP) thành phần acid béo thiết yếu bánh dầu đậu nành ly trích dung mơi hữu CP Arg Cys His Leu Lys Met Phe Thr Trp Val % % % % % % % % % % % 45,8 3,2 0,67 2,5 3,4 2,9 0,6 2,2 1,7 0,6 2,4 (Kemllem Church, 1998) Hiện bánh dầu đậu nành dùng chủ yếu làm nguồn thức ăn chăn nuôi chế biến nước chấm phục vụ cho người Với hàm lượng protein bánh dầu đậu nành cao nên bánh dầu đậu nành sử dụng làm nguồn chất để tiến hành thủy phân cho hỗn hợp đạm dễ tiêu Bảng 6: Các thành phần bánh dầu đậu nành Protein (%) Chất béo (%) Xơ (%) Tro (%) Ẩm (%) 44 12 ( Lý Thị Thùy Trang, 2006) 2.1.3 Bột mì Bột mì có thành phần hóa học sau: Bảng Thành phần hóa học bột mì Chun ngành Cơng nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Thành phần Hàm lượng (%) Nước 11,61 Gluxid 73,80 Protein 12,48 Lipid 1,78 0,48 (mg) Vitamin B1 PP 76 Ca 36 (Nguyễn Đức Lượng, 2001) 2.2 Sự thủy phân Theo Trần Bích Lam Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Miinh: Sự thủy phân protein sở phương pháp công nghệ chế biến nước tương n H2O Protein n H2O pepton xt n H2O peptide xt acid amin xt Bản chất thủy phân protein thủy phân liên kết peptide Do liên kết peptide liên kết mạnh, thủy phân xảy điều kiện có xúc tác Tác nhân xúc tác hóa học acid kiềm tác nhân xúc tác sinh học nhóm enzyme thủy phân protein có tên chung protease Trong chế biến, thủy phân protein ứng dụng để thu nhận sản phẩm thủy phân hoàn toàn thu nhận sản phẩm thủy phân chưa hoàn toàn Các sản phẩm thủy phân chưa hoàn toàn (Protein hydrolysates) hay bị đắng, thủy phân protease vi khuẩn Vị đắng liên quan đến peptid chứa acid amin kỵ nước Sản phẩm có vị đắng mức độ thủy phân đạt từ – 40% Vị đắng ảnh hưởng đến tính chất cảm quan, khơng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng.(http://www.Tuoitre.com.vn) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 1,2%; điều chỉnh nghiệm thức pH = 4,5, pH = 5,5, pH = 6,5, pH=7,5 Đun với nhiệt độ 450C, lấy mẫu phân tích tiêu đạm formol Từ đó, chọn nghiệm thức tốt cho trình thủy phân để thực cho thí nghiệm - Bố trí thí nghiệm: Nghiệm thức pH 4,5 5,5 6,5 7,5 Nhiệt độ (0C) 450C Hàm lượng enzyme (%) 1,2% Thí nghiệm gồm có nghiệm thức, với lần lặp lại: 4x3= 12 nghiệm thức  Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain theo thời gian Mục đích: Tìm giá trị nhiệt độ tốt cho trình thủy phân bánh dầu đậu - nành enzyme papain - Chuẩn bị thí nghiệm: Cân 30g bánh dầu đậu nành ủ lên mốc Aspergillus oryzae, phối trộn với dung dịch đệm theo tỉ lệ đệm : nguyên liệu Cho lượng enzyme papain vào với tỉ lệ 1,2%, điều chỉnh nghiệm thức nhiệt độ 45 oC, 55oC, 60oC, 70oC với pH tối ưu thí nghiệm Đun giờ, lấy mẫu phân tích tiêu đạm formol Từ đó, chọn nghiệm thức tốt cho trình thủy phân để thực cho thí nghiệm - Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức Nhiệt độ (0C) 45oC 55oC Dựa vào kết 60oC thí nghiệm 70oC pH Hàm lượng enzyme (%) 1,2 % Thí nghiệm gồm có nghiệm thức, với lần lặp lại: 4x3= 12 nghiệm thức Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT  Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng enzyme papain đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành theo thời gian Nghiệm thức Hàm lượng enzyme (%) 0,4% 0,8% 1,2% 1,6% - pH Nhiệt độ (0C) Dựa vào kết thí nghiệm Dựa vào kết thí nghiệm Mục đích: Tìm giá trị hàm lượng enzyme papain tốt cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành mủ đu đủ - Chuẩn bị thí nghiệm: Cân 30g bánh dầu đậu nành lên mốc Aspergillus oryzae, phối trộn với dung dịch đệm theo tỉ lệ đệm : nguyên liệu Cho lượng enzyme papain vào với tỉ lệ 0,4%, 0,8%, 1,2%, 1,6%; điều chỉnh nghiệm thức pH nhiệt độ thí nghiệm thí nghiệm Đun giờ, lấy mẫu phân tích tiêu đạm formol Từ đó, chọn nghiệm thức tốt cho trình thủy phân, để thực cho thí nghiệm - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm có nghiệm thức, với lần lặp lại: 4x3= 12 nghiệm thức  Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain - Mục đích: Tìm khoảng thời gian tốt cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain sau - Chuẩn bị thí nghiệm: Cân 30g bánh dầu đậu nành lên mốc Aspergillus oryzae, phối trộn với dung dịch đệm theo tỉ lệ đệm : nguyên liệu Cho lượng mủ đu đủ vào với theo tỉ lệ tốt thí nghiệm 3; điều chỉnh nghiệm thức nhiệt độ pH tốt thí nghiệm thí nghiệm Đun giờ, sau lấy mẫu phân tích tiêu Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT đạm formal Từ chọn nghiệm thức tốt cho q trình thủy phân, sau lấy thơng số tốt thí nghiệm 1, để thực thí nghiệm - Bố trí thí nghiệm: Nghiệm thức Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ (0C) Hàm lượng enzyme (%) Dựa vào kết thí nghiệm Dựa vào kết thí nghiệm Dựa vào kết thí nghiệm Thí nghiệm gồm có nghiệm thức, với lần lặp lại: 6x3= 18 nghiệm thức 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis Sau tìm giá trị pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme papain thời gian thích hợp cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain Chúng tiến hành, cân 50g bành dầu đậu nành lên mốc Aspergillus oryzae thủy phân enzyme papain pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme thời gian thủy phân thích hợp theo thí nghiệm 1, 2, 3, Sau bổ sung thêm 20% muối ăn nhằm hạn chế vi sinh vật gây thối cho sản phẩm tiến hành thí nghiệm với việc bổ sung tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis - Mục đích: nhằm tìm giá trị tốt cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis  Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian - Mục đích: tìm giá trị pH thích hợp cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành vi khuẩn - Chuẩn bị thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo khối hồn tồn ngẫu nhiên với nhân tố pH (p), thời gian (T), lần lặp lại + Nhân tố p có mức độ: pH1=5,5; pH2=6,5; pH3=7,5 + Nhân tố T có mức độ: ngày, ngày, 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 - Trường ĐHCT Bố trí thí nghiệm: Nghiệm thức pH 5,5 6,5 7,5 Nhiệt độ (0C) Hàm lượng VK Nhiệt độ phòng 1% + Phương pháp đánh giá: đạm amoniac, đạm amin, đạm tổng số  Mẫu chọn mẫu cho kết thích hợp  Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian - Mục đích: tìm giá trị nhiệt độ thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành vi khuẩn - Chuẩn bị thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố nhiệt độ (t), thời gian (T), lần lặp lại + Nhân tố t có mức độ: t1= nhiệt độ phòng; t2= 40 0C; t3=45 0C; t4=50 0C + Nhân tố T có mức độ: ngày, ngày, 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày Nghiệm thức Nhiệt độ Nhiệt độ phòng 400C 450C 500C pH Hàm lượng VK Dựa vào kết thí nghiệm 1% + Phương pháp đánh giá: đạm amoniac, đạm amin, đạm tổng số  Mẫu chọn mẫu cho kết thích hợp Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thành phần nguyên liệu, hoạt tính enzyme, nấm mốc vi khuẩn 4.1.1 Thí nghiệm Thành phần nguyên liệu, hoạt tính enzyme, nấm mốc vi khuẩn  Bánh dầu đậu nành Bảng 12 Thành phần nguyên liệu bánh dầu đậu nành Nitơ tổng số Protein tổng số lipid Trọng lượng khô 7,02% (±0,01) 43,88% (±0,05) 1,72% (±0,02) 89,73% (±0,13) (Các số liệu bảng kết trung bình lần lặp lại qui trọng lượng khơ) Kết phân tích cho thấy hàm lượng protein bánh dầu đậu nành cao, nên xem nguồn đạm phong phú để tiến hành thủy phân cho sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, đạm acid amin  Hoạt tính enzyme papain: 2,41TU/mg  Mật số Aspergillus oryzae: 7,3x108bào tử/ml  Mật số Bacillus subtilis: 109bào tử/ml 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme thời gian trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 4.2.1 Thí nghiệm Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain theo thời gian Từ kết bảng 13, cho thấy pH= 6,5 khả thủy phân enzyme papain cao cho giá trị đạm formol cao Điều này, phù hợp với nghiên cứu (Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005) enzyme papain hoạt động tốt pH từ 6-7 Như pH= 6,5 thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain Bảng 13 Hàm lượng đạm formol dịch thủy phân sau tác động pH Hàm lượng đạm formol (mg/ml) giờ Hàm lượng đạm formol (mg/ml) sinh 4,5 3,83 c 4,62c 0,79c 5,5 3,38d 4,24d 0,86d 6,5 4,18a 5,43a 1,25a 7,5 4,06b 4,91b 0,85b pH Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95% 4.2.2 Thí nghiệm Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain theo thời gian Tốc độ phản ứng tăng theo nhiệt độ, đến mức độ tốc độ phản ứng giảm xuống enzyme bị biến tính Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến trình thủy phân enzyme Từ kết bảng 14, cho thấy đạm formol đạt giá trị cao nhiệt độ 600C, enzyme papain cho hiệu suất thủy phân chất bánh dầu đậu nành tốt Điều này, phù hợp với nghiên cứu (Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005) enzyme papain hoạt động tốt nhiệt độ 45 0C-650C So với nhiệt độ 450C, 550C 70 0C enzyme papain hoạt động mạnh nhiệt độ 600C cho giá trị đạm formol cao Như vậy, nhiệt độ 600C thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 14 Hàm lượng đạm formol dịch thủy phân sau tác động nhiệt độ Hàm lượng đạm formol (mg/ml) Nhiệt độ Hàm lượng đạm formol (mg/ml) sinh giờ 45 C 2,29 c 3,54d 1,25c 550C 2,27c 4,03c 1,76b 600C 2,45b 4,90a 2,45a 700C 3,06a 4,34b 1,28c Chú thích :- Thí nghiệm lặp lại lần - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95% 4.2.3 Thí nghiệm Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng enzyme papain đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành theo thời gian Sự kiềm hãm sản phẩm phản ứng, sản phẩm phản ứng đóng vai trị nhu chất kìm hãm khơng cạnh tranh Nếu phản ứng chất A chất B, có tham gia enzyme để tạo thành sản phẩm P1và P2, enzyme có lực với P1và P2, chất A chất B Khi đó, sản phẩm P1và P2 xem chất kìm hãm enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Từ bảng kết 15, đạm formol đạt giá trị cao nghiệm thức có hàm lượng enzyme 1,2% so với chất, chất lượng enzyme vừa đủ để trình thủy phân diễn tốt Như vậy, hàm lượng enzyme papain 1,2% thích hợp cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành Bảng 15 Hàm lượng đạm formol dịch thủy phân sau tác động hàm lượng enzyme papain Nồng độ enzim Hàm lượng đạm formol (mg/ml) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Hàm lượng đạm formol Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 papain Trường ĐHCT giờ (mg/ml) sinh 0,4% 2,21a 4,21d 2,00c 0,8% 2,23a 4,48c 2,25b 1,2% 2,26a 4,88a 2,62a 1,6% 2,36a 4,57b 2,21b Chú thích: - Thí nghiệp lặp lại lần - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt không ý nghĩa độ tin cậy 95% 4.2.4 Thí nghiệm Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain Thời gian thủy phân yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả thủy phân enzyme Việc xác định thời gian thủy phân việc cần thiết giúp ta biết xác phản ứng kết thúc hay chưa, hay tiếp tục, phản ứng chưa xong ta lại kết thúc trình thủy phân lượng đạm formol sinh ngược lại phản ứng kết thúc ta khơng biết mà để tiếp tục, ta tốn nhiều lượng, thời gian công sức Từ bảng 16, trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain kéo dài Sau tiến hành đo đạm formol lượng đạm thu cao thời gian sau Bảng 16 Hàm lượng đạm formol dịch thủy phân theo thời gian Hàm lượng đạm formol (mg/ml) giờ giờ giờ 2,53f 4,80 e 5,93d 6,57c 6,90 b 7,85a Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần - Các giá trị có chữ số giống khác biệt không ý nghĩa độ tin cậy 95% 4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ hàm lượng vi khuẩn Bacillus subtilis đến trình thủy phân bánh dầu đậu nành Sau xác định điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain pH= 6,5, nhiệt độ= 600C, hàm lượng enzyme= 1,2% thời gian thủy phân Với điều kiện đó, chúng tơi bổ sung 20% muối ăn vào tiến hành thí nghiệm với vi khuẩn Bacillus subtilis Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 4.3.1 Thí nghiệm Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian  Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đạm tổng số tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Qua kết bảng 17, cho thấy hàm lượng đạm tổng số đa số nghiệm thức pH 6,5 pH 7,5 từ ngày đến ngày 20 cao nghiệm thức pH 5,5 Trong đó, vào ngày 20 pH 7,5 lượng đạm tổng số sinh bắt đầu giảm Nghiệm thức pH 6,5 ngày 20 cho giá trị đạm tổng số 15,18 (mg/ml) cao so với nghiệm thức pH 5,5 pH 7,5 Vì vậy, kết luận pH 6,5 thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành tác động vi khuẩn Bacillus subtilis Bảng 17 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đạm tổng số (mg/ml) tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Ngày 10 15 20 5,5 7,34c 8,34c 9,57c 9,81c 10,46b 6,5 7,97a 10,28a 11,25a 13,96a 15,18a 7,5 7,62b 9,16b 10,25b 10,93b 9,46c pH Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95%  Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đạm amoniac tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Đạm amoniac gọi đạm thối, diện loại đạm nhiều làm chất lượng sản phẩm Đạm amoniac hình thành vi sinh vật gây thối phân hủy protein bánh dầu đậu nành Đạm amoniac tạo thành bốc làm thất thoát đạm Hàm lượng đạm amoniac tạo thành nhiều hay phụ thuộc chủ yếu vào pH, nhiệt độ, hàm lượng vi khuẩn Bacillus subtilis thời gian thủy phân Theo kết bảng 18, hàm lượng đạm amoniac cao pH 7,5, thấp pH 5,5 Điều khoảng pH 7,5 phù hợp cho phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis nên chúng gia tăng mật số tạo nhiều acid amin đồng thời sử dụng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT acid amin nhiều sinh đạm amoniac nhiều Do yêu cầu sản phẩm sau thủy phân có hàm lượng đạm amoniac thấp, cần hàm lượng đạm tổng số cao nên nghiệm thức pH 6,5 thích hợp cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành tác động vi khuẩn Bacillus subtilis Bảng 18 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đạm amoniac (mg/ml) tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Ngày 10 15 20 5,5 0,72a 0,79b 0,93b 0,89b 1,16c 6,5 0,72a 0,86ab 0,99b 0,96b 1,51b 7,5 0,72a 0,99a 1,51a 1,72a 1,75a pH Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95%  Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đạm amin tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Từ kết bảng 19, cho thấy từ ngày đến ngày 10 hàm lượng đạm amin sinh không nhiều biến động đến ngày 15 pH 6,5 hàm lượng đạm amin sinh cao ngày lại, lúc vi khuẩn thích nghi q trình thủy phân diễn mạnh mẽ nên sinh hàm lượng đạm amin cao Hàm lượng đạm amin cao đo pH 6,5 ngày 15 13,49(mg/ml) thích hợp cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis Bảng 19 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đạm amin (mg/ml) tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Ngày 10 15 20 5,5 11,63a 12,64b 12,56b 12,94b 12,77b 6,5 11,57b 12,84a 12,54b 13,49a 13,13a 7,5 11,57b 12,03c 12,98a 12,96b 12,50c pH Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95% 4.3.2 Thí nghiệm Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian  Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đạm tổng số tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Từ kết bảng 20, cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến q trình thủy phân, cụ thể từ ngày đến ngày 20 nhiệt độ 300C, 40 0C 500C lượng đạm tổng số sinh tăng chậm khơng có nhiều biến động so với hàm lượng đạm tổng số nhiệt độ 450C Có thể thấy, nhiệt độ từ 300C đến 500C mức giới hạn nhiệt độ cho sinh trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis Điều phù hợp với nghiên cứu ( Nguyễn Đức Lượng Phạm Minh Tâm, 2005) với khoảng giới hạn nhiệt độ sinh trưởng từ 360C-500C, tối đa 60 0C Hàm lượng đạm tổng số cao vào ngày 20 nhiệt độ 450C 14,89(mg/ml) thích hợp cho trình thủy phân protein bánh dầu đậu nành tác động vi khuẩn Bacillus subtilis Bảng 20 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đạm tổng số (mg/ml) tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Ngày Nhiệt độ 10 15 20 300C 7,97a 9,30c 9,97c 10,69c 11,40c 400C 7,99a 10,56b 11,18b 11,32b 12,28b 450C 7,92a 11,65a 12,84a 14,62a 14,89a 500C 7,87a 10,27b 10,88b 11,25b 12,26b Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần Nhiệt độ phịng thí nghiệm tương đương 300C - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95%  Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đạm amoniac tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Từ kết bảng 21, cho thấy đạm amoniac sinh cao nghiệm thức 400C ngày 15, trình thủy phân vi khuẩn Bacillus subtilis thích nghi với nhiệt độ gia tăng mật số nên dùng acid amin nhiều làm sinh đạm amoniac nhiều Trong đó, nghiệm thức 450C có giá trị đạm amoniac Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT thấp có khác biệt thống kê so với nghiệm thức lại Do đó, để đáp yêu cầu sản phẩm sau thủy phân có hàm lượng đạm amoniac thấp, đạm tổng số cao nên nghiệm thức nhiệt độ 450C thích hợp cho q trình thủy phân Bảng 21 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đạm amoniac (mg/ml) tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Ngày Nhiệt độ 10 15 20 300C 0,72a 0,93a 1,14a 1,10b 1,16a 400C 0,59ab 0,82b 0,93ab 1,24a 1,14a 450C 0,53b 0,58c 0,81b 0,86c 0,93b 500C 0,61ab 0,75b 1,02ab 0,99b 1,17a Chú thích: Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95%  Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đạm amin tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Theo kết bảng 22, ta thấy hàm lượng đạm amin đo nhiệt độ 300C, 400C, 45 0C tăng dần từ ngày đến ngày 15 đến ngày 20 hàm lượng đạm amin giảm Điều giải thích, từ ngày đến ngày 15 thời gian vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng thủy phân cho lượng đạm amin cao Đến ngày 20 hàm lượng đạm amin giảm lúc vi sinh vật sử dụng lượng acid amin nhiều để nhân mật số làm cho hàm lượng đạm amin giảm theo Đạm amin nhiệt độ 500C ngày thứ 15 tương đối cao (13,59mg/ml) khơng có khác biệt so với ngày 20 (13,67mg/ml) Như vậy, nhiệt độ 500C ngày thứ 15 thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis Bảng 22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đạm amin (mg/ml) tác động vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Ngày Nhiệt độ 10 15 20 300C 11,57a 12,84b 12,54b 12,96b 13,13a 400C 11,66a 12,68b 12,87b 12,78b 12,08b 450C 11,68a 12,69b 12,49b 12,99b 12,57b 500C 11,61a 13,25a 13,35a 13,59a 13,67a Chú thích: - Thí nghiệm lặp lại lần Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT - Các giá trị thống kê có ý nghĩa theo cột, giá trị có chữ số giống khác biệt khơng ý nghĩa độ tin cậy 95% CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua nghiên cứu thủy phân protein bánh dầu đậu nành nấm mốc Aspergillus oryzae, kết hợp enzyme papain vi khuẩn Bacillus subtili,một số kết sau ghi nhận:  Điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain pH= 6,5, nhiệt độ 600C, hàm lượng enzyme so với chất 1,2% sau thời gian thủy phân cho giá trị đạm formol 7,85 (mg/ml)  Điều kiện thủy phân thích hợp cho trình thủy phân dịch bánh dầu đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis pH= 6,5, nhiệt độ 500C cho giá trị đạm tổng số cao 15,18 (mg/ml), đạm amin 13,59 (mg/ml) (hiệu suất thủy phân đạm amin đạt 89,53%) đạm amoniac thấp 0,93 (mg/ml) 5.2 Đề nghị Vì thời gian có hạn, đề tài cần nghiên cứu thêm:  Bổ sung muối theo thể thức nhiều lần để tạo điều kiện thủy phân thích hợp không ức chế hoạt động vi sinh vật  Nghiên cứu bổ sung thêm loại enzyme khác có khả thủy phân triệt để nhanh  Xét nghiệm vi sinh vật số độc tố có hại sản phẩm nhằm đảm bảo chất lượng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Dương Thị Hương Giang, Nguyễn Xuân Dung Phan Bích Trâm, 2006 Nghiên cứu sử dụng papain thô từ nhựa đu đủ thủy phân protein bánh dầu đậu nành, Tạp chí Khoa học Đại Học Cần Thơ, trang 5-39 Đào Minh Thi, 2008 Nghiên cứu thủy phân protein cá nục vi khuẩn Bacillus subtilis enzyme bromelin, Luận văn tốt nghiệp Đại học, trường Đại học Cần Thơ, trang 6-17 Lý Thị Thùy Trang, 2006 Nghiên cứu thủy phân protein bánh dầu đậu nành enzyme protease, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Đại Học Cần Thơ, trang 12-26 Lương Đức Phẩm, 1998 Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 1038 Lương Đức Phẩm, 2000 Vi sinh vật học an tồn vệ sinh thực phẩm, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội, trang 22-41 Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005 Sử dụng enzyme papain để thủy phân bánh dầu đậu nành khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên trình thủy phân, Luận văn tốt nghiệp Đại học, trường Đại học Cần Thơ, trang 6-33 Nguyễn Đức Lượng, 2001 Công nghệ vi sinh vật (tập 3) – Thực phẩm lên men truyền thống, trường Đại Học Kĩ Thuật TP Hồ Chí Minh, trang 34-68 Nguyễn Đức Lượng, 2004 Cơ sở vi sinh vật công nghiệp, NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trang 23-29 Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm, 2005 Vệ sinh an toàn thực phẩm, NXB đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, trang 24-38 Nguyễn Phú Thọ, 2009 Nghiên cứu quy trình sản xuất bột papain thô ứng dụng thủy phân phụ phẩm cá tra, Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học, Viện NC & PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 13-34 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Phan Thiên Tùng 2006 Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis nước khóm thủy phân bánh dầu đậu nành, Luận văn tốt nghiệp củ nhân ngành công nghệ sinh học, Đại Học An Giang, trang 4-30 Trần Duy Tiến, Mai Hoàng Vũ, Nguyễn Quốc Cường, 2008 Ly trích enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Đại học Đà Nẵng, trang 12-19 Tiếng anh Kemllem, R.O and D.C.Church 1998, Livestorck Feeds and feeding, th edition, Pretice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, USA, Kornegay, E.T.Qian, 1996 Replacement of inorganic phosphorus by microbial phytase for young pigs fed on a maize-soybean-meal diet British Tournal ò Nutrition 76:4, 563578,CAB 961410600 Các trang web: http://www.google.com (ngày 06/02/2010) http://www.thuvienkhoahoc.com (ngày 06/02/2010) http://www.food.gov.uk (ngày 10/02/2010) http://www.enviroment-safety.com (ngày 12/02/2010) http://www.Tuoitre.com.vn (ngày 10/02/2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ... thủy phân bánh dầu đậu nành nấm mốc Aspergillus oryzae Đồng thời kết hợp enzyme papain với vi khuẩn Bacillus subtilis Tìm thơng số tốt qui trình thủy phân bánh dầu đậu nành để sản xuất dịch đạm. .. trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain - Mục đích: Tìm khoảng thời gian tốt cho trình thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain sau - Chuẩn bị thí nghiệm: Cân 30g bánh dầu đậu nành lên mốc. .. thủy phân bánh dầu đậu nành enzyme papain theo thời gian Mục đích: Tìm giá trị nhiệt độ tốt cho trình thủy phân bánh dầu đậu - nành enzyme papain - Chuẩn bị thí nghiệm: Cân 30g bánh dầu đậu nành