Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Nuôi Cấy Đến Sự Sinh Enzyme Cellulase Trên Bột Giấy Của Các Dõng Vi Khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ SINH ENZYME CELLULASE TRÊN BỘT GIẤY CỦA CÁC DÕNG VI KHUẨN KỲ KHÍ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG TRẦN NON NƢỚC Ths VÕ VĂN SONG TOÀN MSSV: 3064407 Lớp: CNSHTT K32 Cần thơ, tháng 11 năm 2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ CÁN BỘ SINH VIÊN HƢỚNG DẪN ĐỒNG HƢỚNG DẪN THỰC HIỆN ThS Dương Thị Hương Giang ThS Võ Văn Song Toàn Trần Non Nước DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký tên) LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học này, cố gắng nỗ lực thân, tơi cịn nhận nhiều quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều thầy cơ, anh chị cán Viện, gia đình, người thân bạn bè Tôi xin gửi lời tri ân chân thành đến tất Trước tiên, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc toàn thể thầy cô anh chị cán Viện Nghiên Cứu Phát Triển Cơng Nghệ Sinh Học tận tình dạy dỗ, hướng dẫn, quan tâm bảo truyền đạt kiến thức chuyên môn, kỹ nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu, nâng cao trình độ suốt trình học tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cô Dương Thị Hương Giang thầy Võ Văn Song Tồn tận tình hướng dẫn, góp ý truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm quí báu suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Dung, chị Trần Thị Giang, chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, anh Võ Văn Phước Quệ nhiệt tình góp ý, bảo kinh nghiệm thực tế tiến hành thao tác phịng thí nghiệm Vi Sinh Sinh Hóa, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Cố vấn học tập Ngô Thị Phương Dung thầy cô Viện quan tâm giúp đỡ, động viên tinh thần nhiều trình học thực luận văn tốt nghiệp Ngồi ra, gia đình ln chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên to lớn giúp tơi ln cảm thấy tràn đầy ý chí, nghị lực, tự tin suốt trình học tập, rèn luyện trường Đại học Cần Thơ suốt trình thực luận văn Tất tình cảm, cơng ơn tơi khơng thể nói hết qua vài trang giấy Tơi xin tri ân suốt đời Ngoài ra, quan tâm, giúp đỡ động viên bạn bè lớp Công nghệ Sinh học Tiên Tiến K32, Công nghệ Sinh học K32, sinh viên K33 K34 niềm vui, động lực to lớn giúp tơi hồn thành tốt chương trình học tập bậc đại học luận văn Xin chân thành cảm ơn tất Trân trọng TÓM LƢỢC Việc khảo sát chọn lọc nguồn vi khuẩn, tối ưu hóa điều kiện lên men chọn lọc chất phù hợp yếu tố quan trọng cho việc sinh tổng hợp enzyme cellulase thành công từ vi khuẩn Do đó, việc chọn dịng vi khuẩn, tối ưu hóa điều kiện ni cấy chọn lọc nguồn chất tiến hành 37 dòng vi khuẩn kỵ khí giống phân lập sẵn Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đem khảo sát hoạt tính, với việc sử dụng bột giấy làm chất Kết chọn dòng cho thấy vi khuẩn VK52 cho đường kính vịng trịn thủy phân lớn (20,5 mm) Các điều kiện tối ưu cho việc sinh enzyme vi khuẩn VK52 xác định pH 8, nhiệt độ 300C ngày nuôi với môi trường nuôi cấy bổ sung hàm lượng dịch trích nấm men 0,4% Việc sản xuất thử enzyme cellulase qui mô phịng thí nghiệm từ VK52 điều kiện tối ưu chọn cho kết hoạt tính enzyme cellulase (0,107 U/ml cho endoglucanase 0.06 U/ml cho exoglucanase), hàm lượng protein 260,56 µg/ml, mật số tế bào 6,7 x 108 CFU/ml, pH giảm 6,89, hiệu suất thủy phân chất 9,025 % Nghiên cứu thể với điều kiện nuôi cấy trên, bột giấy bột cellulose hai chất tốt cho sinh enzyme từ vi khuẩn VK52 hoạt tính enzyme thể chất bột cellulose, bột rơm, bã mía vỏ trấu Từ khóa: Bột giấy, enzyme cellulase, endoglucanase, exoglucanase, vi khuẩn kỳ khí Chun ngành Cơng nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi TỪ VIẾT TẮT vii CHƢƠNG GIỚI THIỆU CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược cellulose 2.2 Sơ lược cellulase 2.3 Giá trị kinh tế enzyme cellulase 2.4 Sơ lược vi sinh vật phân hủy cellulose 2.5 Sơ lược số phương pháp vi sinh 2.5.1 Phương pháp pha loãng vi sinh vật 2.5.2 Phương pháp đếm mật số vi sinh vật phuơng pháp đếm sống 2.5.3 Phương pháp đo đường kính thủy phân 2.6 Sơ lược số phương pháp sinh hóa 2.6.1 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford (1976) 2.6.2 Định lượng đường khử phương pháp Nelson-Somogyi (1944) 2.7 Tình hình nghiên cứu nước giới 2.7.1 Tình hình nghiên cứu nước 2.7.2 Tình hình nghiên cứu giới CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu 10 3.1.1 Thời gian 10 3.1.2 Địa điểm 10 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 10 3.1.4 Nguyên vật liệu 10 3.1.5 Hoá chất 10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 3.2 Phương pháp nghiên cứu 11 3.2.1 Các bước chuẩn bị mơi trường ni cấy dịng vi khuẩn kỵ khí 11 3.2.1.1 Chuẩn bị mơi trường ni cấy vi khuẩn 11 3.2.1.2 Chuẩn bị dịng vi khuẩn kỵ khí 12 3.2.2 Thí nghiệm 1: Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh 12 3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tương tác pH nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp cellulase dịng vi khuẩn chọn 13 3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng dịch trích nấm men lên khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn chọn 14 3.2.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 15 3.2.6 Thí nghiệm 5: Sản xuất thử nghiệm khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn từ điều kiện tối ưu chọn 16 3.2.7 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng điều kiện ni cấy chọn cho dịng vi khuẩn môi trường bột giấy, bột cellulose, bột rơm, bã mía 17 3.3 Xử lý thống kê 17 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 4.1 Thí nghiệm 1: Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp cellulase mạnh 18 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng điều kiện pH nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn chọn 21 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng dịch trích nấm men đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 23 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian ni đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 25 4.5 Thí nghiệm 5: Sản xuất thử nghiệm khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn từ điều kiện tối ưu chọn 27 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát nguồn carbon chất nuôi khác đến sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 28 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC 1: PHƢƠNG PHÁP VI SINH – SINH HÓA Phương pháp pha loãng Phương pháp khảo sát đường kính vịng trịn thủy phân Phương pháp đếm mật số vi khuẩn cách đếm sống Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford (1976) Phương pháp xác định đường khử (Nelson-Somogyi, 1944) PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Chun ngành Cơng nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học DANH SÁCH BẢNG Bảng số Tựa bảng Trang Bảng Môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn (M1) 11 Bảng Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn (M2) 11 Bảng Bố trí thí nghiệm xác định đường khử mẫu thí nghiệm 15 Bảng Kết tổng hợp điều kiện chọn thể tích ni 800 ml 29 Bảng Các giá trị OD phương trình đường chuẩn BSA Phụ lục Bảng Giá trị OD dung dịch glucose chuẩn Phụ lục Bảng Bảng ANOVA cho đường kính vịng trịn thủy phân dòng vi khuẩn Phụ lục Bảng Kết thống kê đường kính vịng trịn thủy phân dịng vi khuẩn Phụ lục Bảng Kết phân tích thống kê ảnh hưởng tương tác pH nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Phụ lục Bảng 10 Kết phân tích thống kê cho ảnh hưởng hàm lượng dịch trích nấm men đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Phụ lục Bảng 11 Kết phân tích thống kê cho ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Phụ lục Bảng 12 Kết thống kê hoạt tính enzyme endoglucanase nguồn carbon khác Phụ lục Bảng 13 Kết thống hoạt tính enzyme exoglucanase nguồn carbon khác Phụ lục Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học DANH SÁCH HÌNH Hình số Tựa hình Trang Hình Quá trình thủy phân cellulose enzyme cellulase Hình Phản ứng gắn kết protein với Coomassie Brilliant Blue G250 Hình Đường kính vịng trịn thủy phân dịng vi khuẩn đem khảo sát 19 Hình Kết đường kính vịng trịn thủy phân dịng 52 20 Hình Ảnh hưởng tương tác pH nhiệt độ đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 52 21 Hình Đường kính vịng trịn thủy phân vi khuẩn 52 pH 8, nhiệt độ 300C 23 Hình Ảnh hưởng dịch trích nấm men đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 52 23 Hình Hàm lượng protein sinh dịch enzyme thô với bổ sung dịch trích nấm men 24 Hình Sự thay đổi hoạt tính cellulase theo thời gian ni cấy 25 Hình 10 Hàm lượng protein sinh dịch ni cấy theo thời gian 26 Hình 11 Sự ảnh hưởng nguồn carbon khác lên sinh tổng hợp cellulase (endoglucanase exoglucanase) hàm lượng protein sinh dịch ni dịng vi khuẩn 52 với điều kiện nuôi tối ưu chọn 29 Hình 11 Thí dụ minh họa phương pháp pha loãng mẫu Phụ lục Hình 12 Biểu đồ đường chuẩn protein (BSA) Phụ lục Hình 13 Biểu đồ phương trình đường chuẩn glucose Phụ lục Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học CÁC TỪ VIẾT TẮT BSA: Bovine Serum Albumin Cbh: Cellobiohydrolase CMC: Carboxymethylcellulose CMCase: Carboxymethylcellulase CFU: Colony Form Unit Egl: Endoglucanase Bgl: Betaglucosidase rpm: round per minute Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ  đơn vị hoạt tính enzyme 1U định nghĩa lượng enzyme cần để sinh 1mol đường khử (glucose) thời gian phản ứng phút với thể tích phản ứng enzyme ml điều kiện phản ứng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Đƣờng chuẩn dung dịch BSA (µg/ml) Bảng 5: Các giá trị OD phƣơng trình đƣờng chuẩn BSA PT đường chuẩn: y=0,0018x - 0,006 Nồng độ BSA (µl/ml) 60 120 180 240 300 OD 0.099 0.177 0.307 0.422 0.53 OD 0.114 0.189 0.316 0.441 0.536 OD 0.115 0.21 0.328 0.458 0.549 OD TB 0.109 0.192 0.317 0.440 0.538 y = 0.0018x - 0.006 R2 = 0.9971 Biểu đồ đường chuẩn BSA Độ hấp thụ OD 595 nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (ug/ml) Hình 12: Biểu đồ đƣờng chuẩn protein (BSA) Đƣờng chuẩn dung dịch glucose chuẩn (mM) Bảng 6: Giá trị OD dung dịch glucose chuẩn Nồng độ Glucose (mM) 0.2 0.4 0.6 0.8 OD 0.254 0.457 0.735 0.961 1.120 OD 0.252 0.457 0.737 0.962 1.124 OD 0.253 0.459 0.739 0.965 1.125 OD TB 0.253 0.458 0.737 0.963 1.123 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ y = 1.1463x + 0.0159 R2 = 0.9955 Giá trị OD 520nm 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nơng độ Glucose (mM) Hình 13: Biểu đồ phƣơng trình đƣờng chuẩn glucose Kết phân tích thống kê thí nghiệm Bảng 7: Bảng ANOVA cho đƣờng kính vòng tròn thủy phân dòng vi khuẩn ANOVA Table for Duong kinh vong tron thuy phan by Dong vi khuan Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2435.08 36 67.641 81.61 0.0000 Within groups 61.3333 74 0.828829 Total (Corr.) 2496.41 110 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 8: Kết thống kê đƣờng kính vịng trịn thủy phân dòng vi khuẩn Multiple Range Tests for Duong kinh vong tron thuy phan by Dong vi khuan -Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan Count Mean Homogeneous Groups -16 0.0 X 26 0.0 X 65 0.0 X 27 1.33333 XX 80 2.16667 XX 18 3.16667 XX 36 3.83333 XX 62 4.83333 XX 20 5.33333 XX 30 5.33333 XX 17 5.5 XX 15 6.0 XX 38 6.5 XX 6.5 XX 37 6.66667 XX 32 7.66667 XX 66 7.83333 XX 64 8.33333 XX 3 8.33333 XX 83 8.66667 XX 63 9.33333 XX 67 9.5 XX 33 9.5 XX 9.66667 XX 75 9.66667 XX 72 10.3333 XX 49 10.3333 XX 11.1667 XX 84 11.3333 XX 85 12.1667 X 31 12.3333 X 13 12.3333 X 43 12.5 XX 44 13.8333 X 76 15.6667 X 39 17.6667 X 52 20.5 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 9: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng tƣơng tác pH nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Analysis of Variance for Duong kinh vong tron thuy phan - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Gia tri pH 6866.35 980.907 4571.22 0.0000 B:Nhiet 2083.83 520.956 2427.76 0.0000 INTERACTIONS AB 2257.31 28 80.6182 375.70 0.0000 RESIDUAL 17.1667 80 0.214583 -TOTAL (CORRECTED) 11224.6 119 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Duong kinh vong tron thuy phan by Gia tri pH -Method: 95.0 percent LSD Gia tri pH Count LS Mean Homogeneous Groups -4 15 0.0 X 15 0.0 X 11 15 0.0 X 10 15 0.0 X 15 11.6667 X 15 14.6333 X 15 16.3 X 15 16.8333 X -Multiple Range Tests for Duong kinh vong tron thuy phan by Nhiet -Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups -50 24 0.0 X 45 24 7.0 X 40 24 8.5 X 35 24 8.91667 X 30 24 12.7292 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 10: Kết phân tích thống kê cho ảnh hƣởng hàm lƣợng dịch trích nâm men đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn ANOVA Table for Hoat tinh cellulase by Ham luong dich trich nam men Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.004564 0.000760667 62.64 0.0000 Within groups 0.00017 14 0.0000121429 Total (Corr.) 0.004734 20 Multiple Range Tests for Hoat tinh cellulase by Ham luong dich trich nam men -Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -0 0.0213333 X 0.6 0.0233333 X 0.1 0.027 XX 0.2 0.031 X 0.5 0.039 X 0.3 0.043 X 0.4 0.0673333 X ANOVA Table for Ham luong protein sinh by Ham luong dich trich nam men Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9116.44 1519.41 157.92 0.0000 Within groups 134.697 14 9.6212 Total (Corr.) 9251.14 20 Multiple Range Tests for Ham luong protein sinh by Ham luong dich trich nam men -Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -0 32.4067 X 0.1 40.0 X 0.2 44.4433 X 0.6 49.9067 X 0.3 56.39 X 0.5 69.26 X 0.4 99.3533 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 11: Kết phân tích thống kê cho ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn ANOVA Table for Hoat tinh cellulase by Thoi gian nuoi cay Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00617853 0.000686504 349.07 0.0000 Within groups 0.0000393333 200.00000196667 Total (Corr.) 0.00621787 29 Multiple Range Tests for Hoat tinh cellulase by Thoi gian nuoi cay -Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -0 0.00766667 X 0.0286667 X 0.0336667 X 0.034 X 0.0383333 X 0.0386667 X 0.0423333 X 3 0.0503333 X 0.052 X 0.0636667 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 12: Kết thống kê hoạt tính enzyme endoglucanase nguồn carbon khác ANOVA Table for Hoat tinh enzyme endoglucanase by Nguon carbon Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.000162267 0.0000405667 11.06 0.0011 Within groups 0.0000366667 100.00000366667 Total (Corr.) 0.000198933 14 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme endoglucanase by Nguon carbon -Method: 95.0 percent LSD Nguon carbon Count Mean Homogeneous Groups -Vo trau 0.0226667 X Ba mia 0.0256667 XX Rom 0.028 XX Cellulos 0.0306667 XX Bot giay 0.0316667 X Bảng 13: Kết thống hoạt tính enzyme exoglucanase nguồn carbon khác ANOVA Table for Hoat tinh enzyme exoglucanase by Nguon carbon Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00235893 0.000589733 421.24 0.0000 Within groups 0.000014 10 0.0000014 Total (Corr.) 0.00237293 14 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme exoglucanase by Nguon carbon -Method: 95.0 percent LSD Nguon carbon Count Mean Homogeneous Groups -Rom 0.021 X Vo trau 0.0213333 X Ba mia 0.029 X Cellulos 0.0476667 X Bot giay 0.0496667 X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THÔ CỦA CÁC THÍ NGHIỆM Bảng 14: Kết đƣờng kính vịng tròn thủy phân dòng vi khuẩn Dòng vi khuẩn Đường kính vịng trịn thủy phân ban đầu (mm) Đường kính vịng trịn thủy phân trừ lỗ đục (mm) Đƣờng kính vịng trịn thủy phân trung bình trừ lỗ đục (mm) VK 15 14.5 14.5 10 9.5 9.5 9.7 VK 84 15 18 16 10 13 11 11.3 VK 38 11 12 11.5 6.5 6.5 VK 72 16 15 15 11 10 10 10.3 VK 76 20.5 21.5 20 15.5 16.5 15 15.7 VK 33 14.5 15 14 9.5 10 9.5 VK 32 12 14 12 7.7 VK 75 15.5 14.5 14 10.5 9.5 9.7 VK 63 13.5 14.5 15 8.5 9.5 10 9.3 VK 13 16.5 17 18.5 11.5 12 13.5 12.3 VK 39 25 23 20 20 18 15 17.7 VK 13.5 10 11 8.5 6.5 VK 49 16 16 14 11 11 10.3 VK 36 8.5 3.5 3.8 VK 27 6.5 6.5 1.5 1.5 1.3 VK 66 13 12.5 13 7.5 7.8 VK 52 25.5 26 25 20.5 21 20 20.5 VK 85 18 16.5 17 13 11.5 12 12.2 VK 43 19 16.5 17 14 11.5 12 12.5 VK 44 19 19.5 18 14 14.5 13 13.8 VK 16 16.5 16 11 11.5 11 11.2 VK 31 16.5 17.5 18 11.5 12.5 13 12.3 VK 80 7.5 2.5 2.2 VK 64 15 13 12 10 8.3 VK 14.5 12.5 13 9.5 7.5 8.3 VK 15 11 11.5 10.5 6.5 5.5 6.0 VK 16 5 0 0.0 VK 17 10 10.5 11 5.5 5.5 VK 18 8.5 3.5 3.2 VK 20 10.5 10 10.5 5.5 5.5 5.3 VK 26 5 0 0.0 VK 30 12 10 5.3 VK 37 12.5 11 11.5 7.5 6.5 6.7 VK 62 10 9.5 10 4.5 4.8 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ VK 65 5 0 0.0 VK 67 15 13.5 15 10 8.5 10 9.5 VK 83 14 13 14 9 8.7 Bảng 15: Kết đƣờng kính vịng tròn thủy phân tƣơng tác pH nhiệt độ pH 10 11 30 0 18 23.5 29.5 29 0 30 0 19 25 29.5 29 0 30 0 17 25 31 30 0 35 0 14 17.5 20 20 0 35 0 13.5 18 21.5 19.5 0 35 0 14 17 20.5 18.5 0 40 0 13.5 17 17.5 20 0 40 0 14 17 17 18.5 0 40 0 15.5 16 18.5 19.5 0 45 0 13 15 16 14 0 45 0 11 14 15.5 13 0 45 0 12.5 14.5 16 13.5 0 50 0 0 0 0 50 0 0 0 0 50 0 0 0 0 Nhiệt độ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 16: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng dịch trích nâm men đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Hàm lượng dịch trích nấm men Mẫu 0% 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% 0.60% ĐC 0.117 0.138 0.171 0.219 0.252 0.287 0.327 L1 0.169 0.192 0.238 0.329 0.421 0.384 0.372 L2 0.159 0.196 0.242 0.318 0.419 0.385 0.378 L3 0.152 0.204 0.249 0.332 0.451 0.377 0.377 OD TRUNG BÌNH 0.043 0.059 0.072 0.107 0.178 0.095 0.049 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SINH RA 0.096 0.121 0.140 0.194 0.302 0.175 0.105 HOẠT TÍNH CELLULASE 0.021 0.027 0.031 0.043 0.067 0.039 0.023 Mẫu 0% 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% 0.60% ĐC1 0.115 0.138 0.168 0.217 0.25 0.275 0.316 M1 0.168 0.19 0.233 0.325 0.419 0.38 0.366 M1 0.17 0.194 0.243 0.333 0.423 0.388 0.378 OD TRUNG BÌNH 0.054 0.054 0.07 0.112 0.171 0.109 0.056 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SINH RA 0.113 0.113 0.137 0.201 0.291 0.196 0.116 HOẠT TÍNH CELLULASE 0.025 0.025 0.030 0.045 0.065 0.044 0.026 ĐC2 0.117 0.137 0.174 0.219 0.253 0.298 0.333 M2 0.158 0.192 0.239 0.318 0.419 0.381 0.378 M2 0.159 0.2 0.245 0.317 0.418 0.389 0.377 OD TRUNG BÌNH 0.042 0.059 0.068 0.099 0.166 0.087 0.045 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SINH RA 0.094 0.120 0.134 0.180 0.282 0.163 0.098 HOẠT TÍNH CELLULASE 0.021 0.027 0.030 0.040 0.063 0.036 0.022 ĐC3 0.119 0.139 0.171 0.221 0.253 0.288 0.332 M3 0.15 0.203 0.244 0.33 0.446 0.375 0.369 M3 0.154 0.204 0.253 0.334 0.456 0.379 0.385 OD TRUNG BÌNH 0.033 0.065 0.078 0.111 0.198 0.089 0.045 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SINH RA 0.081 0.129 0.149 0.199 0.332 0.166 0.099 HOẠT TÍNH CELLULASE TRUNG BÌNH 0.018 0.029 0.033 0.044 0.074 0.037 0.022 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 17: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng dịch trích nâm men đến sinh tổng hợp cellulase dịng vi khuẩn Hàm lượng dịch trích nấm men Mẫu 0% 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% 0.60% 0.05 0.068 0.079 0.098 0.161 0.132 0.083 0.055 0.067 0.074 0.097 0.166 0.127 0.083 0.0525 0.0675 0.0765 0.0975 0.1635 0.1295 0.083 0.052 0.067 0.07 0.092 0.17 0.115 0.085 0.051 0.066 0.072 0.096 0.171 0.111 0.082 0.0515 0.0665 0.071 0.094 0.1705 0.113 0.0835 0.05 0.064 0.071 0.092 0.181 0.111 0.084 0.056 0.064 0.078 0.098 0.188 0.116 0.086 OD TB3 0.053 0.064 0.0745 0.095 0.1845 0.1135 0.085 Hàm lượng protein 32.50 40.83 45.83 57.50 94.17 75.28 49.44 31.94 40.28 42.78 55.56 98.06 66.11 49.72 32.78 38.89 44.72 56.11 105.83 66.39 50.56 32.41 40.00 44.44 56.39 99.35 69.26 49.91 OD TB1 OD TB2 Hàm lượng protein trung bình Bảng 18: Kết ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp cellulase dịng vi khuẩn Kết thí nghiệm thời gian Hoạt tính cellulase pp NELSON CMC Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày ĐC 0.175 0.209 0.232 0.235 0.247 0.242 0.238 0.234 0.226 0.227 L1 0.175 0.278 L2 0.176 0.295 0.351 0.355 TB 0.0005 0.078 0.099 0.129 0.173 0.126 0.107 0.094 0.077 0.068 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ SINH RA 0.001 0.149 0.180 0.226 0.293 0.222 0.193 0.174 0.147 0.133 HOẠT TÍNH CELLULASE 0.0001 0.033 0.040 0.050 0.065 0.049 0.043 0.039 0.033 0.030 ĐC2 0.154 0.271 0.209 0.215 0.242 0.245 0.249 0.239 0.206 0.204 L1 0.154 0.36 L2 0.155 0.346 0.285 0.341 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 0.31 0.372 0.419 0.363 0.335 0.325 0.291 0.304 0.42 0.372 0.355 0.331 0.314 0.285 0.311 0.347 0.399 0.389 0.358 0.332 0.291 0.259 0.41 0.384 0.349 0.335 0.286 0.27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ TB 0.0005 0.082 0.089 0.129 0.163 0.142 0.105 0.095 0.083 0.061 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ SINH RA 0.001 0.155 0.166 0.227 0.278 0.246 0.190 0.174 0.156 0.123 HOẠT TÍNH CELLULASE 0.0001 0.035 0.037 0.050 0.062 0.055 0.042 0.039 0.035 0.027 ĐC3 0.114 0.218 0.244 0.259 0.264 0.244 0.231 0.225 0.212 0.185 L1 0.115 0.283 0.321 0.401 0.497 0.384 0.329 0.312 0.285 0.242 L2 0.114 0.297 0.345 0.385 0.376 0.376 0.331 0.308 0.305 0.274 TB 0.0005 0.072 0.089 0.134 0.173 0.136 0.099 0.085 0.083 0.073 HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ SINH RA 0.001 0.140 0.166 0.234 0.293 0.238 0.181 0.160 0.157 0.142 HOẠT TÍNH CELLULASE 0.0001 0.031 0.037 0.052 0.065 0.053 0.040 0.036 0.035 0.031 TB lần lặp 0.0005 0.077 0.092 0.131 0.169 0.134 0.104 0.091 0.081 0.067 Hàm lượng đường sinh 0.001 0.148 0.171 0.229 0.288 0.235 0.188 0.169 0.153 0.133 Hoạt tính cellulase 0.0001 0.033 0.038 0.051 0.064 0.052 0.042 0.038 0.034 0.029 Bảng 19: Kết ảnh hƣởng thời gian nuôi đến sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Hàm lượng protein pp Bradford Giá trị OD Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày L1 0.06 0.2 0.23 0.266 0.36 0.31 0.23 0.231 0.212 0.206 L2 0.054 0.214 0.241 0.27 0.405 0.26 0.235 0.22 0.212 0.203 L3 0.068 0.225 0.258 0.268 0.38 0.255 0.252 0.222 0.219 0.201 OD trung bình 0.061 0.213 0.243 0.268 0.382 0.275 0.239 0.224 0.214 0.203 Hàm lƣợng protein 37.04 121.67 138.33 152.22 215.37 156.11 136.11 127.96 115.74 109.63 Bảng 20: Kết thí nghiệm tổng hợp điều kiện tối ƣu chọn Kết thí nghiệm scale up Hoạt tính cellulase pp Nelson Giá trị OD CMC Cellulose powder ĐC 0.125 0.232 L1 0.445 0.498 L2 0.398 0.645 L3 0.418 0.562 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Giá trị OD trung bình 0.295 0.336 Hàm lượng đường khử 0.480 0.542 Hoạt tính cellulase 0.107 0.060 Bảng 21: Kết hàm lƣợng protein sinh thí nghiệm sản xuất tổng hợp Hàm lượng protein dịch enzyme pp Bradford Giá trị OD L1 0.376 L2 0.363 L3 0.38 Giá trị OD trung bình 0.373 Hàm lượng protein dịch enzyme 210.56 Bảng 22: Sự thay đổi pH sau nuôi Sự thay đổi pH trước sau thời gian nuôi L1 6.91 L2 6.88 L3 6.88 Trung bình 6.89 Bảng 23: Hiệu suất thủy phân thí nghiệm tổng hợp Lặp lại Khối lượng chất khô ban đầu (g) Khối lượng chất khô lúc sau (g) Hiệu suất thủy phân (%) L1 7.271 9.113 L2 7.288 8.9 L3 7.275 9.063 Trung bình 7.278 9.025 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 24: Kết hoạt tính thí nghiệm ảnh hƣởng nguồn carbon HOẠT TÍNH CELLULASE BẰNG PP NELSON ENZYME + CMC MÔI TRƯỜNG NUÔI Cellulose Bột giấy Rơm Bã mía Vỏ trấu ĐC 0.215 0.208 0.327 0.246 0.252 L1 0.29 0.278 0.392 0.298 0.295 L2 0.288 0.286 0.384 0.304 0.295 L3 0.28 0.282 0.394 0.306 0.31 Giá trị OD trung bình 0.071 0.074 0.063 0.057 0.048 Hàm lƣợng đƣờng 0.139 0.143 0.126 0.117 0.104 Hoạt tính cellulase 0.031 0.032 0.028 0.026 0.023 Cellulose Bột giấy Rơm Bã mía Vỏ trấu ĐC 0.191 0.205 0.329 0.246 0.256 L1 0.308 0.333 0.372 0.312 0.298 L2 0.311 0.329 0.368 0.314 0.297 L3 0.319 0.332 0.373 0.309 0.302 Giá trị OD trung bình 0.122 0.126 0.042 0.066 0.043 Hàm lƣợng đƣờng 0.216 0.223 0.094 0.131 0.096 Hoạt tính cellulase 0.024 0.025 0.010 0.015 0.011 Giá trị OD ENZYME + Cellulose MÔI TRƯỜNG NUÔI Giá trị OD Bảng 25: Hàm lƣợng protein sinh từ nguồn carbon Giá trị OD Cellulose Bột giấy Rơm Bã mía Vỏ trấu L1 0.336 0.39 0.57 0.56 0.905 L2 0.412 0.417 0.561 0.458 0.69 L3 0.236 0.336 0.556 0.442 0.747 Giá trị OD trung bình 0.328 0.381 0.562 0.487 0.781 Hàm lƣợng protein dịch enzyme 22.75 26.99 41.49 35.45 58.97 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ... với điều kiện nuôi cấy trên, bột giấy bột cellulose hai chất tốt cho sinh enzyme từ vi khuẩn VK52 hoạt tính enzyme thể chất bột cellulose, bột rơm, bã mía vỏ trấu Từ khóa: Bột giấy, enzyme cellulase, ... đề tài ? ?Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh enzyme cellulase bột giấy dịng vi khuẩn kỵ khí” tiến hành nghiên cứu 1.2 Mục tiêu đề tài  Chọn số dịng vi khuẩn kỵ khí có khả sinh tổng hợp cellulase. .. thủy phân đạt 20,5 mm Các điều kiện nuôi cấy môi trường dinh dưỡng tối ưu ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 52 chọn Vi? ??c sinh enzyme cellulase dòng vi khuẩn đạt cao với hàm