Nghiên cứu đông lạnh nhanh tinh dịch chó Phú Quốc

Bài viết nghiên cứu thử nghiệm đông lạnh nhanh tinh dịch chó Phú Quốc đã được thực hiện nhằm phục vụ việc bảo tồn và nhân giống giống chó này bằng kỹ thuật phối tinh nhân tạo. Chất lượng tinh của 6 con chó đực giống Phú Quốc được đánh giá, tinh được khai thác 6 lần/đực giống, 5 ngày lấy tinh một lần.

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH NHANH TINH DỊCH CHÓ PHÚ QUỐC Trần Thị Chi, Vũ Hải Yến, Nguyễn Tuấn Dũng, Nguyễn Văn Thanh Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam TĨM TẮT Nghiên cứu thử nghiệm đơng lạnh nhanh tinh dịch chó Phú Quốc thực nhằm phục vụ việc bảo tồn nhân giống giống chó kỹ thuật phối tinh nhân tạo (i) Chất lượng tinh chó đực giống Phú Quốc đánh giá, tinh khai thác lần/đực giống, ngày lấy tinh lần Kết nghiên cứu cho thấy thể tích tinh dịch phân đoạn giàu tinh trùng 1,42±0,13 ml; hoạt lực tinh trùng đạt 0,86±0,05 điểm; nồng độ tinh trùng đạt 604,7±85,0 triệu tinh trùng/ml, tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác đạt 496,9±38,9 triệu tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 11,1±0,9% (ii) Đơng lạnh nhanh mẫu tinh thực theo quy trình CERCA (Benechet, 2007) mơi trường TCG (Tris-Citrate-Glucose) có bổ sung 20% lịng đỏ trứng gà thử nghiệm bổ sung chất chống choáng lạnh glycerol (với mức hàm lượng thử nghiệm 0; 4; 8% thể tích) ethylene glycol (với mức hàm lượng thử nghiệm 0; 6; 10% thể tích); tinh đóng cọng rạ 0,25 ml chứa 100 triệu tinh trùng/liều tinh; sau ngày bảo quản nitơ lỏng, mẫu tinh rã đông 37oC phút Kết xác định chất lượng tinh cho thấy hoạt lực tinh trùng sau rã đông đạt cao môi trường chứa 6% glycerol 8% ethylene glycol, đạt tương ứng 0,46±0,02 0,49±0,03 điểm; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tương ứng 24,61±0,39% 22,86±0,33% Từ khóa: Chó Phú Quốc, tinh trùng, tinh dịch, bảo quản đông lạnh, chất bảo vệ đông lạnh, chất lượng tinh trùng A research on cryopreservation of Phu Quoc dog semen Tran Thi Chi, Vu Hai Yen, Nguyen Tuan Dung, Nguyen Van Thanh SUMMARY Study on Cryopreservation for Phu Quoc dog semen was conducted in order to serve for the conservation and propagation of this breed by artificial insemination (i) The quality of sperm of Phu Quoc dogs was evaluated The semens were harvested in times per sire, the interval between each harvesting time was days The studied results showed that the volume of semen containing highest number of sperms was 1.42±0.13 ml, sperm activity reached 0.86±0.05 points, sperm concentration was 604.7 ± 85.0 million sperms per ml semen, of which the total number of sperms moving directly per each harvesting time reached 496.9 ± 38.9 million spermatozoa and the sperm abnormality rate was 11.1 ± 0.9% The semen samples were packed in straws with 0.25 ml containing a total of 100 million sperm per dose and conserved in liquid nitrogen according to the CERCA procedure (Benechet, 2007) in TCG (Tris-Citrate-Glucose) medium supplemented 20% of egg yolk, with cryo-protectants, such as: glycerol (at the test levels: 0, 4, and 8% by volume) or ethylene glycol (at the test levels: 0, 6, and 10% by volume) After days of conservation in liquid nitrogen, the semen samples were thawed at 370C for minute The result of testing sperm quality showed that the activity of sperm after thawing reached the highest level in the medium containing 6% glycerol or 8% ethylene glycol, that was 0.46 ± 0.02 and 49 ± 0.03 points, respectively, and the sperm abnormality rate was 24.61 ± 0.39% and 22.86 ± 0.33%, respectively Keywords: Phu Quoc dogs, sperm, semen, cryopreservation, cryoprotectants, sperm quality 62 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 I ĐẶT VẤN ĐỀ Truyền tinh nhân tạo kĩ thuật hỗ trợ sinh sản nhiều loài động vật Kể từ thành công thực Harp cs (1954), kỹ thuật truyền tinh nhân tạo chó áp dụng ngày phổ biến giới Việt Nam Kỹ thuật đem lại nhiều lợi ích cho nhà chọn giống nhân giống chó: giảm phiền phức chi phí phải vận chuyển chó, hạn chế lây lan bệnh truyền nhiễm, bảo quản tinh lâu dài, hiệu kinh tế cao… Bên cạnh đó, thành cơng công nghệ đông lạnh tinh trùng trở thành công cụ đắc lực cho kỹ thuật phối tinh nhân tạo chó nhân giống bảo tồn giống chó địa Năm 1949, với công bố Polge cs chất glycerol công bố Lovelock Bishop năm 1959 chất dimethyl sulfoxide với vai trò chất bảo vệ tế bào động vật đông lạnh, nhiều nghiên cứu đông lạnh tinh trùng tiến hành áp dụng thành công nhân giống chó (Thomas cs., 1993, Linde-Forsberg C cs., 1995, Nöthling cs., 2005, Martins-Bessa cs., 2006, Manuela Stănescu cs., 2012) Bên cạnh việc phát cơng bố khoảng 400 giống chó khác giới, có 50 giống phổ biến, chiếm 90% tổng số cá thể chó, Việt Nam, du nhập nhân nhiều giống chó giới với giống chó địa quý Việt Nam hay gọi “Tứ đại quốc khuyển” gồm giống chó H’Mơng (dịng cộc có đi), giống chó Bắc Hà, giống chó Phú Quốc giống chó gặp Dingo Chó Phú Quốc Việt Nam giống chó giới có đặc tính có xốy lưng bên cạnh giống chó xốy lưng Thái Lan chó xốy lưng châu Phi Chó Phú Quốc Hiệp hội người ni chó giống Việt Nam VKA, thành viên Hiệp hội người ni chó giống quốc tế FCI cơng nhận cơng bố tiêu chuẩn chó địa giống chó giống chó H’Mơng cộc năm 2009 Ở Việt Nam, có số cơng bố nghiên cứu bảo quản tinh chó dạng lỏng nhiệt độ 5oC bảo quản tinh đông lạnh số giống chó nghiệp vụ (Đỗ Văn Thu cs., 2008), nhiên, cơng bố kỹ thuật đơng lạnh tinh chó Phú Quốc phục vụ nhân giống bảo tồn nguồn gen giống chó II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các mẫu tinh trùng sử dụng cho thí nghiệm khai thác từ chó đực giống Phú Quốc nuôi Học viện Nông nghiệp Việt Nam Cả cá thể chó đực giống Phú Quốc thí nghiệm giống chủng cấp giấy chứng nhận giống gốc Hiệp hội người ni chó giống Việt Nam VKA Các chó đực giống độ tuổi sinh sản (từ 18 đến 24 tháng tuổi), cho ăn chăm sóc chế độ riêng cho chó đực giống, tiêm chủng vaccine phòng bệnh đạt trạng thái sức khỏe tốt Các chó đực giống huấn luyện khai thác tinh nhân tạo kỹ thuật viên, tần suất khai thác tinh ngày lần Tinh chó khai thác phương pháp massage theo Rita Payan-Carreira (2011), phân đoạn tinh giai đoạn không thu nhận, phân đoạn giàu tinh thu nhận bảo quản cốc thủy tinh giữ ấm 34oC Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, tương ứng với lần khai thác tinh chó đực 2.2 Xác định tiêu chất lượng tinh dịch chó Các tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch chó gồm thể tích tinh dịch phân đoạn giàu tinh, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thực theo mơ tả Rita Payan-Carreira (2011): Thể tích tinh dịch xác định ống nghiệm chia vạch; Hoạt lực tinh trùng xác định cách nhỏ giọt tinh lên lam kính, quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 160 lần, ước lượng đánh giá điểm hoạt lực mẫu tinh sau quan sát từ giọt tinh, thang điểm đánh giá hoạt 63 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 lực từ 0,1đến 1; Nồng độ tinh trùng xác định sử dụng buồng đếm Neubawer với độ pha loãng tinh 1:200 dung dịch NaCl 10%; Tinh trùng kỳ hình xác định sau ủ dung dịch formol citrate 4% quan sát kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình xác định tổng số 500 tinh trùng quan sát/mẫu 2.3 Đông lạnh nhanh rã đơng tinh chó Tinh chó đơng lạnh theo quy trình CERCA mơ tả Benechet năm 2007: mẫu tinh có nồng độ tinh trùng 300 triệu tinh trùng/ml, hoạt lực tinh 0,7 điểm, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 20% đạt yêu cầu để đông lạnh tinh Tinh trùng ly tâm 2000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ 25oC để loại bỏ tinh Tinh trùng pha mơi trường TCG (Tris-Citrate-Glucose) bổ sung 20% lịng đỏ trứng gà, ủ cân 4oC Sau đó, tinh trùng pha lỗng lần mơi trường TCG bổ sung 20% lịng đỏ trứng gà hàm lượng khác glycerol ethylene glycol để đạt hàm lượng 0, 4, 8% thể tích với glycerol 0, 6, 8, 10% thể tích với ethylene glycol đóng cọng rạ 0,25 ml với tổng số 100 triệu tinh trùng/cọng rạ Cọng rạ ủ 4oC trước hơ nitơ (cách mặt nitơ lỏng cm) 20 phút bảo quản nitơ lỏng -196oC Sau ngày bảo quản nitơ lỏng, cọng rạ rã đông 37oC 45 giây, đánh giá hoạt lực tinh trùng xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đơng II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chất lượng tinh nguyên chó Phú Quốc Khả sinh sản giống loài cá thể đực giống thể qua đặc tính sản xuất tinh dịch tinh trùng đặc tính chịu ảnh hưởng nhiều nhân tố, có giống, mùa vụ, tuổi đực giống… (Rita Payan cs., 2011) Chất lượng tinh dịch nhân 64 tố định đến chất lượng tinh bảo quản theo phương pháp khác nhau, có kỹ thuật đông lạnh tinh trùng (Harp cs., 1954; Linde-Forsberg, 1995; Rita Payan cs., 2011; Manuela Stănescu cs., 2012) Đánh giá chất lượng tinh dịch tinh nguyên công việc nhằm chọn nguyên liệu đầu vào cho thí nghiệm đơng lạnh tinh chó: nồng độ tinh trùng 300 triệu tinh trùng/ml, hoạt lực tinh 0,7 điểm, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 20% để đạt yêu cầu để đông lạnh tinh (Rita Payan cs., 2011; Manuela Stănescu cs., 2012) Kết xác định tiêu chất lượng tinh dịch cá thể chó đực giống Phú Quốc thí nghiệm (lặp lại lần khai thác/đực giống) trình bày bảng Kết thí nghiệm cho thấy, lượng tinh dịch trung bình thu nhận từ giai đoạn (giai đoạn giàu tinh) q trình phóng tinh chó đực giống Phú Quốc nghiên cứu 1,42 ± 0,13 ml, cụ thể đực giống Phú Quốc là: 1,30±0,09, 1,45±0,15, 1,43±0,08, 1,50±0,09, 1,47±0,19, 1,35±0,10 Trong nghiên cứu này, kết tiêu tinh trùng vận động tiến thẳng trung bình chó đực giống tốt Hoạt lực tinh nguyên trung bình đực giống Phú Quốc thí nghiệm đạt 0,86±0,05 điểm, cụ thể với chó đực giống Phú Quốc 0,85±0,05 điểm, chó đực giống Phú Quốc 0,88±0,04 điểm chó đực giống Phú Quốc 0,83±0,05 điểm, đực giống Phú Quốc 0,87±0,05, đực giống Phú Quốc 0,88±0,04 1,35±0,10 đực giống Phú Quốc Khi so sánh tiêu cá thể chó đực giống, thấy có sai khác có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) Với điều kiện chăm sóc ni dưỡng, sai khác tiêu nồng độ tinh trùng cá thể đực giống có nguyên nhân từ yếu tố di truyền đặc trưng cho cá thể “cơ địa” cá thể Theo kết trình bày bảng 1, ta thấy kết trung bình nồng độ tinh trùng chó đực giống nghiên cứu 604,7±85,0 triệu tinh trùng/ml, đực giống Phú Quốc 541,0±80,7; 642,0±74,3; 569,5±35,9; KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Bảng Chất lượng tinh nguyên chó Phú Quốc theo mùa Đực Đực Đực Đực Đực Đực Trung bình Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD Lượng xuất tinh (V, ml) 1,30 ±0,09a 1,45 ±0,15b 1,43 ±0,08b 1,50 ±0,09c 1,47 ±0,19bc 1,35 ±0,10a 1,42 ± 0,13 Hoạt lực tinh trùng (A, %) 0,85 ±0,05a 0,88 ±0,04a 0,83 ±0,05a 0,87 ±0,05a 0,88 ±0,04a 0,83 ±0,05a 0,86 ±0,05 Nồng độ tinh trùng (C, tỷ/ml) 456,7 ±22,8a 501,3 ±13,0a 477,7 ±16,3a 521,0 ±9,2b 442,7 ±27,2c 552,0 ±24,2d 496,9 ±38,9 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác (VAC, tỷ) 541,0 ±80,7ac 642,0 ±74,3b 569,5 ±35,9a 678,6 ±73,3cd 574,9 ±97,0a 622,0 ±80,5ad 604,7 ±85,0 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%) 10,7 ±0,5a 11,4 ±0,5b 10,0 ±0,6a 12,2 ±0,7b 10,7 ±0,4a 11,5 ±0,4b 11,1 ±0,9 Chỉ tiêu Ghi chú: Trên hàng, giá trị có chữ bên khác thể giống khơng có ý nghĩa thống kê với P